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1、中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 3449-2012 昆虫介体中植原体检疫鉴定方法Deecion and identification of candidaus phyoplasma in insec vecor 2012-12-12发布2013-07-01实施中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局N-ON|寸寸的同军中华人民共和国出入境检验检疫行业标准昆虫介体中植原体检度鉴定方法SN/T 3449-2012 中国标准出版社出版北京市朝阳区和平里西街甲2号(100013)北京市西城区三里河北街16号(100045)总编室:(010)64275323争夺网址WWW.spc.口 r
2、lr 11斗机、准山版丰|秦宁宁岛印刷厂印刷手毛印张1字数24下于2013年7月第一次印hrJIJ1/16 2013年7月第一版印数1-1600开本880X 1230)!J 定价18.00字号书号:155066 2-25305 SN/T 3449-2012 SN/T 3449-2012 目。昌本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草o本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位:中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国宁夏出人境检验检疫局。本标准主要起草人:赵文军、陈岩、杨毅、杨旭光、牟海青、朱水芳OSN/T 3449-2012 昆虫介体中植原体检疫鉴定方法1 范围本标准
3、规定了昆虫介体中植原体的检疫和鉴定方法O本标准适用于进出境及国内监测中同翅目和半翅曰(具刺吸式口器)昆虫体内植原体的检疫和鉴定O2 原理根据传播植原体的昆虫介体种类(参见附录A)及植原体的分子生物学特性进行鉴定。3 仪器和试剂3.1 仪器设备PCR仪、超净工作台、高压灭菌锅、制冰机、核酸蛋白分析仪、高速冷冻离心机、台式小型离心机、超低温冰箱、常规冰箱、旋涡振荡器、移液器、电泳仪、凝胶成像系统O3.2 主要试剂甘油、75%乙醇、无水乙醇、冰醋酸、三氯甲皖、卡诺固定液(元水乙醇:冰醋酸:三氯甲皖二6:1:3)、昆虫保存液(75%乙醇，1%甘油)、PCR缓冲液、MgClz、dNTPs、TaqDNA聚
4、合酶、引物、TAE电泳缓冲液、DNA相对分子质量标准、SYBRGreen 1等。4 检测鉴定方法4.1 昆虫的前处理昆虫饥饿处理12h，以防止昆虫肠道内食物DNA的污染。4.2 昆虫体内植原体基因组DNA提取昆虫体内植原体基因组DNA的提取方法(见附录BL4.3 巢式PCR扩增及凝胶电泳检测用两对植原体扩增通用引物进行巢式PCR扩增并进行凝胶电泳检测(见附录。4.4 虚拟RFLP指纹图i普检测见附录D。5 结果判定5.1 在4.3检测中，若用通用引物R16F2njR16R2进行第二轮PCR后，PCR扩增产物经凝胶电泳检SN/T 3449-2012 测结果为阳性，而且片段大小为1.2kb左右，可
5、初步判定该昆虫样品中携带植原体，但需通过4.4方案进一步检测。5.2 在4.4检测中，克隆并测序植原体16SrDNA序列(寻|物R16F2n/R16R2扩增部分)，经17种限制性内切酶进行虚拟酶切后获得虚拟RFLP指纹图谱，若与己知植原体的虚拟RFLP指纹图谱一致，则可判定该样品携带该植原体O6 样品保存与复核6.1 样品保存与处理样品经登记和经于人签字后妥善保存，以备复核。对检出植原体的同批昆虫虫体，饥饿处理12h后浸泡于卡诺固定液20min，然后转入昆虫保存液.冻于-200C冰箱中保存O昆虫DJA冻存于-200C冰箱中O所有样品ii:存期满后山经商压反雨后方可处理。6.2 结果记录与资料保
6、存完整的实验记录包括:样品的来源、种类、时间，实验的时间、地点、方法和结果等，并要有实验人员不11TT核人员等于。PCR凝胶电泳检测币;有电泳结队照片，测序结占要保存序列文件丰序列比对文1:0 6.3 复核由国家质量监督检验检疫总局指定的单位或人员负责。主要考察实验记录、照片等资料的完整性和真实性，必要时进行复核试验O2 SN/T 3449-2012 附录A(资料性附录)植原体主要昆虫传播介体种类表A.1植原体主要昆虫传播介体种类编号昆虫介体名称寄主植物病害名称/植原体组地理分布叶蝉科(Cicadellidae)不同科的植物翠菊黄化病北美1 fci川户leru.zgulalu.Lawson 核
7、果类树木西方X病(16Sr田八)北美2 Alehroides lligroscutellatus 土豆土豆紫顶卷曲病(l6Sr111-13)东南亚3 A m rasca decuastans 茄属植物茄小叶病东南亚=叶草三叶草变叶病(16srrn 欧洲|4 Ah rode.bicincta(双带脊冠叶蝉)不同科的植物顽固病06SrX-A)欧洲草莓、三叶草草莓花变叶病(l6Sr1-C)英国3 lll.troa!;allia torrida 三叶草叶皱缩卷曲病澳大利亚日Batrchornor户hu.1l1lctatu.茄科番茄巨芽病(l6SrVl-A)澳大利亚芝麻芝麻变叶病中东地区7 Circul
8、ifer he7natoces 拧穰16SrV-16Sr1X 以色列蔬菜甜菜叶蝉传播(1-9绿变11与北关8 Circulifer tenellu川甜菜叶蝉)蔬菜番茄巨芽病(16SrvT-A)北美拧棱16SrV-16SrIX 以色列9 Collado川1.1cl山，llariu.l(鞍形叶蝉)核果类树木东方X病(16Sr田A)北美不同科的柏物翠菊黄化病北美10 CoLLdonu.ge7ttu.核果类树木西方X病(l6Sr111-A)北美核工I类树水内-方X州(l6Sr田A)北关11 Colladonus motanus(深山叶蝉)翠菊黄化病不同科的植物北美12 Dalbulus elimatu
9、s(墨西哥玉米叶蝉)谷类玉米丛枝矮化病(l6Sr1-13)北美/墨西哥13 Dalbul川maidi.(玉米叶蝉)谷类玉米丛枝矮化病(l6Sr1-13)北美/墨西哥11 Em卢oascaayae()man 番木瓜番木瓜束顶顶病加勒比海地区15 Endria inimica(捆脂叶蝉)芹菜翠菊黄化病(l6Sr1)北美16 Eu,celidiu.lineollu.Brulle 工nl甲工nl草绿变病(l6Sr1-C)欧洲草莓花瓣变绿病(l6Sr1-C)英国三叶草三叶草变叶病(l6Sr1-C)欧洲|17 Eu.celidiu.varie!;ate.Kirschbaum 不同科的植物翠菊黄化病北美(秧
10、叶蝉)核果类树木西方X病Cl6Sr田A)北美葡萄葡萄金黄化病(l6SrV-C)法国花菊花黄化病C16SrT-13)欧洲3 SN/T 3449-2012 表A.1(续)编号昆虫介体名称寄主植物病害名称/植原本组地理分布苹果、核果类树木7果丛生柏!妹休(16SrX-A)欧洲18 Fieberiella jlorii 不同科的植物翠菊黄化病(16SrD 北美核果类树木西方X病(16Sr田八)北美核果类树木东方X病(l6Sr111-A)北美19 Graminellaigrifro川谷类玉米丛枝矮缩病北美20 Gr户horhlanjlue凡、核果类树木西方X病(16Sr囚的北美Gyonaa lam in
11、a DeLong 核果类树木东方X病(16Sr囚的北美21(片拟扁叶蝉)Hishim川Zideschinensis Anufriev 22 枣树枣疯病(l6SrV-B)中国(中华拟菱纹叶蝉)Hishimon川dessellatiJ气川m is lshihara 桑树桑矮缩病(l6Sr1-B)中国23(桑拟菱纹叶蝉)24 H ishi monoideshycitis 茄子茄子小叶病东亚桑树桑矮缩病(l6Sr1-B)东亚盐肤木、工叶i奈树科黄化病东亚25 H ish i mOl1oid e:、sellatllsUhler 草、长春花枣树哇L疯病(l6SrV-B);东IJV野蜀葵野蜀葵丛枝病东亚不同
12、抖的植物银莲花从枝I;jU木菊花菊花黄化病(16SrT-R)欧洲|茄科植物茄怪缩病口水菊花商吉菜丛枝病(6SrT)日本26 Macrosteles striijl-o5 Anufriev 菊花Marguerite茧化病H本Japanese Mitsuba丛枝病(l6Srl)R牛4honewort 菊花洋葱黄化病日本茄科植物番茄黄化病日本工叶草，车前草三叶草变叶病(l6Sr1-C)英国27 Macrosteles L旷idigriseus(灰绿叶蝉)三叶草，车前草三叶草丛枝病英国28 Macro户sisfuscula(盹广头叶蝉)，且钩子届植物接缩欧洲29 几!Jacro51五Inenda.T榆
13、树榆树黄化病(16SrV)欧洲|30 Macro户sistri maculta(李f头nl蝉);李届怕物桃贡化北美31 1Veoa liturus jnestratus 菊科植物变叶病以色列32 Ne户hotett;cinctice扣(尾叶蝉);j(阳水稻茧化矮缩协，(l6SrXI-A)业讪|33 Nhotett川.Dlresens(二点黑尾叶蝉)水稻水稻黄化矮缩(lGSrXT-A)亚洲|34 Nesohrosyne orientalis 以科，花牛.牛女I;J业沙|、|4 表A.1(续)编号昆虫介体名称寄主植物35 Norvellina seminuda 核工I类树木茄科宿36 rUSl U
14、Sentatus(州市nl蝉)茄科豆科植物烟草37 Osburnellus bureal is 核果类树木Recil.l durslis岛lotschulsky水稻38(电)6n 1蝉)Scahuideus LuteuLus van Duzcc 愉届39(榆白带叶蝉)葡萄40 Sca户lwideustitanus Ball 葡萄菊花大豆41 Sca户hytu户lUSacutus 核果类树木核果类树木核果类树木.42 Sca户hytuiusdelugi Young 芹菜43 Sca户hylu户iusdiulius 核果类树木44 Scahyto户iusjliginosusOsborn 豆类45
15、Sca户hyLulUSlrrurlus 芹菜46 Sca户h.ytrJ户lUSit门desDcLong 核果类树木，芹菜茄科47 Sc lero ra cus卢auo户ictusIshih且r乱龙胆科植物大吴风草48 Rhytidudus decusquartu.杨属植物49 Tremulicerus vitreus 杨属植物菱蜡蝉科50 Cius wi!Jzerz 草莓茄科51 H yalesthes obsoletus Signoret 葡萄葡萄病害名称/植原本组东方X州Cl6Sr田A)番茄巨芽病(16SrvT-A)Lucerne丛枝病马铃岩紫顶萎焉病(16Sr田R)豆科植物小叶病烟草黄化
16、矮缩病西方X病(16Sr田1)水稻橙叶病主11、|榆树茧化的Cl6SrV-A)葡萄金黄化病Cl6SrV-c)葡萄金黄化病C16Sry-D)菊花贡化病(l6Sr1-B)大豆芽增生四力X病(l6Sr田八)东方X病Cl6Sr111-A)西方X病Cl6SrIII-A)西方X病(16Sr囚的豆类病西方翠菊黄化病西方X病(16Sr田1)马铃薯紫顶病Cl6Sr川B)龙月H届柏物丛枝病(16Sr田B)Tsuwabuki丛枝病丛枝(l6Sr1-A)丛枝Cl6Sr1-A)顽固病Cl6SrX-A)顽固病Cl6SrX-A)Vergilbungskrankheit Cl6SrX-A)葡萄黑木病(l6Srx-A)SN/T
17、 3449-2012 地理分布北关澳大利亚澳大利IV澳大利IV澳大利亚澳大利亚北美东南亚七关欧洲欧洲欧洲北美北美北美北美北美美国、墨西哥北美北美日本日本日本欧洲|欧洲欧洲欧洲土耳其欧洲|欧洲|d SN/T 3449-2012 表A.1(续)编号昆虫介体名称寄主植物病害名称/植原本组地理分布52 M.yndus c门ldu川VlnDlIzee 棕榈椰子致死黄化Cl6SrlV)SlIbtropical Amcricl Oliarius at是lns071l孔1eyers亚麻新西兰麻黄叶病新西兰53(l6Sr xrr-13)飞虱科(DclphlCidlC)Saccharosyde sccharivo
18、r，甘庶甘在黄化病古巴54(甘蔚长飞虱)袖蜡蝉科(Derbidae)棕榈椰子根枯病(l6SrN)东南亚55 Proutistn70esta 甘庶草状丛枝病东南亚水虱科(Psyllidae)56 Csylla melaeur 苹果苹果丛生病(16SrX-A)欧洲|57 C(户s.ylla户icta7果7果丛生病(l6SrX-A)欧洲Cacosyllarunl Scopoli 核果类树木欧洲核果类树木黄化病欧洲58 Cl6SrX-13)苹果苹果丛生病Cl6SrX-A)欧洲|59 Caco户，yllapyri 梨树梨衰退病Cl6SrX-C)欧洲60 Cco户syllayricola梨属植物梨衰退Cl
19、6SrX-C)北美61 Caco户syllaynsuga梨树梨衰退Cl6SrX-C)俄罗斯自在科(Pentatomidae)62 Halyumr户hahalys j包桐泡桐丛枝病(16SrI-R)东亚网蜡科(Tingidae)Sl.e户haniL.isI.y 户ica(香蕉冠网蜡)椰子根枯病东南亚6 SN/T 3449-2012 附录B(规范性附录)昆虫体内植原体基因组DNA的提取方法B.1 2%CTAB自己制2%C质量浓度)CTAB(十六烧基三乙基漠化馁，C1DH1二NBr)100 mmol/L Tris-Cl,pH8.0 20 mmol/L EDTA,pH8.0 1.4mol/L NaCl
20、 B.2 DNA提取步骤B.2.1 取单头昆虫，去翅，于双蒸水中漂洗，吸水纸吸干。B.2.2 将虫体放入2.0mL离心管中，加入20fJ.L 2%CTAB,-20 oC冰箱放置4mi日，取出用小研棒或牙签捣碎，匀浆，小研棒或牙签用200L2%CTAB冲洗。B.2.3 65 oC水浴温育45minC期间不断的颠倒混匀)，放人55oC水浴2min 使其温度降到55O(。B.2.4 加人10fJ-L蛋白酶KC20mg/mL),55 oC,40 min(期间不断的颠倒混匀)。B.2.5 冷却后，加入等体积的24:1三氯甲烧/异戊醇，颠倒使充分混合，于40(,7 500g离心5min,回收上层水相OB.
21、2.6 川人2倍休积顶冷的兀水乙醉，11日匀，放胃-200(,1 h以上OB.2.7 12000g，离)，15min，弃上清液，收集沉淀，晾干，用70%乙醇洗l次。B.2.8 室温干燥10min后，加人20LTE于一20oC 保存O7 SN/T 3449-2012 附录C(规范性附录)PCR;疑胶电泳检测C.1 巢式PCR引物序列第一轮引物Pl:5-AAGAGTTTGATCCTGGCTCAGGATT-3 P7:5-CG TCCTTCA TCGGCTCTT-3 第二轮引物:R16F2n:5-GAAACGACTGCTAAGACTGG-3 R16R2:5-TGACGGGCGGTGTGTACAAACC
22、CCG-3 C.2 PCR反应体系见表C.l。表C.1 PCR反应体系(25L)试齐IJ名称10XPCR反应缓冲液岛19C1，dNTPs 正向引物反向引物Taq DNA聚合酶DNA模板补ddH，O至注:DNA模板的取量应根据DJA的提取浓度、纯度而调节。C.3 巢式PCR终浓度lX 2.5 mmol!L 0.2 mmol!L 0.4mol!L 0.4mol/L l.OU 1.0L 25L 第一轮PCR寻|物用Pl/P7，产物经灭菌双蒸水1:50(体积比)稀释后，取1p.L做为第二轮PCR的模板。第二轮PCR引物用R16日n/R16R2o每一轮PCR均需设置一个阳性对照、一个阴性对照、一个空白对
23、照。阳性对照采用克隆有植原体16S rDNA的质粒为模板;阴|生对照以不携带植原体的昆虫基因组DNA做模板，空白对照以灭菌双蒸水做模板OPCR反应参数如下:第一轮PCR(寻|物Pl/P7):8 SN/T 3449-2012 94 oC,5 m i n;94 oC，50日，52oC，50日，72oC,2 mi口，35个循环:72 oC,10 mi口。第二轮PCRC寻|物R16F2n/R16R2):94 oC,5 m i n;94 oC,50s,60 oC,50s,72 oC,1 m i n 30 s,3 5个循环;7 2 oC,10m i n 0 注:小同仪器可根据仪器要求将反Jti.参数作适当
24、调整。C.4 琼脂糖凝胶电泳制备1%的琼脂糖凝跤，以DNAMarker作为相对分子质量标记，进行电泳分析，电泳结束后在凝胶成像仪观察并记录结果。C.5 结果判定第二二轮PCRC11物R16F2n/R16R2)扩增广物也泳，样品:11现1.2 kb左右条带，且阳tl:对照:1现1.2 kb左右条带，阴性对照与空白对照均无相应条带，即可初步判定样品为阳性O9 SN/T 3449-2012 附录D(规范性附录)虚拟RFLP指纹图i昔分析D.1 引物序列将附录C中的巢式PCR扩增产物(植原体16SrDNA基因片段)克隆后进行序列测定。D.2 虚拟RFLP分析利用iPhyclassifier在线分析软件
25、或DNA-FPCluster软件将测得植原体16SrDNA序列(R16F2日/R16R2)进行虚拟酶切.选用17种限制性内切酶(Alu1、BmHI、Bja1、BstU 1、Dra1、ERI、日四、Hha1、Hinf1、HI、HH、K户11、MbI、Mse1、Rsa1、仇I、丁q1)。酶切后件到虚拟RFLP图语如图D.1。此外，使用iPhyclassiier的到1.(亚当1)划分功能(16Srgroup/subgroup classification based on similarity coefficient)，可以对未知植原体进行组与亚组的分类。2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
26、12 13 14 15 16 17 18 19 图D.1澳大利亚植原体候选种酶切图谱DNA相对分子质量标准选用Invitrogen25 bp D)JA Ladder，琼脂糖凝胶浓度为3%，最小片段选为10bpo泳道1:Marker，泳道2:AluI，泳道3:BmH1，泳道4:Bfa1，泳道5:BstU 1，泳道6:Dra1，泳道7:EcoR 1，泳道8:Hae凹，泳道9:Hha1，泳道10:Hinf 1泳近ll:Hpal，泳道12:Hll，泳道13:K1，泳道14:Mbo 1，泳道15:MseI，泳道16:RsaI，泳道17:Ss1，泳道18:T叫1，泳道19:Marker。nu l SN/T
27、 3449-2012 参考文献lJ http:/plantpathology.ba.ars.usda.gov/phytoplasma.html.2J 牟海青，赵文军，邓中亮，等.植原体16SrDNA RFLP.指纹图谱分析软件研究.植物病理学t良，2010，40(5):522-529.3J 牟海青，朱水芳-徐霞，等.植原体病害研究概况.植物保护，2011，37(3):17-22.4J 朱水芳，赵宝庆，胡加彬，等.植原体病害研究进展及其检疫重要性.植物检疫，1998，12(4).5J 米水好.现代检验检疫技术.北京:科学出版社，2012，p186.6J Wei引人，DavisR.E.,Lee 1
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