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1、ICS 65.020 B 17 NY 中华人民共和国农业行业标准NY/T 3152.3一2017微生物农药环境风险评价试验准则第3部分:家蚕毒性试验Risk assessment test guidelines for microbial pesticide-Part 3:Silkworm toxicity test 2017-12-22发布2018-06-01实施中华人民共和国农业部发布NY/T 3152.3-2017 目。吕NY/T 3152(微生物农药环境风险评价试验准则分为6个部分:第l部分:鸟类毒性试验;一一第2部分:蜜蜂毒性试验;第3部分:家蚕毒性试验;一一第4部分:鱼类毒性试验;
2、第5部分:渥类毒性试验;第6部分:藻类生长影响试验。本部分为NY/T3152的第3部分。本部分按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本部分由农业部种植业管理司提出并归口。本部分起草单位:农业部农药检定所、环境保护部南京环境科学研究所。本部分主要起草人:姜辉、卡元卿、杨鸿鹏、周欣欣、王宏伟、宋伟华、单正军。I 1 范围微生物农药环境风险评价试验准则第3部分:家蚕毒性试验NY/T 3152.3-2017 本部分规定了微生物农药对家要求。、质量控制、试验报告等的基本3.1 微生物是以细菌有害生物作用3.2 3.4 供
3、试物试验细菌芽抱、真菌袍子、显微镜下一个完整的完整的实体。3.5 细菌营养体vegetative b阳a低cte阳阳e 臼町r由.单个活的生物体，通常是指能在合适的培养基上形成一个CFU的实体。3.6 原生动物protozoa 原生动物门各个成员的一个完整的营养体、抱子或抱囊。3.7 病毒virus 显微镜下一个完整的病毒颗粒或包涵体。、草、鼠等or protowan cyst 形成单个CFU的一个1 NY/T 3152.3-2017 3.8 最大危害暴露量maximum hazard exposure level 微生物农药有效成分在环境中对非靶生物可能产生危害的最大暴露量，通常以预测暴露量
4、与安全系数的乘积来表示。3.9 毒性toxicity 微生物和/或毒素引起受试生物中毒或病变的能力。其作用过程不一定同时发生微生物的感染、复制和生命活动。3.10 致病性pathogenicity 微生物感染宿主后，在宿主体内存活及繁衍，对宿主造成损伤或病变的能力，通常与宿主的耐受性或敏感性有关。3.11 半数致死量median lethal dose or concenlration,LDso/1。在规定时间内，通过指定感染途径，使一定体重或年龄的受试生物半数死亡所需最小微生物数量或毒素量。3.12 半数感染量median infective dose or concentration,ID
5、so/IC,.在规定时间内，通过指定感染途径，使一定体重或年龄的受试生物半数感染所需最小微生物数量或毒素量。4 试验概述在一定试验条件下，以一定的供试物浓度或剂量测试对受试生物的毒性和致病性等影响。当供试物最大危害暴露量试验出现对受试生物50%及以上的个体死亡或致病时，则还需进行剂量效应试验和致死(病)验证试验。致死毒性以LD5o/LC，o表征;致病性以ID5o/ICso值表征。5 试验方法5.1 材料和条件5.1.1 试验生物家蚕CBomhyxmori)，宜选用菁松蜡月、春蕾镇珠、苏菊明虎或其他有代表性的品系。以2龄起蚕作为受试虫，要求受试家蚕健康、大小、龄期一致。5.1.2 供试物5.1.
6、2.1 类型微生物母药、制剂产品等。5.1.2.2 批次通常情况下，试验中供试物应采用同一批次的产品。但在不得不使用另一批次产品时，应在试验报告中记录供试物的批次。5.1.2.3 计数方法2 计数方法如下:一一细菌可采用稀释平板菌落计数法、荧光定量PCR等测定，真菌抱子以CFU为计数单位，可采用稀释平板菌落计数法或血球计数板法等测定;原生动物以个体数目为计数单位，可采用血球计数板法等视定;NY/T 3152.3-2017 病毒以包涵体等感染单位为计数单位，可采用荧光定量PCR、血球计数板法等测定;一一其他单位，根据微生物的类型和特性选择最适当的计数方法。以上推荐计数方法，参见附录A、附录B、附
7、录C.5.1.3 主要仪器设备超净工作台。灭菌锅。显微镜。解剖镜。分光光度计。聚合酶链式反应仪。温度计。玻璃器皿。天平等。5.1.4 试验条件一般情况下，分考虑供试物5.2.5 以1.OX 108 取较高值作为最大危时，则以供试物在水中能工饲料(配方参见附录开始后，每日茧层量，并计算化蜗率、结茧率、茧层率。和致死(病)验证试验;当受试家蚕在试验期间出现50应试验和致死(病)验证试验。5.2.6 剂量效应试验，应充。考虑者均能达到时，最大危害暴露量的新鲜桑叶或人的干净桑叶.试验、结茧情况，测定全茧量、，则无需进行剂量效应试验以上的个体死亡或致病时，则需进行剂量效根据最大危害暴露量试验结果，按一定
8、比例间距设置5组7组供试物系列浓度，将受试家蚕暴露于不同浓度的供试物下，试验开始后，每日观察并记录受试家蚕的中毒性症状、死亡情况，化蜗结茧后观察化蜗、结茧情况，测定全茧量、茧层量，并计算化蜗率、结茧率、茧层率。求出试验结束时供试物对家蚕的LD旷LCso值或IDso/ICso值及其95%置信限。5.2.7 致死病)验证试验3 NY/T 3152.3-2017 在无菌条件下解剖死蚕或病蚕，分离感染组织并接种至适合的培养基质中，将培养物置于适宜目标菌株生长条件下培养，分离纯化疑似菌株，疑似菌株经形态学、生理生化及核酸等方法鉴定并确认为目标菌株后，再以相同暴露途径感染健康的受试家蚕。如果受试家蚕出现与
9、先前试验相同的病症，则证实目标菌株对受试家蚕具有致死(病)能力。5.3 数据处理5.3.1 统计方法选择试验结果的数据处理可选择5.3.2、5.3.3中所述的统计学方法，也可根据试验情况选择其他合适的统计方法。5.3.2 差异显著性检验5.3.2.1 概述差异显著性检验推荐采用独立样本t检验或单因子方差分析(Onc-WayANOVA，LSD检验)等。显著水平取0.05(差异显著、5王-玉，(2)式中.t，叫3在F检验中误差自由度下，显著水平为的临界t值;S豆豆一一均数差异标准误，按式。)计算。S玉为=j2MSJ n.(3)式中:MS，-F检验中误差均方En 一一各处理重复数。5.3.3 半数致
10、死量或半数感染量计算家蚕半数致死浓度LCs。或半数感染浓度ICso的计算可采用寇氏法、直线内插法或概率单位图解法估算，也可应用有关毒性数据计算软件进行分析和计算。具体计算方法见GB/T31270.11,5.4 质量控制质量控制条件如下:一一对照组受试家蚕死亡率不超过10%;一一实验室内应定期(蚕卵每批-次，同批蚕卵至少每2个月-次)进行乐果参比物质试验，以保证受试家蚕的稳定性。6 试验报告试验报告应包括下列内容:4-一试验名称、试验单位名称和联系方式、报告编号;-寸式验委托单位和联系方式、样品受理日期和封样情况;一试验开始和结束日期、试验项目负责人、试验单位技术负责人、签发日期;一一试验摘要;
11、NY/T 3152.3-2017 一一供试物基本信息(例如，含量和组成信息，以及任何改变供试物生物活性物质的含量和组成信息，施用量、施用方法等);一一受试生物的名称、来源、大小及饲养情况;二一试验系统的详细描述;一-试验条件，包括试验温度一一试验结果。5 NY/T 3152.3-2017 附录A(资料性附录)稀释平板菌落计数法1)A.1 方法原理将供试物经无菌水分散处理后，在固体培养基上由单个细胞生长并繁殖成一个菌落，因而可以根据形成的菌落数来计算供试物中微生物的数量。A.2 试剂蛋白陈。牛肉膏。氯化锅(NaCl)。氢氧化纳溶液:1mol/L。盐酸溶液:1 mol/L 葡萄糖。磷酸二氢例(KH
12、，PO，)。硫酸簇(MgSO，)。琼脂。孟加拉红。蒸馆水。氯霉素。A.3 仪器设备高压蒸汽灭菌锅。恒温培养箱。超净工作台。酸度计等。A.4 固体培养基平板的制备A.4.1 细菌培养基平板依次称取蛋白陈10g、牛肉浸膏3g、氯化纳5g、琼脂15g18g，溶于900mL蒸馆水中，置于电炉上加热，搅拌至完全溶解，加蒸馆水至1000mLo以1mol/L氢氧化纳溶液或1mol/L盐酸溶液调节pH至7.07.20分装于500mL三角瓶中，每瓶装150mL，塞上棉塞，经1210C高压蒸汽灭菌20min,培养基温度降至约500C后倒入无菌培养皿中，每板约15mL。A.4.2 真菌培养基平板依次称取蛋白陈5g、
13、葡萄糖10g、磷酸二氢饵1g、硫酸续0.5g，琼脂15g18 g、孟加拉红0.03 g、氯霉素。.1g，溶于900mL蒸馆水中，置于电炉上加热，搅拌至完全溶解，加蒸馆水至1000r此。分装于1)本方法适用于细菌、真菌袍子等|数.但细菌、真菌袍子等计数不仅限于本方法.6 NY/T 3152.3-2017 500 mL三角瓶中，每瓶装150mL，塞上棉塞，经121C高压蒸汽灭菌20min，培养基温度降至约50C后倒入元菌培养皿中，每板约15mL,A.5 样晶的处理称取一定量的供试物，加入盛有适当元菌水的三角瓶中，通过振荡、超声等方法使供试物充分分散成单细胞，形成菌悬液，然后用容量瓶和无菌水定容，配
14、置一定浓度的微生物悬浮母液备用。上述过程均应无菌操作。A.6 样品母液的稀释涂布用无菌刻度吸管吸取1mL上述配制好的微生物悬浮母液到9mL元菌水中，按10倍法依次稀释，细茵通常稀释到10-8，并选择10-8_10-6稀释菌悬液用于平板涂布;真茵通常稀释到10-7，并选择10-7-10稀释菌悬液用于平板涂布.吸取100L稀释液置于培养基平板表面，立即用无菌玻璃涂棒或接种针均匀涂抹于培养基表面，将涂布后的平板倒置于温度适宜的培养箱中黑暗培养。当用同一支吸管接种同一样品不同稀释浓度时，应从高稀释度(即低浓度菌悬液)开始，依次向较低稀释度的菌悬液顺序操作。A.7 菌落计数细菌培养基平板培养2d-3d后
15、取出，选择细菌菌落数量20-200之间的培养皿进行计数。真菌培养基平板培养3d-5 d后取出，选择真茵茵落数量10-100之间的培养皿进行计数。母液微生物浓度或含量按(A.1)计算。C=NXX.(A.1)式中:C一一母液微生物浓度或含量，单位为菌落形成单位每克(CFU/g)或菌落形成单位每毫升(CFU/mL);N一一培养基平板微生物菌落平均数，单位为个;X一一母液稀释倍数。7 NY/T 3152.3-2017 B.1 方法原理B.3 少许，从计数区，并用行计数。格(即80小格)上微生物的统计应有统一数右线，以减少误差。即位定计人相应的格中。样品浓度或含量按式(B.1)计算。附录B(资料性附录)
16、血球计数板法1)定面积和容积的载玻片上(血球，用滴管吸取表面张力充满、右上、中间的5个中方至少计数2次，对沉降在格线则数上线不数下线，数左线不，本格的下线和右线上的微生物按规C=N X 25/5 X 10 X 10 X X.CB.1)式中:C一一样品浓度或含量，单位为个每毫升(个/mL);1)本方法适用于体型较大的微生物，如真菌抱子、酵母、多角体病毒和原生动物等计数.但真商泡子、酵母、多角体病毒和原生动物等计数不仅限于本方法.8 N一-5个中方格的微生物总数;X一一样品稀释倍数。NY/T 3152.3-2017 9 二一一二一NY/T 3152.3-2017 C.1 方法原理附录C(资料性附录
17、)荧光定量P法1)，其荧光信号强度与dsDNA的数量累积、曲线，最后通过C.2 C.4 C.4.1目引物设唱唱盟，噩噩眉同握主扭曲矗噩噩渺咽.J设计引物，使引物Tm值为62样品基因组:电阻挡呵曹喔噩样晴理国幽幽噩噩噩，盒。姐廖因组提取试剂盒操作说明提取样特异基因片段扩用取的凋回国凰削幅画组踵CRft!基因片段，采用两步法扩增，阳扩增体系如下回M.0.2蜡也aq回事解ffer，dNTP 2L(20 mmol/L),引物lCPD、寻|物2(P2)各1页.监牛叶，加ddH20吨5L;反应条件为:94.C预变性5min;(94.C变性，30s;60.C退火延矿霄-m晴暨伸10min;4.C保存。电泳检
18、测:PCR产物使用1%琼脂糖凝胶电泳检测，确保无非特异性扩增并回收扩增片段。TA克隆:按照TA克隆标准步骤将回收后的扩增产物连接至pMD18T载体并转化至大肠杆菌DH5a感受态中;LB抗性平板(Amp100)结合蓝白斑筛选，挑取单克隆转移至液体LB(Amp100)中，37C摇床培养12h，按照质粒提取试剂盒说明书提取质粒并送至测序公司进行测序验证，确定目的基因片段与载体相连且序列正确。C.4.2 标准品模板的拷贝数确定1)本方法适用于细菌、真菌和病毒等计数.但细菌、真菌和病毒等计数不仅限于本方法.10 NY/T 3152.3-2017 使用Nanodrop或其他仪器测定含目的基因片段的载体浓度
19、，按式(C.1)计算目的基因拷贝数(Copies/L)。Q=6.02X 1023 XCX10/L X660.(C.1)式中:Q-基因拷贝数，单位为拷贝数每微升(Copies/L);C-一-DNA浓度，单位为纳克每微升(ng/L);L-一DNA长度，单位为碱基对(bp)。将含目的基因片段的载体用ddH20进行10倍梯度稀释，稀释为10Copies/L 108 Copies/L，此即为标准品模板，-20.C保存样品。C.5 标准曲线绘制与扩增效率计算标准品模板的qPCR扩增:采用20LqPCR反应体系，两步法进行扩增，具体为:标准品模板2L，SYBR Green Superrnix 10L，寻|物
20、1和引物2各1L，加无菌双蒸水补足体积至20L;反应条件为:9S.C预变性Smin;(95.C变性，10s;60.C退火延伸30s)40个循环;溶解曲线采集程序以程序默认为准;其中，每个稀释度的样品做5个重复，阴性对照使用元模板的无菌双蒸水。标准曲线的绘制:确定溶解曲线为单峰，且峰值温度在80.C90.C，确定溶解曲线峰值;并确定扩增生成Ct值在1535区域间，同一个样品不同重复间的Ct值差异小于O.趴在满足此条件的情况下，以标准品模板的拷贝数为横坐标，Ct值为纵坐标，绘制标准曲线，并求出标准曲线线性方程。扩增效率(E)计算:E的范围应为90%1l0%，保证。CR每完成一个循环，底物浓度扩增一
21、倍;E按式(C.2)计算。E=(1O-1川一1)X100.(C.2)式中:E一一扩增效率，单位为百分率(%);k一一标准曲线斜率。C.6 样品微生物的定量C.6.1 样品总基因组DNA的提取根据基因组提取试剂盒说明书提取样品基因组总DNA.C.6.2 样品微生物计数以提取的样品基因组总DNA为模板，进行qPCR反应。qPCR反应条件与C.S一致，根据反应生成的Ct值和已建立的标准曲线，计算各目的基因片段的拷贝数，从而评估样品中待测物种的丰度。11 NY/T 3152.3一2017家蚕人工饲料配方见表D.l.12 附录D(资料性附录)家蚕人工饲料配方参考文献lC;B 4789.2-2010食品安
22、全国家标准食品微生物学检验菌落总数测定.2NY/T 2743一2015甘.1f.白色条纹病菌检验检疫技术规程实时荧光定量PCR.3SN/T 2358二2009国境口岸炭瘟芽抱杆菌荧光定量PCR检测方法.NY/T 3152.3-2017 13 EON-的.NmF的-H如Z中华人民共和国农业行业标准微生物农药环境风险评价试验准则第3部分:家蚕毒性试验NY/T 3152.3-2017 1 当导中国农业出版社出版(北京市朝阳区麦子店街18号楼(邮政编码100125网址.ccap.COT)北京印刷一厂印刷新华书店北京发行所发行各地新华书店经销峰峰*开本880rnrnX1230rnrn 1/16 印张1.25 字数25千字2018年5月第1版2018年5月北京第1次印刷书号16109 4424 定价30.00元9晤9峰版权专有侵权必究举报电话(010)65005894