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1、ICS 65.100 B17 NY 中华人民共和国农业行业标准NY/T 3279.1一2018病毒微生物农药吉宿银纹夜峨核型多角体病毒第1部分:茵宿银纹夜峨核型多角体病毒母药Viral-based insecticides-Autographa californica nucleopolyhedrovirus(AcNPV)一Part 1:Autographa cal，扩ornicanucleopolyhedrovirus technical concentrate(TK)2018-07-27发布2018-12一01实施中华人民共和国农业农村部发布NY/T 3279.1-2018 目。吕NY/T
2、 3279(病毒微生物农药盲宿银纹夜峨核型多角体病毒分为2个部分:一一第1部分:首宿银纹夜娥核型多角体病毒母药;一一第2部分:首稽银纹夜峨核型多角体病毒悬浮剂。本部分为NY/T3279的第1部分。本部分按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。本部分由农业农村部种植业管理司提出并归口。本部分起草单位:农业农村部农药检定所、中国科学院动物研究所、河南省济源白云实业有限公司。本部分主要起草人:秦启联、杨峻、张寰、王晓军、方分分、张继红、郭明程。I NY/T 3279.1-2018 范围病毒微生物农药茵蓓银纹夜峨核型多角体病毒第1部分:茵蓓银纹夜峨核型多角体病毒母药本部分规定了茵稽银纹夜峨核品的检
3、验与验收以及标志、标签、包装、储运、本部分适用于2 下列文件对件。凡是不注日期GB/T 1601 GB/T 1604 GB/T 16 3 3.1 GB 3796 GB 4789.GB 6682 GB/T 81 GB/T 1 GB 20813 下列术语和茵蓓银纹夜峨核caJncentrate(TK)以病毒包涵体为主要成黯献含噩菇黠纹砸酶胃病毒，温跻况还会包含伴随病毒扩增而产生的宿主昆虫或细胞3.2 病毒包涵体polyhedral inclusion 病毒水平传播的主要载体形式，其结构特征是病毒粒子包埋于蛋白质基质的多角体中。3.3 生测效价比potency ratio 根据药物的药理和对生物体的
4、作用设计试验，比较样品、标准品引起的生物反应，测定药物效价或其生物学活性。3.4 菌落形成单位colony fonning units(CFU)由单个菌体或聚集成团的多个菌体在固体培养基上生长繁殖所形成的集落。指在琼脂平板上经过一定温度和时间培养后形成的每一个菌落，是计算细菌或霉菌数目的单位。1 NY/T 3279.1一20183.5 杂菌菌落总数number of microbial contaminants 将茵稽银纹夜娥核型多角体病毒母药样品稀释后涂布在琼脂营养培养基上，所得到的微生物(真菌和细菌)菌落数之和。4 要求4.1 外观通常为灰白色或褐色均匀粉状物，无可见机械杂质，不应有结块。
5、或者灰白色或褐色液体，存放过程中可能出现沉淀，经搅动能恢复原状，不应有结块。4.2 指标茵稽银纹夜峨核型多角体病毒母药还应符合表1的要求。表1茵蓓银纹夜峨核型多角体病毒母药控制项目指标项目指标病毒包涵体数量.PIB/g或PIB/mL注100亿生测效价比(标准品LCso/待测样品LCso).%二三80.0杂茵茵落总数.CFU/mLl.OX107 pH 5.0-7.5(固体)干燥减量.%5.0 细度(通过75m标准筛).%二三95.05 试验方法5.1-般规定除非另有说明，本方法所用试剂均为分析纯，所述溶液均为水溶液，试验用水为GB/T6682中规定的三级水。5.2 抽样按照GB/T1605中固体
6、制剂采样，液体制剂采样方法进行。用随机数表法确定抽样的包装件，最终抽样量应不少于200g(mL)。5.3 毒种定性鉴别5.3.1 病毒毒种的分子鉴定盲稽银纹夜娥核型多角体病毒毒种的鉴定，采用PCR扩增及DNA测序分子鉴定的方法。通过提取试样中病毒DNA作为模板，用AcNPV的ie-1基因、helicase基因和g64基因的特异性引物分别进行PCR扩增反应，琼脂糖凝胶电泳检测。当PCR扩增片段大小约为1kb或300bp时，回收扩增片段，并克隆到T载体上，用M13通用引物对克隆后的PCR产物进行测序，将测序结果分别与AcNPV(E2株)的ie-1基因，helicase基因及g64基因进行比对分析，
7、两者的序列一致性均应该大于98%，即认定试样中含有茵稽银纹夜峨核型多角体病毒。盲稽银纹夜峨核型多角体病毒有效成分描述参见附录A。盲宿银纹夜娥核型多角体病毒毒种的分子鉴定方法按照附录B的规定。5.3.2 病毒毒种的生物测定鉴别生物测定的方法作为茵宿银纹夜峨核型多角体病毒毒种分子鉴定的补充。分别对粉纹夜峨、甜菜夜峨和家蚕3种昆虫幼虫进行生物测定。粉纹夜娥和甜菜夜峨感病症状:虫体体色粉白，体节膨大，行动缓慢，甚至液化而亡，其感病特征非常明显。而家蚕的校正死亡率应小于20%，依此可以确定试样中NY/T 3279.1-2018 的病毒为首宿银纹夜峨核型多角体病毒。病毒毒种生物测定鉴别的方法参见附录C。5
8、.4 病毒包洒体的定量检测5.4.1 血球计数极法5.4.1.1 方法提要称取少量的病毒试样，用定量的蒸馆水稀释成水悬浮液，并稀释至适当倍数后，滴加在血球计数板上，在光学显微镜下计数。根据血球计数板上病毒鱼温华国数量以及稀释倍数，计算出单位质量(体积)病毒的数量。2个计、，Ti，、.X1 一一百宿银纹.亥型多事有匾噩噩噩包涵拖在营字字写每克g)或PIB每毫升CPIB/mU i A-2个计数池各B 样品稀释倍数，4XI06-1 rnL母液含有80 一一计数小方格的个数，单位为个。CmL/g);(个/mU;5.4.1.5 允许误差病毒包涵体含量2次平行测定结果之差，应不大于20%，取其算术平均值作
9、为测定结果。5.4.2 生测效价比的测定病毒试样用蒸馆水制成待测的病毒悬浮液，均匀涂布在人工饲料上，晾干后饲喂甜菜夜峨幼虫，重复3次。试验过程中供试昆虫采取单头饲养方式，环境温度控制在C26:1:l)OC，湿度40%以上。统计第3d第7d幼虫的死亡情况，计算其校正死亡率。仪器设备、试剂材料、测定步骤等具体按照附录D的规定执行。5.5 杂菌菌落总数的测定3 NY/T 3279.1-2018 按GB4789.2的规定执行。5.6 pH的测定按GB/T1601的规定执行。5.7 干燥减量的测定5.7.1 方法提要按干燥减量法测定，即试样经加热后，计算失去的水分占称取试样质量的百分比。5.7.2 仪器
10、、设备分析天平，精确至0.001g。电热恒温干燥箱，控温范围500C200oC，误差士20C。扁形称量瓶，直径40mm。干燥器。5.7.3 试验步骤将称量瓶在005+2)OC电热恒温干燥箱内烘至恒重(精确至O.001 g)。称取试样10.0 g(精确至O.001 g)置于预先称重的称量瓶内，放人005士2)OC电热恒温干燥箱内 干燥，1h后取出，在干燥器中冷却至室温，称重。5.7.4 测定结果干燥减量Xz按式(2)计算。式中:Xz=旦二旦!X 100(2)m Xz一一干燥减量，单位为百分率(%);m一一试样的质量，单位为克(g);mj一一干燥试样的质量，单位为克(g)。5.7.5 允许误差2次
11、平行测定结果之差，应不大于0.5%，取其算术平均值作为测定结果。5.8 细度的测定按GB/T16150-1995中2.2的规定执行。6 产品的检验与验收应符合GB/T1604的规定。极限数值处理采用GB/T8170中的修约值比较法。7 标志、标签、包装、储运、安全和保质期7.1 标志、标签应符合GB3796和GB20813中的规定，注明低毒，防曝晒防高温等标志。7.2 包装应符合GB3796和GB20813中的有关规定。7.3 储运百宿银纹夜峨核型多角体病毒母药包装件，应在100C以下的避光环境中储运。储运过程中应有遮避装置，严防日晒和潮湿。7.4 安全在使用说明书或包装标签上，除有相应的毒性
12、标志外，还应有毒性说明、中毒症状、解毒方法和急救措施。NY/T 3279.1-2018 7.5 保质期在规定储运条件下，茵宿银纹夜峨核型多角体病毒母药的质量保证期从生产日期算起为2年。2年保质期内，生测效价比和病毒包涵体数量不低于4.2中的指标。5 NY/T 3279.1-2018 附录A(资料性附录)茵宿银纹夜峨核型多角体病毒有效成分描述A.1 中文通用名称茵稽银纹夜峨核型多角体病毒。A.2 拉丁文学名Autograha californica Nucleopolyhedrovirus.简称AcNPV。A.3 生物学分类杆状病毒科、Alpha杆状病毒属。A.4 生物学特性A.4.1 形态结构
13、:基本毒粒为杆状，毒粒有囊膜，囊膜内含有一个或多个杆状的核衣壳，核衣壳中含有病毒基因组。病毒颗粒被包藏在蛋白晶体内形成包涵体，在NPV中称为多角体。光学显微镜下观察，病毒多角体呈强折光性的颗粒;电子显微镜观察，多角体呈多面体形状，直径O.5m15m 之间。A.4.2 分子结构:杆状病毒基因组为双链、环状DNA分子。病毒DNA与一种碱性蛋白密切联结。A.4.3 包涵体生物学特征:包涵体可以保护病毒颗粒，包涵体非常稳定，对细菌、热和许多化学物质包括低pH有抵抗作用，使其在土壤中可以存活多年。A.5 宿主范围及传播机理本产品系通过自然界中分离首宿银纹夜峨核型多角体病毒毒株，使其在活体宿主昆虫或细胞中
14、扩增、分离纯化而成。产品宿主范围较其他核型多角体病毒广，对棉铃虫、甜菜夜峨、粉纹夜峨等鳞翅目昆虫有特效，而对其他生物安全，特别对人类和家畜等脊椎动物及鸟类无害。本品低毒。病毒包涵体经害虫取食叶片进入目标害虫体内，在虫体内大量复制增殖扩散，急剧吞噬消耗虫体组织，导致害虫染病后组织细胞液化而亡，并通过死亡虫体的体液、粪便在害虫之间继续传播，形成流行性昆虫病毒病，药效持久。A.6 有效成分主要存在形态首宿银纹夜峨核型多角体病毒包涵体。A.7 生物活性杀虫。A.8 溶解性不榕于水，溶于弱碱。6 NY/T 3279.1-2018 A.9 稳定性在4.C以下可以长期保存，加工过程中处理温度不得高于60.C
15、，在弱碱溶液、lOO.C以上高温条件下极快丧失生物活性。见光易丧失生物活性。7 NY/T 3279.1-2018 附录B(规范性附录)茵蓓银纹夜蜡核型多角体病毒毒种的分子鉴定方法B.1 方法提要licase基因和gp64基并克隆到T载体上，8 Taq酶。澳化乙链。灭菌双蒸水。T载体。抗生素。大肠杆菌感受态细胞。IPTG。X-gal。LB培养液。PCR引物:ie-1基因上游引物:TGCGGCAGCTTCAAACTT;ie-1基因下游引物:CATGCTGCCGTCCTCCTTC。helicase基因上游引物:CGGCGAGCAGCGAAAA TG;helicase基因下游引物:GATCCCGATA
16、CCGTTGACCGACACog判4基因上游引物:CCCGCCCAAAGACAGAGTAATG;(AcNPV)的ie-1基因、he检测后，回收扩增片段.2HzO、加水至lL。gp64基因下游引物:CACACGCGGTTTTGGTTG。B.3 仪器、设备分析天平:精确到O.000 1 go 微量移液器。高速离心机:最高转速10000r/min。振荡器。恒温水浴。紫外分光光度计。PCR仪。电泳仪。水平电泳槽。凝胶成像系统。生化培养箱。恒温摇床。DNAMANC6.0)软件。离心管。量筒。容量瓶。培养皿。试管。B.4 试验步骤B.4.1 AcNPV病毒核酸制备NY/T 3279.1-2018 取试样适
17、量，加人碱解液750L，3 7C，1h;加人盐酸调pH至8.0，加人SDS至终浓度为0.5%，加入蛋白酶K至终浓度O.25g/L，370C 2 h,650C 2 h;加人等量氯仿异戊醇混合物(氯仿:异戊醇=24:1，体积比)抽提1次，10000r/min,5 min;轻轻吸取上层水相，置于新的离心管中，加人等量氯仿，10000 r/min,5 min，取上层水相转入新管中，加入2倍体积元水乙醇混匀后，10000 r/min,10 min;弃去上清液，沉淀用70%乙醇洗涤，10000r/min离心10min;再次去掉上清液，让沉淀的DNA在室温下干燥;加人TE缓冲液100L溶解DNA，从而获得试
18、样DNA，保存于一200C。B.4.2 PCR扩增及检测以提取试样病毒DNA10 ng50 ng为模板，PCR扩增AcNPV病毒ie-1基因、helicase基因和gp64基因片段。反应组分为:10倍反应缓冲液5L;2.5 mmol/L dNTPs 4L;上游引物1LC10卢nol/L);下游引物1LC10mol/L);DNA模板1L;Taq酶O.5L，灭菌双蒸水补充总体积至50L。PCR反应条件:950C,5 min预变性;然后进行30个循环:940C30 s,550C 30 s,720C 60 s;最后720C5 min延伸。用1%的琼脂糖凝胶电泳，漠化乙链溶液染色后，利用凝胶成像系统观察
19、DNA条带。B.4.3 PCR产物的T载体克隆和测序首先，PCR产物与T载体按比例混合，加人连接酶混合反应后，转化至大肠杆菌感受态细胞中。然后，均匀地涂在含有与T载体相应的抗生素、IPTG、X-gal的琼脂平板上，3 7C培养箱中过夜后，挑出白色菌落，加人至5mL含有抗生素的液体LB培养基中。最后，370C恒温摇床中振荡培养过夜后，取菌液送测序公司，使用M13通用引物对其进行测序。B.4.4 序列比对ie-1基因、helicase基因和g64基因分别扩增获得基因片段大小分别为1222bp、1126bp和309NY/T 3279.1-2018 bp。使用DNAMAN(6.0)软件对所测到序列分别
20、与AcNPV(E2株)的ie-1基因、helicse基因及gp64基因进行比对分析。B.4.4.1 本实验中扩增的AcNPV的ie-1基因序列(1222 bp)10 TGCGGCAGCTTCAAACTTTTTGGCAAGCGTCAACTCGl寸AACTGATAATGATTTAGTGGAATGTTTGCTCAAGACCACTGATAATCTCGAAGAAGCAGTTAGTTCTGCTTATTAT TCGGAATCCCTTGAGCAGCCTGTTGTGGAGCAACCATCGCCCAGTTCTGCTTATCATGC GGAATCTTTTGAGCATTCTGCTGGTGTGAACCAACCATCGG
21、CAACTGGAACTAAACGG CA!TAATC CCGGAGTCAATTTGGTTTT CAACGGCAAACATTATCAAATTGTAAAGAAAGAGGATGACCTATTCAAATTGACCAAA AGCAATTGTTACAAGTTGAGCAACATAAAATTTAACAATTGGAAATACTTGTACTTGAC AACGCACGGTGTGTACAACGTGTTCACCAACAGCTTTCATTCGAGCTGTCCATTTTTGT TGGGCACCACGTTGCCGCAGACATTCAAGAAGCCCACCGACGAAAAGTArTGCCCG AGGACGCGTTTAATTAC
22、ATGCTATCTACTAGCGCCGACGAGCTCAGCATTTATAGAACTT ATCACATCGCCAAAATGTGCCGAGATGTAAAAATGCTAAAAACTAACACGGCCATAGTT AACTACATGGGCAATTGCAACACATGCCAAGCCGATATGCGAGTCGCGTTAAACAACC TGTTTCGCGATTTGTGGAATTTGGACGATGAAAATCTGATTACGCTCGCTCTGTACGTA AACAAGAACAGGGTTTCCGACATGTTGCACAACCTAAAATGCAAACCGTGTCGGTCA ACGGTATCGGG.AfC。NY/
23、T 3279.1-2018 B.4.4.3 本实验中扩增的AcNPV的gp64基因序列(309bp)CCCGCCCAAAGACAGAGTAATGTTTTTGGACACGGTTACCACCAGCGACGTGAGC AGCAAATACGAAGAATACATAAACTGCATTGTGAGCAACCGTACCGTTGAAAACGAGT GCATGTTTTTAGCCAACATGATGAACGTGCTCAACGACAAATTGGACGACGCAGCAGC TTTGGCCAAGATGCTGGAGCGAATAGTAAAACAAACGCGAAAGAACAAACTCAACAT CTCCAACACGG1寸ATAGA
24、CGACGACACGCTGCTAACGGAAATGAAAAAATTAACACAAACTTTATACAACCAAAACCGCGTGT。B.4.5 结果判定试样与AcNPVCE2株的ie-1基因、helicase基因和gp64基因的序列一致性均大于98%，即可认定为相同病毒。11 NY/T 3279.1-2018 C.1 试剂和材料C.2 电分析天平:恒温培养箱。振荡器。微波炉。磨口三角瓶:250mL 养虫皿:90mm。养虫盒。小烧杯:50mL。大烧杯:500mL。附录C(资料性附录)盲宿银纹夜峨核型多角体病毒毒种的生物测定鉴别微量移液器:1LlmL。C.3 测定步骤C.3.1 人工饲料的配制g、
25、KClO.2 g，于40C保存。按照表C.1的人工饲料配方，将A组分放入锅中蒸15min，D组分加热煮沸直至琼脂完全溶化，待D组分冷却至700C左右时加入B组分搅拌至完全溶解，再冷却至500C时加人A组分搅拌均匀，最后加入C组分混合均匀，置550C水浴锅中保温备用。NY/T 3279.1-2018 表C.l人工饲料的配方A组B组C组D组大豆粉75g 酵母粉30g 对涯基苯甲酸甲酶2g蒸馆水700mL玉米粉75g 山梨酸19琼脂14g 番茄酱198g 维生素C3g甲醒1mL C.3.2 感染液的配制将标样摇匀后，准确吸取100L置于10mL离心管中，加PBS缓冲液9.9mL，在振荡器上振荡lml
26、n，取该悬浮液1mL，加PBS缓冲液定容于100mL容量瓶中，制成标样母液(茵稽银纹夜峨核型多角体病毒包涵体浓度为2.OX108 Pffi/mL)。使用微量移液器吸取(或称取精确至0.2mg)适量试样，如上法制成试样母液。将样品和标准品母液用水以一定的倍数等比稀释，每个样品和标准品至少各稀释5个浓度(最低1X107Pffi/mL)，并设蒸馆水作对照。C.3.3 饲料和感染液的混合待凝固的人工饲料迅速倒人养虫盒，凝固后倒人15mL待测药液，1min后倒出，晾干后接人试虫，每处理3次重复，每重复30头试虫。C.3.4 接虫感染将处理的试虫置于环境温度为C26土1)OC、湿度为40%以上、光周期为L
27、:D=06:8)h条件下饲养。C.3.5 检查和统计分析判断死虫的标准是以细签轻轻触动虫体，无任何反应者判为死亡。计算标准品和样品各浓度的供试昆虫死亡率，计算死亡率及校正死亡率Wj。空白对照死亡率10%以下需要校正，大于10%则试验结果无效。校正死亡率按式cc.1)计算。T-C 一一一一X100 cc.1)1-C 式中:Wj一一校正死亡率，单位为百分率c%);T一一药剂处理死亡率，单位为百分率C%);C一一空白对照死亡率，单位为百分率c%)。C.3.6 允许差2次平行测定结果相对结果之差，不得超过20%。13 NY/T 3279.1-2018 附录D规范性附录)生测效价比(标准晶LCso/待测
28、样品LCso)的测定D.1 试剂和材料标准品:茵稽银纹夜峨核型多角体病毒CAutogra户hacalifornica Nucleopolyhedrovirus),2.0 X 101 2 PIB/mL。供试昆虫:甜菜夜峨CSpodo户teraexzg)，使用人工饲料饲养，要求试虫为连续饲养5代以上、生理状态一致的3龄初期幼虫。酵母粉。大豆粉，烤熟后磨碎过60目筛。大麦粉，过60目筛。番茄酱。玉米粉。维生素C.10%甲醒溶液。山梨酸。对起基苯甲酸甲醋。琼脂粉:凝胶强度大于300g/cm2。PBS缓冲液(0.01mol/L,pH 7.4):称取NaC18.0 g、Na2HP04 1.44 g、KH2
29、P04 O.24 g、KClO.2 g 溶于800mL蒸馆水，用1mmol/L盐酸调节溶液的pH至7.4，最后加蒸馆水定容至1L，于4.C保存。D.2 仪器、设备电动搅拌器:元级调速，1川OOr旷/min60OOr旷/mi口m分析天平:精确到0.0001g。恒温培养箱。振荡器。微波炉。磨口 三角瓶:250mL，具塞。养虫皿:90mm。养虫盒。小烧杯:50mL。大烧杯:500mL。微量移液器:1LlmL。D.3 测定步骤D.3.1 人工饲料的配制按照表D.1的人工饲料配方，将A组分放人锅中蒸15min，D组分加热煮沸直至琼脂完全溶化，待D组分冷却至70.C左右时加人B组分搅拌至完全溶解，再冷却至
30、50.C时加入A组分搅拌均匀，最后加NY/T 3279.1一2018人C组分混合均匀，置SSoc水浴锅中保温备用。表。1人工饲料的配方A组B组C组D组大豆粉7 5g 酵母粉30g 对经基苯甲酸甲酶2g蒸馆水700mL玉米粉7 5g 山梨酸19琼脂14g 番茄酱198g 维生素C3g甲隆1mLD.3.2 感染液的配制将标样摇匀后，准确吸取100L置于10mL离心管中，加PBS缓冲液9.9mL，在振荡器上振荡1mln，取该悬浮液1mL，加PBS缓冲液定容于100mL容量瓶中，制成标样母液(茵宿银纹夜峨核型多角体病毒包涵体浓度为2.0 X 108 PIB/mL)。使用微量移液器吸取(或称取精确至0.
31、2mg)适量试样，如上法制成试样母液。将样品和标准品母液用水以一定的倍数等比稀释，每个样品和标准品至少各稀释5个浓度(最低1X107PIB/mL)，并设蒸馆水作对照。D.3.3 饲料和感染液的混合待凝固的人工饲料迅速倒人养虫盒，凝固后倒入lSmL待测药液，1min后倒出，晾干后接人试虫，每处理3次重复，每重复30头试虫。D.3.4 接虫感染将试虫置于环境温度为(26+1)OC、湿度为40%以上、光周期为L:D=(16:8)h条件下饲养。D.3.5 检查和统计分析判断死虫的标准是以细签轻轻触动虫体，无任何反应者判为死亡。计算标准品和样品各浓度的供试昆虫死亡率，计算死亡率及校正死亡率W10空白对照
32、死亡率10%以下需要校正，大于10%则试验结果元效。校正死亡率按式(C.1)计算。将感染液各浓度换算成对数值，校正死亡率转换成死亡几率值，用最小二乘法分别求出标准品LCso值和待测样品LCso值。D.3.6 计算待测样品的生测效价比(标准品LCso/待测样品LCso)W2按式(0.1)计算。W2=号X100.(D.1)式中:W2一一待测样品的生测效价比;Z 一一标准品LC50值;Y一一待测样品LCso值。D.3.7 允许差2次平行测定结果之差，不得超过20%。15 FON|-RBH问Z中华人民共和国农业行业标准病毒微生物农药盲宿银纹夜峨核型多角体病毒第1部分:首宿银纹夜峨核型多角体病毒母药NY/T 3279.1-2018*中国农业出版社出版(北京市朝阳区麦子店街18号楼)(邮政编码:100125网址:)北京印刷一厂印刷新华书店北京发行所发行各地新华书店经销*争等长开本880=X1230=1/16 印张1.25 字数25千字2018年11月第1版2018年11月北京第1次印刷书号16109 4637 定价30.00元关争e版权专有侵权必究举报电话(010)59194261 3279.1-2018