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1、ICS 65.020 B 17 NY 中华人民共和国农业行业标准NY/T 3152.2一2017微生物农药环境风险评价试验准则第2部分:蜜蜂毒性试验Risk assessment test guidelines for microbial pesticide一Part 2:Honeybee toxicity test 2017-12-22发布2018-06-01实施翻碍中华人民共和国农业部发布NY/T 3152.2-2017.目。吕NY/T 3152(微生物农药环境风险评价试验准则分为6个部分:一-第1部分:鸟类毒性试验;一-第2部分:蜜蜂毒性试验;一一第3部分:家蚕毒性试验;一一第4部分:鱼
2、类毒性试验;一一第5部分:渥类毒性试验;一-第6部分:藻类生长影响试验。本部分为NY/T3152的第2部分。本部分按照GB/T 1.1-2009给出的规则起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本部分由农业部种植业管理司提出并归口。本部分起草单位:农业部农药检定所、环境保护部南京环境科学研究所。本部分主要起草人:卡元卿、姜辉、王宏伟、周欣欣、程燕、何明远、周军英。I 1 范围微生物农药环境凤险评价试验准则第2部分:蜜蜂毒性试验NY/T 3152.2-2017 本部分规定了微生物农药对蜜、质量控制、试验报告等的基本要求。本部分适用下列文件对于件。凡是不
3、注日期GB/T 31270 3 术语和定义3.1 微生是以细菌有害生物作用3.3 菌落形成单位由单个菌体或完整的实体。3.5 细菌营养体vegetative bacterium 单个活的生物体，通常是指能在合适的培养基上形成一个CFU的实体。3.6 原生动物protozoa 原生动物门各个成员的一个完整的营养体、抱子或抱囊。3.7 病毒virus 显微镜下一个完整的病毒颗粒或包涵体。、草、鼠等or protozoan cyst 成单个CFU的一个1 NY/T 3152.2-2017 3.8 最大危害暴露量maximurn hazard ex阴阳level 微生物农药有效成分在环境中对非靶生物可
4、能产生危害的最大暴露量，通常以预测暴露量与安全系数的乘积来表示。3.9 毒性toxicity 微生物和/或毒素引起受试生物中毒或病变的能力，其作用过程不一定同时发生微生物的感染、复制和生命活动。3.10 敖病性pathogenicity 微生物感染宿主后，在宿主体内存活及繁衍，对宿主造成损伤或病变的能力，通常与宿主的耐受性或敏感性有关。3.11 半数致死量median lethal dose or concentration,LD50/LCso 在规定时间内，通过指定感染途径，使一定体重或年龄的受试生物半数死亡所需最小微生物数量或毒素量。3.12 半数感染量median infective d
5、ose or concentration,ID50/ICso 在规定时间内，通过指定感染途径，使一定体重或年龄的受试生物半数感染所需最小微生物数量或毒素量。4 试验概述在一定试验条件下，以一定的供试物浓度或剂量测试对受试蜜蜂的致死毒性和致病性等影响。当供试物最大危害暴露量出现对受试生物50%及以上的个体死亡或致病时，则还需进行剂量效应试验和致死(病)验证试验。致死毒性以LD50表征;致病性以由50表征。5 试验方法5.1 材料和条件5.1.1 试验生物推荐使用意大利工蜂CApismellifera L.)、中华蜜蜂CApiscerana cerana)等。选择羽化3d内的工蜂，受试蜂应来自姊妹
6、蜂王，健康、大小一致。5.1.2 供试物5.1.2.1 类型微生物母药、制剂产品等。5.1.2.2 批次通常情况下，试验中供试物应采用同一批次的产品。但在不得不使用另一批次产品时，应在试验报告中记录供试物的批次。5.1.2.3 计数方法2 计数方法如下:一一细菌可采用稀释平板菌落计数法、荧光定量PCR等测定;一一真菌抱子以CFU为计数单位，可采用稀释平板菌落计数法或血球计数板法等测定;一一原生动物以个体数目为计数单位，可采用血球计数板法等测定;NY/T 3152.2-2017 一一病毒以包涵体等感染单位为计数单位，可采用荧光定量PCR、血球计数板法等测定;-其他单位，根据微生物的类型和特性选择
7、最适当的计数方法。以上推荐计数方法，参见附录A、附录B、附录C。5.1.3 主要仪器设备超净工作台。灭菌锅。显微镜。解剖镜。分光光度计。聚合酶链式反应仪。温度计。蜂笼。天平等。5.1.4 试验条件一般情况下，还需充分考。考虑微蜜以1.0XIO.单位/而.共试愣暨噩噩跚用事且主怖喃喃蹲疆跚匠害是.两者均能达到时，取较高值作为最大危害暴露当因调圈噩监事条葡噩噩噩黯幢幢事j最大恳露量时，则以供试物在水中能配制到的最大剂量进莉.试骚瑭帽匾日观察蹦胃嚷蜜蜂凶-暨状及死亡情况。当受试蜜蜂在试验期间未发生死亡，则无，.届;效应试验和致死(瘟祖国量;当受试蜜蜂在试验期间出现50%及以上的个体死亡或致病，则需进
8、付冒商)验证试验。暴露分为:a)经口暴露。将供试物分散在rtf.糖溶液中，用以饲喂受试蜜蜂，饲喂4h后更换为不含供试物的煎糖溶液并测定含供试物饲料的消耗量。b)接触暴露。将1L受试物药液点滴在受试蜜蜂的中胸背板处，将蜜蜂转入试验笼中，用脱脂棉浸泡适量煎糖水饲喂。5.2.6 剂量效应试验根据最大危害暴露量试验结果，按一定比例间距设置5组7组供试物系列浓度，将受试蜜蜂暴露于不同浓度的供试物下，试验开始后，每日对受试蜜蜂的中毒症状、死亡等进行观察和记录。求出试验结束时供试物对蜜蜂的LD50值或E臼值及其95%置信限。3 NY/T 3152.2-2017 5.2.7 致死(病)验证试验在无菌条件下解剖
9、死蜂或病蜂，分离感染组织并接种至适合的培养基质中，将培养物置于适宜目标菌株生长条件下培养，分离纯化疑似菌株，疑似菌株经形态学、生理生化及核酸等方法鉴定并确认为目标菌株后，再以相同暴露途径感染健康的受试蜜蜂。如果受试蜜蜂出现与先前试验相同的病症，则证实目标菌株对蜜蜂具有致死(病)能力。5.3 数据处理5.3.1 统计方法选择试验结果的数据处理可选择5.3.2、5.3.3中所述的统计学方法，也可根据试验情况选择其他合适的统计方法。5.3.2 差异显著性检验5.3.2.1 概述差异显著性检验推荐采用独立样本t检验或单因子方差分析COne-WayANOVA，LSD检验)等。显著水平取O.05(差异显著
10、)、5玉王2 .(2)式中.ta(dfe)一一在F检验中误差自由度下，显著水平为的临界t值;S豆豆2均数差异标准误，按式。计算。SX-Ij=j2丽./n.(3)式中:MS，一-F检验中误差均方;n 各处理重复数。5.3.3 半数致死量或半数感染量计算蜜蜂半数致死量LD50或半数感染量E阳的计算可采用寇氏法、直线内插法或概率单位图解法估算，也可应用有关毒性数据计算软件进行分析和计算。具体计算方法见GB/T31270.10。5.4 质量控制试验结束时，空白对照组受试蜜蜂死亡率不得超过20%。6 试验报告试验报告应包括下列内容:-一试验名称、试验单位名称和联系方式、报告编号，试验委托单位和联系方式、
11、样品受理日期和封样情况;4 一一试验开始和结束日期、试验项目负责人、试验单位技术负责人、签发日期;试验摘要;NY/T 3152.2-2017 一供试物基本信息(例如，含量和组成信息，以及任何改变供试物生物活性物质的含量和组成信息，施用量、施用方法等);受试生物的名称、来源、大小及饲养情况;一一试验系统的详细描述;试验条件，包括试验温度、相对湿度和光照条件等;一一试验结果。5 NY/T 3152.2-2017 附录A(资料性附录)稀释平板菌落计数法1)A.1 方法原理将供试物经无菌水分散处理后，在固体培养基上由单个细胞生长并繁殖成一个菌落，因而可以根据形成的菌落数来计算供试物中微生物的数量。A.
12、2 试剂蛋白陈。牛肉膏。氯化纳(NaCl)。氢氧化纳溶液:1mol/L。盐酸溶液:1 mol/L。葡萄糖。磷酸二氢饵(KH2PO，)。硫酸续(MgSO，)。琼脂。孟加拉红。蒸惚水。氯霉素。A.3 仪器设备高压蒸汽灭菌锅。恒温培养箱。超净工作台。酸度计等。A.4 固体培养基平板的制备A.4.1 细菌培养基平板依次称取蛋白陈10g、牛肉浸膏3g、氯化纳5g、琼脂15g18g，溶于900mL蒸馆水中，置于电炉上加热，搅拌至完全溶解，加蒸馆水至1000mL。以1mol/L氢氧化销溶液或1mol/L盐酸溶液调节pH至7.07.2。分装于500mL三角瓶中，每瓶装150mL，塞上棉塞，经121C高压蒸汽灭
13、菌20min,培养基温度降至约50C后倒入无菌培养皿中，每板约15mL,A.4.2 真菌培养基平板依次称取蛋白陈5g、葡萄糖10g、磷酸二氢铮19、硫酸簇0.5g，琼脂15g18 g、孟加拉红0.03g、氯霉素0.1g，溶于900mL蒸馆水中，置于电炉上加热，搅拌至完全溶解，加蒸馆水至1000mL，分装于1)本方法适用于细菌、真菌抱子等计数.但细商、真商袍子等计数不仅限于本方法。6 NY/T 3152.2-2017 500mL三角瓶中，每瓶装150mL，塞上棉塞，经121.C高压蒸汽灭菌20min，培养基温度降至约50.C后倒入元菌培养皿中，每板约15mL。A.5 样品的处理称取一定量的供试物
14、，加入盛有适当无菌水的三角瓶中，通过振荡、超声等方法使供试物充分分散成单细胞，形成菌悬液，然后用容量瓶和无菌水定容，配置一定浓度的微生物悬浮母液备用。上述过程均应元菌操作。A.6 样晶母液的稀释涂布用无菌刻度吸管吸取1mL上述配制好的微生物悬浮母液到9mL无菌水中，按10倍法依次稀释，细菌通常稀释到10-8，并选择1O-8106稀释菌悬液用于平板涂布;真茵通常稀释到10-7，并选择10-7 1O-5稀释菌悬液用于平板涂布。吸取100L稀释液置于培养基平板表面，立即用无菌玻璃涂棒或接种针均匀涂抹于培养基表面，将涂布后的平板倒置于温度适宜的培养箱中黑暗培养。当用同一支吸管接种同一样品不同稀释浓度时
15、，应从高稀释度(即低浓度菌悬液)开始，依次向较低稀释度的菌悬液顺序操作。A.7 菌落计数细菌培养基平板培养2d3 d后取出，选择细菌菌落数量20200之间的培养皿进行计数。真菌培养基平板培养3d5 d后取出，选择真茵茵落数量10100之间的培养皿进行计数。母液微生物浓度或含量按(A.1)计算。C=N XX.(A.1)式中:C一一母液微生物浓度或含量，单位为菌落形成单位每克(CFU/g)或菌落形成单位每毫升(CFU/mL);N 培养基平板微生物菌落平均数，单位为个;X一一母液稀释倍数。7 NY/T 3152.2一2017B.1 方法原理B.3 8.4 显微镜。锥形瓶。滴管。载玻片格CRP80小格
16、)的微生上微生物的统计应有统一数右线，以减少误差。即位于本格上定计人相应的格中。样品浓度或含量按式(8.1)计算。附录B(资料性附录)血球计数板法1)，用滴管吸取表面张力充满、右上、中间的5个中方至少计数2次，对沉降在格线则数上线不数下线，数左线不，本格的下线和右线上的微生物按规C=N X 25/5 X 10 X W X X.(8.1)式中:c-一样品浓度或含量，单位为个每毫升(个/rnL);1)本方法适用于体型较大的微生物，如真商袍子、酵母、多角体病毒和原生动物等计数.但真菌抱子、薛母、多角体病毒和原生动物等计数不仅限于本方法.8 N-5个中方格的微生物总数;X一样品稀释倍数。NY/T 31
17、52.2-2017 9 NY/T 3152.2-2017 C.1 方法原理附录C(资料性附录)荧光定量PCR法1)，其荧光信号强度与dsDNA的数量累积曲线，最后通过C.2 C.3 C.4 C.4.1目引物设i咽即刻.&2远E守主主雪翌主聋舅舅勒晦咀设计引物，使引物Tm值为62C样品基因组司且也叫田咽圃样严号孟自毒品白lII!Jl金。遇因组提取试剂盒操作说明提取样品特异基因片段扩增.量取的棚.血，晴噩噩圈圈圈;PfICR圳屏基因片段，采用两步法扩增，PCR扩增体系如下F:r胃.监25画画国酶两黯留lfrr2.5P2L(20mmol/L)，寻|物l(Pl)、引物2(P2)各lL，模稠-dH20补
18、足体i国反应条件为:94C预变性5min;(94C变性，30s;60C退火延伸30s)用啕回啊10min;4C保存。电泳检测:PCR产物使用1%琼脂糖凝胶电泳检测，确保无非特异性扩增并回收扩增片段。TA克隆:按照TA克隆标准步骤将回收后的扩增产物连接至pMD18T载体并转化至大肠杆菌DH5a感受态中;LB抗性平板CAmp100)结合蓝白斑筛选，挑取单克隆转移至液体LB(Amp100)中，37C摇床培养12h，按照质粒提取试剂盒说明书提取质粒并送至测序公司进行测序验证，确定目的基因片段与载体相连且序列正确。C.4.2 标准品模板的拷贝数确定1)本方法适用于细菌、真菌和病毒等计数.但细菌、真菌和病
19、毒等计数不仅限于本方法.10 NY/T 3152.2-2017 使用Nanodrop或其他仪器测定含目的基因片段的载体浓度，按式Cc.1)计算目的基因拷贝数CCopies/L)。Q=6.02XW3 XCX10-/LX660.Cc.1)式中:Q一一基因拷贝数，单位为拷贝数每微升CCopies/L);C一-DNA浓度，单位为纳克每微升Cng/L);L一-DNA长度，单位为碱基对Cbp)。将含目的基因片段的载体用ddH20进行10倍梯度稀释，稀释为10Copies/L 108 Copies/L，此即为标准品模板，一20.C保存样品。C.5 标准曲线绘制与扩增效率计算标准品模板的qPCR扩增:采用20
20、LqPCR反应体系，两步法进行扩增，具体为:标准品模板2L，SYBR Green Supermix 10L，51物l和引物2各1L，加元菌双蒸水补足体和、至20卢反应条件为:9S.C预变性Smin;C9S.C变性，10s;60.C退火延伸30s)40个循环;溶解曲线采集程序以程序默认为准，其中，每个稀释度的样品做5个重复，阴性对照使用元模板的无菌双蒸水。标准曲线的绘制:确定溶解曲线为单峰，且峰值温度在80.C90.C，确定溶解曲线峰值;并确定扩增生成Ct值在lS3S区域间，同一个样品不同重复间的Ct值差异小子O.趴在满足此条件的情况下，以标准品模板的拷贝数为横坐标，Ct值为纵坐标，绘制标准曲线
21、，并求出标准曲线线性方程。扩增效率(E)计算:E的范围应为90%1l0%，保证。CR每完成一个循环，底物浓度扩增一倍;E按式Cc.2)计算，E=(10-1/-1)X 100.Cc.2)式中:E一一扩增效率，单位为百分率C%);h 一一标准曲线斜率。C.6 样品微生物的定量C.6.1 样晶总基因组DNA的提取根据基因组提取试剂盒说明书提取样品基因组总DNA。C.6.2 样品微生物计鼓l!.(提取的样品基因组总DNA为模板，进行qPCR反应。qPCR反应条件与C.S一致，根据反应生成的Ct值和已建立的标准曲线，计算各目的基因片段的拷贝数，从而评估样品中待测物种的丰度。11 NY/T 3152.2-
22、2017 参考文献1GB 4789.2-2010食品安全国家标准食品微生物学检验菌落总数测定.2/1L 2743-2015甘煎白色条纹病菌检验检疫技术规程实时荧光定量PCR法.3SN/1l 2358-2009 国境口岸炭瘟芽抱杆菌荧光定量PCR检测方法.12 toN|N.NmF的H问Z中华人民共和国农业行业标准微生物农药环境凤险评价试验准则第2部分:蜜蜂毒性试验NY/T 3152.2-2017 晤中国农业出版社出版(北京市朝阳区麦子店街18号楼(邮政编码100125网址)北京印刷一厂印刷新华书店北京发行所发行各地新华书店经销*晤峰开本880rnrnX1230rnrn 1/16 印张1.25 字数25千字2018年5月第1版2018年5月北京第1次印刷书号16109 4423 定价30.00元祷*版权专有侵权必究举报电话(010)65005894