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1、ICS 11.020 c59 备案号:22759-2008引TS中华人民共和国卫生行业标准ws 290-2008 钩端螺旋体病诊断标准Diagnostic criteria for leptospirosis 2008-01-16发布2008-08-01实施e 4号主斗中华人民共和国卫生部发布q也罩ws 290-2008 目。吕根据中华人民共和国传染病防治法制定本标准。按照国家质检总局、国家标准委公告(2005年第146号)，GB15995-1995(钩端螺旋体病诊断标准及处理原则自本标准实施之日起废止。本标准的附录A是规范性附录，附录B是资料性附录。本标准由卫生部传染病标准专业委员会提出。本
2、标准由中华人民共和国卫生部批准。本标准起草单位:中国疾病预防控制中心传染病预防控制所、中国药品生物制品检定所、浙江大学医学院、上海交通大学医学院。本标准主要起草人:蒋秀高、秦进才、严杰、郭晓奎、鲁亮。ws 290-2008 钩端螺旋体病诊断标准1 范围本标准规定了钩端螺旋体病的诊断依据、诊断原则和鉴别诊断。本标准适用于全国各级医疗卫生机构及其工作人员对钩端螺旋体病的诊断、报告。2 术语和定义下列术语和定义适用于本标准。2.1 赫氏反应Herxheimer reaction 指钩端螺旋体病患者，在接受青霉素治疗时，由于大量菌体在体内裂解，释放大量的内毒素样物质，这些物质不仅可引起寒战、发抖、发热
3、，而且具有特异的致病作用，使原有的钩端螺旋体病的症状、体征加重。2.2 菌群更迭serogroup change 同一地区不同年度，引起钩端螺旋体病流行的菌株血清群发生改变。2.3 疫7.1polluted water 指受到致病性钩端螺旋体污染的江河、湖泊、池塘、水田、沟渠、地表水等水体。3 诊断侬据3.1 流行病学发病前ld30d接触疫水，或带菌动物尿液，或带菌动物血液。3.2 临床表现钩端螺旋体病根据临床表现主要分为:流感伤寒型、肺出血及肺弥漫性出血型、黄瘟出血型、肾型及脑膜脑炎型。其早期典型临床表现为:三症状(即寒热、酸痛、全身乏力)和三体征ce阳良红、腿痛、淋巴结肿大)。3.2.1
4、发热:起病急，可有畏寒。短期内体温可高达390C左右，常为弛张热，有时也可稽留热，少数间歇热。3.2.2 肌痛:全身肌痛，特别是排肠肌痛明显。3.2.3 乏力:全身乏力，特别是腿软症状明显。3.2.4 眼结膜充血:轻者主要在眼球结膜、外毗及上下穹隆部，重者除角膜周围外的全球结膜血管扩张呈网状，无分泌物，无疼痛感，不畏光。3.2.5 雕肠肌压痛:双侧排肠肌压痛，重者拒按。3.2.6 淋巴结肿大:主要为表浅淋巴结及股淋巴结，一般为lcm2cm，质偏软，有压痛，元化服。3.3 实验室检测3.3.1 从血液、脑脊液或尿液中分离出钩端螺旋体，见附录A.l。3.3.2 从血液、尿液或脑脊液中检测出钩端螺旋
5、体核酸，见附录A.2。3.3.3 患者恢复期血清中钩端螺旋体抗体效价较早期血清有4倍或4倍以上升高，或单份血清抗体效价二三1:400，见附录A.3。1 ws 290-2008 4 诊断原则根据患者的流行病学、临床表现和实验室检查结果进行综合判断，病例确诊需要实验室证据。5诊断5.1 疑似病例符合下列情况之一者即可诊断:5.1.1 具备3.1加3.2.1;5.1.2 具备3.1加3.2.2;5.1.3 具备3.1加3.2.3。5.2 临床诊断病例符合下列情况之一者e、5.2.1 疑似病例加3.2.5.2.2 疑似病例加3.5.2.3 疑似病例加5.3 实验室确诊5.3.1 5.3.2 疑似病5.
6、3.3 疑似病?6 鉴别诊断钩端螺旋2 应注意与流行性ws 290-2008 附录A(规范性附录)钩端螺旋体病的病原学和血清学诊断方法A.1 钩端螺旋体直接镜检、分离培养及分群、分型A.1.1 患者血液的直接镜检A.1.1.1 取早期患者血液一滴，加蒸馆水_i端螺旋体。A.1.1.2 取早期患者静脉血略显白色的悬液，置于载玻溶解，在暗视野显微镜下检查有元活动的钩A.1.2.1 患者基中，每管按培下观察有无钩吨体生长方作阴以镜酸L物碳中阳台FR管即时心吸取者离后M患菌勒出给中隔氢铀2g钮，同A.1.2.3 动物进行发病观察和A.1.3 病原体分飞、应用分群血清主定菌型。A.2.2.1 试剂配制A
7、.2.2.1.1 血液消化液:10mrnol/L Tris-HCl、10mrnol/LEDTA、50mmol/LNaCl、2%SDS，临用前每毫升加0.3mg蛋白酶K。A.2.2.1.2 组织裂解液:10mmol/L Tris-HCl、25mrnol/LEDTA、100mrnol/LNaCl、0.05%SDS，临用前每毫升加O.lmg蛋白酶K。A.2.2.2 操作步骤3 ws 290-2008 A.2.2.2.1 血液标本预处理:0.2mL全血加0.5mL血液消化液，置560C水浴作用1h，12OOOr/min离心15min，取上清备用。A.2.2.2.2 动物组织标本预处理:动物组织标本用匀
8、浆器研磨成组织匀浆，加1mL组织裂解液置3 7C水浴过夜，以12000r/min离心20min，取上清液备用。A.2.3 钩端螺旋体DNA提取(Bm法)A.2.3.1 试剂配制裂解液CL6):GuSCN C异硫氨酸肌)120g、O.1mol/L Tris-HCl pH6.4 100mL、O.2mol/L EDT A 22rnL，混合后用NaOH调pH至8.0，加TritonX-100 2.6g;DiatomC硅藻):三蒸水50mL、32%CW/V)HC1500L、Celite10g，分装小玻璃瓶、高压灭菌;缓冲液CL2):GuSCN 120g、O.1mol/L Tris-HCl pH6.4 1
9、00mL，置连续振荡的600C-650C水浴促使GuSCN溶解。A.2.3.2 操作步骤取样品液(菌液/血清/血液预处理液/组织预处理液)o.1mL;加裂解液CL6)0.9mL;加硅藻CDiatom)40L;充分混悬，立即以12000r/min离心5min，沉淀二氧化硅DNA复合物;用0.5mL缓冲液洗涤复合物，以12000r/min离心5min，洗涤2次;用O.5mL 70%乙醇洗涤复合物，以12000r/min沉淀离心5min，洗涤2次;用0.5mL丙酬洗涤复合物，以12000r/min离心5min，洗涤1次;置650C7j(浴中干燥10min;加70L三蒸水，充分混合10min;以120
10、00r/min离心5min;吸取上清50L于另一小离心管中才日10mg/mL蛋白酶K2.5L，置560C水浴作用10min;置1000C10min灭活蛋白酶K，一200C保存或直接用作PCR模板。A.2.4 反应体系25L体积PCR反应体系包括10XPCR缓冲液2.5L、2.5mmol/L dNTP 2L、25mol/L引物1和引物2各1L、25mmol/LMgClz 1.5L、模板DNA5J-lL、TaqDNA聚合酶O.5L(2个活性单位)、三蒸水11.5L。依次加人以上试剂后加30L灭菌石蜡油，若PCR仪有顶盖加热功能则免加石蜡油。A.2.5 热循环程序950C预变性5min;940C60
11、s,550C 60s,720C 90s，35个循环;720C延伸10min。A.2.6 扩增产物电泳检测用0.5XTBE电泳缓冲液配制1%琼脂糖凝胶，加热溶解后加人漠化乙链CEB)，也可在电泳结束后，将凝胶放人漠化乙链溶液中染色。由于澳化乙键是强诱变剂，接触被澳化乙链污染的物品应戴一次性手套。也可采用澳化乙链替代品，如GoldViewDNA染料。在PCR产物中加人适量澳酣蓝溶液，混匀后取5L10L上样，电泳采用0.5XTBE缓冲液，于40V恒流电泳2h。A.2.7 结果判定在紫外透射仪上观察，或照相记录结果。可见阳性扩增产物分子大小为285bp的DNA条带。实验中设阴性对照(不加DNA模板)和
12、阳性对照(加人已知阳性DNA模板)，若阴性对照出现阳性或阳性对照出现阴性结果，则本次实验无效。A.3 血清学诊断方法A.3.1 显微镜凝集试验(MAT)A.3.1.1 抗原的选择和制备将我国15群15型钩端螺旋体代表株接种于Korthof或EMJH等适宜培养基中，280C培养5d7d，暗视野显微镜检查，每400倍视野下不少于100200条，运动活泼并无自凝者可作为显凝抗原。A.3.1.2 操作方法患者血清560C水浴灭活30min后，用生理盐水以1:50C早期患者血清)或1:100C恢复期患者血4 ws 290-2008 清)和1:400两个稀释度作定性试验。两个稀释度血清以及作为对照用的生理
13、盐水各取50L，分别加人反应板每列的3个孔中。分别取15个代表株钩端螺旋体的培养液50L加人上述两个稀释度血清及对照生理盐水中。摇匀后370C孵育1h。用接种环挑取反应液及对照，放置载玻片上暗视野显微镜下观察凝集情况。若1:100和1:400稀释血清与某一群钩端螺旋体抗原发生凝集，需进一步稀释该血清再与该群钩端螺旋体抗原进行显凝试验，以测定其凝集滴度。凝集滴度按原血清稀释倍数X2计算。A.3.1.3 终点凝集滴度的判定以出现十+凝集(即视野中50%钩端螺旋体被凝集)的血清最高稀释度作为终点凝集滴度。A.3.2 间接酶联免疫吸附试验(间接ELISA)A.3.2.1 试剂配制A.3.2.1.1 P
14、BS缓冲液(10X):NaCl 8饨，Na2HP04 12 H20 11.3栓，KH2P042g，加蒸馆水至1000mL，1200C高压20mino A.3.2.1.2 PBS牛奶溶液:临用前加5%脱脂奶粉到1XPBS缓冲液中，可加硫柳柔(终浓度为0.2%)防止污染。A.3.2.1.3 底物贮存液:将O.219g ABTS 2，2七isazineC 3-ethyl-benzyl-thiazoline 6-Sl印honicacid)溶解到10mL蒸馆水中。(注:ABTS有强致癌作用，应小心操作。)A.3.2.1.4底物缓冲液:醋酸纳13.6g、NaH2P046.蚀，加蒸馆水至终体积1OOOmL,
15、1l0oC高压20min。A.3.2.1.5 过氧化氢(H202)稀释液(必须临用前准备):加200L的30%Ho02到7mL蒸馆水中。A.3.2.2 抗原制备用培养7d的双曲钩端螺旋体培养物CL.biflexa serovar patoc)，每毫升培养物中含108109条钩端螺旋体(暗视野显微镜检查)，加福尔马林至终浓度为0.2%，室温作用3h曲，水浴煮沸30min，调pH至9.6，以10000Xg离心30mi口，上清即为抗原。A.3.2.3 抗原包被在酶标板每孔加入150L抗原，置3 7C3d时，直至完全蒸发。抗原板避光放于室温不透气的盒子，或用塑料袋封口保存，抗原可稳定1年。A.3.2.
16、4 酶标板封闭临用前用PBS-milk洗板3次，并在加入PBS-milk后置40C过夜或37C血，封闭非特异性结合位点。倒掉孔中液体，在滤纸上拍干。A.3.2.5 操作步骤A.3.2.5.1 加稀释血清每份患者血清用PBS-milk按1/400稀释两份进行检测。酶标板预留8孔加入从1/400到1/51200 稀释的阳性血清，2孔加人1/400稀释的阳性果值血清，1孔加人抗原对照，1孔加人酶结合物对照。加人稀释血清后，酶标板放37C1h。A.3.2.5.2 加酶结合物:倾出孔中液体，用1XPBS-milk洗板3次。按工作浓度稀释酶结合物，每孔加人酶结合物150L，3 7C孵育1h。A.3.2.5
17、.3 显色反应:倾出孔中液体，用1XPBSmilk洗板3次。临用前配制底物液:lmLABTS贮存液、20mL底物缓冲液、200L双氧水稀释液。每孔加人150L底物，轻轻振荡酶标板，室温显色10minC注意观察颜色变化)，每孔加50LlO%SDS终止反应。A.3.2.6 结果分析用酶标仪在405nm波长测定各孔OD值2加人底物液后溶液显绿色表明样本中有钩端螺旋体抗体。用系列稀释的阳性血清的OD值制作标准曲线，根据标准曲线计算出每个患者血清的抗体滴度。将1/400稀释的阳性界值血清的OD值在曲线作一标记，作为待检血清的阳性判定界值。5 WS 290-2008 A.4 培养基制备方法A.4.1 Ko
18、rthof培养基制备方法蛋白陈(可用膜蛋白陈代替)400mg、NaCl700mg、KC120mg、NaHC0310mg、KH2P04120mg、Na2 HP04 12H20 1.109g，加蒸馆水至500mL。煮沸20min，用滤纸过滤，校正pH值为7.2，分装于烧瓶内，每瓶100mL，15磅高压30min灭菌。临用前每瓶无菌操作加人8mL10mL经560C30min灭活的无菌正常兔血清。然后将其置午37C孵箱中48h，作元菌试验，如有杂菌生长，弃去。A.4.2 EMJH培养基的制备A.4.2.1 贮存渡A.4.2.1.1 氧化钙/氧化镶贮存液:、贮存于200C冰箱。A.4.2.1.2 硫酸铸
19、贮存液:、A.4.2.1.3 硫酸铜贮存主A.4.2.1.4 A.4.2.1.5 A.4.2.1.6 A.4.2.1.7 A.4.2.1.8 A.4.2.2 BSA营生、溶解20g牛贮存液，分别加入温-80贮存液、2NaOH调pH至A.4.2.3 缓冲盐阳弩A.4.2.4 完整E缓冲盐溶液180 A.4.2.5 EMJH培养将不锈钢滤器清洗干电滤器上，拧紧螺母将其固定.!A.4.2.6 EMJH培养基质量黯A.4.2.6.1 无菌试验:培养基援私回努踵陪罩情展制眷养句古，如有杂20各19溶解到30mL蒸馆水中，从冰箱中取出存液、25mL吐mL，用1mol/LmL氯化镀贮存A.4.2.6.2 检
20、查有无腐生性钩端螺黯也或其他杂菌污染:培步毒分别置300C培养1周，3 7C培养1周，室温培养2周，观察有无混浊，显微镜检查为酵刊赞壁韧哇长，弃去。A.4.2.6.3 生长试验:接种1/10体积钩端螺旋体培养物，观察生长情况。A.4.2.6.4 营养添加剂:如加入兔血清、胎牛血清增加营养，必须先进行MAT试验，MAT检测阴性的血清才能使用。6 ws 290一2008附录B(资料性附录)钩端螺旋体病的鉴别诊断B.1.1 流行性感冒主要在冬春季流行，呈呼吸道传染病的流行特征，与疫水接触无关。临床表现以呼吸道症状明显，全身症状一般较轻，白细胞计数常偏低。病原学和血清学检查对于鉴别诊断具有重要意义。B
21、.1.2 流行性出血热4 早期症状常有高热、头痛、全身腰痛(病在同一地区流行时容易误字约草肿，无腹股沟淋巴结肿痛;低，以后增高;尿液有大B.1.3 登革热和登革本病常在钩端螺有肌肉和关节痛，眼症，肝脾肿大，尿中止颈、上胸皮肤潮红补体结合试验及-，B.1.5 流行性乙型n四_/O.:7钩端螺旋体病炎在临床上需要鉴别肿痛和咯血较多见;脯有持续高热、剧烈头疼7 CON-oNm悻国华人民共和卫生行业标准钩端螺旋体病诊断标准WS 290一2008中印张O.75 2008年5月第1版第1次印刷9毛出版发行:人民卫生出版社(中继线010-67616688)地址:北京市丰台区方庄芳群园3区3号楼邮编100078网址http:/E-mail: 购书热线010-67605754010-65264830 印刷:北京新丰印刷厂经销:新华书店开本880X1230 字数22千字版次2008年5月第1版书号14117 192 定价7.00元版权所有，僵权必究，打击盗版举报电话010-87613394(凡属印装质量问题请与本社销售部联系退换)1/16|RM MMMM8 川剧町mm川OMM川叫川MMM川同U刷刷刷刷刷刷刷nJ4川川UUMMMM 剧剧剧mmmm剧剧剧呵正川川川川川川nb川川川川W