《NY∕T 564-2016 猪巴氏杆菌病诊断技术(农业).pdf》由会员分享，可在线阅读，更多相关《NY∕T 564-2016 猪巴氏杆菌病诊断技术(农业).pdf（15页珍藏版）》请在taowenge.com淘文阁网|工程机械CAD图纸|机械工程制图|CAD装配图下载|SolidWorks_CaTia_CAD_UG_PROE_设计图分享下载上搜索。
1、ICS 11.220 B 41 NY 中华人民共和国农业行业标准NY/T 564-2016 代替NY/T564-2002 猪巴氏杆菌病诊断技术Diagnostic techniques for swine pasteurellosis 2016-10一26发布2017-04一01实施中华人民共和国农业部发布NY/T 564-2016 目。昌本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。本标准代替NY/T564-2002(猪巴氏杆菌病诊断技术。与NY/T564一2002相比，除编辑性修改外，主要技术变化如下:一一范围部分增述了多杀性巴氏杆菌定种的PCR鉴定方法和英膜定型的多重PCR鉴定方法的
2、适用性(见1);一一临床诊断及病理剖检部分参照兽医传染病学)C陈溥言主编)中相关描述进行了修改(见2矛日3);一一病原分离部分删除了不适宜多杀性巴氏杆菌生长的麦康凯琼脂培养基，并将改良马丁琼脂培养基和马丁肉汤培养基改为更适宜多杀性巴氏杆菌生长的膜蛋白大豆琼脂培养基和膜蛋白大豆肉汤培养基(见4.1.1.1);一一新增了定种PCR鉴定方法(见4.的;一一一英膜血清型鉴定部分在原有的间接血凝试验CCarter氏英膜定型法)的基础上又新增了另一种选择多重PCR英膜定型法，并对多杀性巴氏杆菌间接血凝试验程序表也进行了完善(见4.5.1.3和4.5.2);一一附录A部分增添了膜蛋白大豆琼脂培养基CTSA)
3、和膜蛋白大豆肉汤培养基CTSB)的制备方法(见附录A.6和A.7)。本标准由农业部兽医局提出。本标准由全国动物卫生标准化技术委员会CSAC/TC181)归口。本标准起草单位:中国兽医药品监察所。本标准起草人:蒋玉文、张援、李建、李伟杰、魏财文。本标准的历次版本发布情况为:一一-NY/T564-2002。I NY/T 564-2016 猪巴氏杆菌病诊断技术1 范围本标准规定了猪巴氏杆菌病诊断的技术要求。本标准所规定的临床诊断、病理剖用于多杀性巴氏杆菌种的鉴定;的鉴定;琼脂扩散沉2 临床诊断潜伏期ld2.1 最急性型2.1.1 突然2.1.2 2.1.3 势，伸2.1.4 2.2.1 2.2.3
4、2.3 慢性型2.3.1 持续性2.3.2 2.3.3 关节肿胀。2.3.4 食欲不振，进行性营养3 病理剖检3.1 最急性型适用于猪巴氏杆菌病的诊断。定种PCR适适用于多杀性巴氏杆菌英膜血清型心跳加快。难，常做犬坐姿疼痛，昕诊有3.1.1 皮肤有红斑;切开颈部皮肤时，可见大量胶冻样蛋黄或灰青色纤维素性结液;咽喉部及其周围结缔组织出血性浆液浸润;全身勃膜、浆膜和皮下组织有大量出血点;水肿可自颈部蔓延至前肢。3.1.2 全身淋巴结出血，切面红色。3.1.3 心外膜和心包膜有小出血点。3.1.4 肺急性水肿。3.1.5 脾有出血，但不肿大。l NY/T 564-2016 3.1.6 胃肠黠膜有出血
5、性炎症变化。3.2 急性型3.2.1 胸腔及心包积液;胸腔淋巴结肿胀，切面发红，多汁;全身茹膜、浆膜实质器官和淋巴结出血性病理变化。3.2.2 纤维素性肺炎，肺有不同程度的肝变区，周围伴有水肿和气肿，病程长的肝变区内还有坏死灶，肺小叶间浆液浸润，切面呈大理石样纹理;胸膜常有纤维素性附着物，严重的胸膜与病肺粘连。3.2.3 支气管、气管内含有多量泡沫状茹液，蒙古膜发炎。3.3 慢性型3.3.1 肺肝变区扩大井有黄色或灰色坏死灶，外面有结缔组织包裹，内含干酷样物质，有的形成空洞并与支气管相通。3.3.2 心包与胸腔积液，胸腔有纤维素性沉着。3.3.3 肋膜肥厚，与病肺粘连;在肋间肌、支气管周围淋巴
6、结、纵隔淋巴结以及扁桃体、关节和皮下组织可见有坏死灶。4 病原分离鉴定4.1 病原分离4.1.1 材料4.1.1.1 培养基膜蛋白大豆琼脂培养基CTSA，配制见A.6)、膜蛋白大豆肉汤培养基CTSB，配制见A.7)。4.1.1.2 试剂绵羊脱纤币1、绵羊裂解血细胞全血、健康动物血清。4.1.2 器材二级生物安全柜、恒温培养箱C3rC)。4.1.3 操作猪濒死或死亡后，无菌采取病死猪的心血或肝脏组织，接种含4%健康动物血清的TSB，置350C3rc培养16h24 h。取TSB培养物划线接种含0.1%绵羊裂解血细胞全血和4%健康动物血清的TSA平板，置350C3rc培养16h24人挑取在TSA平板
7、上生长的光滑圆整的单个菌落传代接种含0.1%绵羊裂解血细胞全血和4%健康动物血清的TSA平板，置350C3rc培养16h24 h，获得纯培养物。4.2 病原鉴定4.2.1 材料4.2.1.1 待检样品分离的细菌纯培养物。4.2.1.2 培养基培养基质量满足GB/T 4789.28规定的要求，按附录A方法配制改良马丁琼脂(配制方法见A.的、马丁肉汤(配制方法见A.5)、麦康凯琼脂(配制方法见A.13)、运动性试验培养基(配制方法见A.的。4.2.1.3 试剂葡萄糖、展糖、果糖、半乳糖、甘露醇、鼠李糖、戊醒糖、纤维二糖、棉子糖、菊糖、赤薛糖、戊五醇、M肌醇、水杨昔糖发酵小管(配制方法见A.10)、
8、呵|睐试剂(配制方法见A.11)、氧化酶试剂(配制方法见A.12)、绵羊脱纤血、绵羊裂解血细胞全血、健康动物血清、革兰氏染色液、瑞氏染色液、1%蛋白陈水(制备方法见A.9)。4.2.2 器材二级生物安全柜、显微镜、恒温培养箱(3rc)。4.2.3 镜检样品的制备NY/T 564-2016 取病变组织肝或脾的新鲜切面在载玻片上压片或涂抹成薄层;用灭菌剪刀剪开心脏，取血液进行推片，或取凝血块新鲜切面在载玻片上压片或涂抹成薄层;培养纯化的细菌从菌落挑取少量涂片。4.2.4 病原鉴定4.2.4.1 培养特性4.2.4.1.1 多杀性巴氏杆菌为兼性庆氧菌，最适生长温度为350C3rc。在改良马丁琼脂平皿
9、(含有0.1%绵羊裂解血细胞全血及4%健康动物血清)上有单个菌落，肉眼观察光滑圆整，直径2mm3mm，半透明，呈微蓝色。在低倍显微镜45。折光下观察，有虹彩，可见蓝绿色荧光(Fg菌落型)或情红色荧光(Fo菌落型)。4.2.4.1.2 改良马丁琼脂斜面生长纯粹的培养物，呈微蓝色菌苔或菌落。4.2.4.1.3 马丁肉汤培养物呈均匀混浊，不产生菌膜。4.2.4.1.4 麦康凯琼脂平皿上不生长。4.2.4.1.5 含10%绵羊脱纤血的改良马丁琼脂平皿上生长的菌落不出现榕血。4.2.4.2 显微镜鉴定4.2.4.2.1 样品的干燥和固定:挑取菌落，涂于载玻片，采用甲醇固定或火焰固定。4.2.4.2.2
10、染色及镜检:甲醇罔定的镜检样品进行瑞氏或美蓝染色。镜检时，多杀性巴氏杆菌呈两极浓染的菌体，常有英膜。火焰固定的镜检样品进行革兰氏染色，镜检时多杀性巴氏杆菌为革兰氏阴性球杆菌或短杆菌，菌体大小为(0.20.4)mX(0.62.5)m，单个或成对存在。4.2.4.3 生化鉴定特性4.2.4.3.1 接种于葡萄糖、震糖、果糖、半乳糖和甘露醇发酵管产酸而不产气。接种于鼠李糖、戊醒糖、纤维二糖、棉子糖、菊糖、赤辞糖、戊五醇、M-肌醇、水杨昔发酵管不发酵。4.2.4.3.2 接种于蛋白陈水培养基中，可产生呵|睐。4.2.4.3.3 产生过氧化氢酶、氧化酶，但不能产生尿素酶、-半乳糖背酶。4.2.4.3.4
11、 维培(VP)试验为阴性。4.3 毒力测定4.3.1 材料4.3.1.1 待检样品从病料中分离的细菌纯培养物。4.3.1.2 培养基马丁肉汤。4.3.1.3 试验动物18 g22 g小白鼠。4.3.2 器材二级生物安全柜、恒温培养箱。4.3.3操f乍取马丁肉汤24h培养物，用马丁肉汤稀释为1000CFU/mL，皮下注射18g22 g小鼠4只，每只0.2 mL;另取相同条件小鼠2只，每只皮下注射马丁肉汤0.2mL作为阴性对照。3 NY/T 564-2016 4.3.4 结果判定观察3d5 d，阴性对照组小鼠全部健活试验方成立。注射细菌培养物组小鼠全部死亡者为阳性。4.4 培养物定种PCR鉴定4.
12、4.1 材料4.4.1.1 待检样品从病料中分离的细菌纯培养物。4.4.1.2 试剂的一般要求除特别说明以外，本方法中所用试齐|纯水。4.4.1.41.5%琼脂糖将1.5g琼月却后加人澳化根据kmtI4.4.1.7阳多杀性巴4.4.2 器材二级生物安4.4.3 样品处理对分离鉴定和存，送检。4.4.4 基因组DNA的下列方法任择其一，DNA 12000 r/min离心1min，上b)取纯培养的单菌落接种含0.1%T 6682规定的灭菌双蒸水或超水浴10min，冰浴5min,马丁肉汤，(37士l)OC过夜培养，取1.0mL菌液加入1.5 mL离心管，12000r/min离心1min，弃上清，加人
13、100L无菌超纯水，反复吹吸重悬，沸水浴10min，冰浴5min,12 000 r/min离心1min，上清作为基因扩增的模板。4.4.5 反应体系及反应条件4.4.5.1 对4.4.4提取的DNA进行扩增，每个样品50L反应体系，见表C.1。4.4.5.2 样品反应管瞬时离心，置于PCR扩增仪内进行扩增。950C预变性5mi口，950C变性30s,550C 退火30s，720C延伸1min,30个循环，720C延伸10min，结束反应。同时设置阳性对照及阴性对照。PCR产物用1.5%琼脂糖凝胶进行电泳，观察扩增产物条带大小。若不立即进行电泳，可将PCR产物置于-200C冻存。4 NY/T 5
14、64-2016 4.4.6 凝胶电泳4.4.6.1 在1XTAE缓冲液中进行电泳，将4.4.5.2的扩增产物、DL2000 DNA Marker分别加入1.5%琼脂糖凝胶孔中，每孔加扩增产物10L。4.4.6.2 80 V100 V电压电泳30min，在紫外灯或凝胶成像仪下观察结果。4.4.7 结果判定4.4.7.1 试验成立的条件当阳性对照扩增出约460bp的片段，阴性对照未扩增出片段时，试验成立。4.4.7.2 阳性判定符合4.4.6.1的条件，4.4.7.3 阴性判定符合4.4.6.1的巴氏杆菌。4.5.1.1.D.3)。4.5.1.2 二级4.5.1.3 抗原对照:致敏、间接血凝试验程
15、序，反应物2 血清稀释倍数D 10 含0.3%甲|隆0.21 溶液生理盐水血清O.4 0.2J 1%致敏红细胞O.2 0.2 1%新鲜红细胞3 4 3 6 7 20 40 80 160 320 0.21 0.21 0.21 0.21 o.21 吨0.2J、0.2J吨。.2J飞0.2J吨0.2J0.2 0.2 O.2 0.2 0.2 4.5.1.3.4 充分振荡小试管后，置室温1h2 h判定结果。8 640 0.21 吨O.2J吨弃去O.2 O.2 胞(配制见单位为毫升抗原红细胞血清|对照对照对照5 o.2 o.2 I o.2 O.2 O.2 I 0.2 3 NY/T 564-2016 4.5.
16、1.4 结果判定4.5.1.4.1 判定标准:每个试管按其管底红细胞的凝集现象分别记为#、+、十+、十及#:红细胞凝集形成坚实的凝块，边缘不整齐。十+:凝集的红细胞平铺管底，但有卷边或缺口。+:凝集的红细胞平铺管底。+:红血球凝集面积较小，有狭窄的增厚边缘或中心的红细胞凝集。一红细胞形成小的光滑圆盘。4.5.1.4.2 试验成立的条件:当血清对照、新鲜红细胞对照、抗原对照均不出现凝集，且被检菌株抗原致敏红细胞仅与一种定型血清出现，+或以上凝集时，试验成立。4.5.1.4.3 阳性判定:符合4.5.1.4.2的条件，被检菌株抗原致敏红细胞与哪种定型血清出现+或以上凝集，即可判定被检菌株为该英膜血
17、清型。4.5.1.4.4 阴性判定:符合4.5.1.4.2的条件，被检菌株抗原致敏红细胞与任一定型血清均未出现+或以上凝集，即可判定被检菌株为英膜A型、英膜B型和英膜D型以外的其他英膜血清型或不能定英膜型的多杀性巳氏杆菌。4.5.2 多重PCR英膜定型法4.5.2.1 材料4.5.2.1.1 待检样品:从病料中分离的多杀性巳氏杆菌纯培养物。4.5.2.1.2 通用试剂:4.4.1.2-4.4.1.5的试剂适用于本方法。4.5.2.1.3 阳性对照:英膜A型、英膜B型或英膜D型多杀性巴氏杆菌。4.5.2.1.4 阴性对照:英膜E型或英膜F型多杀性巴氏杆菌或除多杀性巴氏杆菌以外的其他细菌。4.5.
18、2.1.5 引物:根据编码多杀性巴氏杆菌A型、B型和D型不同的基因设计引物，商业合成，序列见表B.204.5.2.2 器材二级生物安全柜、PCR仪、电泳仪和凝胶成像仪。4.5.2.3 基因组DNA的提取细菌基因组的提取同4.4.4。4.5.2.4 英膜多重PCR反应体系及反应条件4.5.2.4.1 每个样品建立50L反应体系，见表C.20 4.5.2.4.2 反应管加入反应液后，瞬时离心，置于PCR扩增仪内进行扩增。950(预变性10min,950(变性30s,550(退火30s,720(延伸1min,30个循环，720(延伸10min结束反应。同时设置阳性对照及阴性对照。PCR产物用1.5%
19、琼脂糖凝胶进行电泳，观察扩增产物条带大小。若不立即进行电泳，可将PCR产物置于200(中冻存。4.5.2.5 琼脂糖凝胶电泳按4.4.6的方法进行。4.5.2.6 结果判定4.5.2.6.1 试验成立的条件:当英膜A型阳性对照扩增出约1044bp的片段，英膜B型阳性对照扩增出约760bp的片段，英膜D型阳性对照扩增出约657bp的片段，阴性对照未扩增出片段时，试验成立。4.5.2.6.2 阳性判定:符合4.5.2.6.1的条件，被检样品扩增出约1044怜的片段，判定为英膜A型;扩增出约760bp的片段，判定为英膜B型;扩增出约657bp的片段，判定为英膜D型。4.5.2.6.3 阴性判定:符合
20、4.5.2.6.1的条件，被检样品若未扩增出4.5.2.6.2所描述的各片段，判定NY/T 564-2016 为英膜A型、英膜B型和英膜D型lV.外的其他英膜血清型或不能定英膜型的多杀性巴氏杆菌。4.6 菌体血清型鉴定琼脂扩散沉淀试验(Heddleston氏菌体定型法)4.6.1 材料4.6.1.1 待检样品从病料中分离的多杀性巴氏杆菌纯培养物。4.6.1.2 多杀性巴氏杆茵茵体定型血清4.6.1.3 试剂生理盐水、8.5%氯化铀溶液、优级琼脂(DIFCO)粉、1%硫柳隶榕液。4.6.2 抗原制备取一支改良马丁琼脂中管斜面24h培养物，用3mL生理盐水洗一下，置于1000C水浴1h,4 000
21、 r/mm离心30mn，上清液即为琼脂凝胶免疫扩散试验抗原。4.6.3 菌体血清型鉴定取琼脂1.0g加8.5%氯化饷溶液100mL，力o热榕化。榕化后再加1mL1%硫柳束，混合凉至600C左右，倒人平皿内，琼脂厚度2.5 mm3 mm，琼脂凝固后用7孔梅花形打孔器打孔。孔径4mm，孔与孔中心距离为6mm，中心孔加人被检抗原，外周1孔5孔加入定型血清，第6孔加入生理盐水为阴性对照。置于(37土l)OC孵育24h48 h判定结果。4.6.4 结果判定将琼脂板置于日光灯或侧强光下观察，抗原与生理盐水孔之间不出现沉淀线，则试验成立。抗原与标准定型血清之间出现明显的沉淀线，即判定该血清型为待检多杀性巴氏
22、杆菌的菌体血清型。5 诊断判定5.1 疑似符合第2章中咳嗽、呼吸困难等临床表征，且符合第3章中肺脏水肿、肝变或坏死等病理变化者，可判定为猪巴氏杆菌病疑似病例。5.2 确诊同时满足以下3个条件者，可确诊猪巴氏杆菌病病例:a)符合5.1疑似病例的判定;b)经4.1、4.2确定病原为多杀性巴氏杆菌;或4.2结果部分不符合，但4.4结果阳性;c)4.3结果阳性。5.3 芙膜血清型鉴定按4.5.1.4或4.5.2.6判定被检病原的英膜血清型。5.4 菌体血清型鉴定按4.6.4判定被检病原的菌体血清型。7 NY/T 564-2016 A.1 牛肉汤的配制将牛肉除去脂肪、筋膜，用绞或耐酸陶瓷双层锅加温至65
23、拌。煮沸完成后，捞出肉渣汤混合即成。制成的肉30 min40 min,间。除去脂肪和浮化铀使成弱酸性，A.4 改良马丁琼脂A.4.1 配方牛肉汤(配制见A.l)改良猪胃消化液(配制见A.氯化纳琼脂粉A.4.2 制备方法附录A(规范性附录)培养基的制备合，搅拌均匀。用不锈钢全部过程均应不断搅肉渣中压榨出的肉将牛肉汤、改良猪胃消化液、氯化纳和琼脂粉混合，加热溶解。待琼脂完全榕化后，以氢氧化铀溶液调整pH为7.47.6。以卵白澄清或凝固沉淀法沉淀。分装于试管或中性玻璃瓶中，以121.C灭菌30 min40 min A.5 马丁肉汤A.5.1 配方牛肉汤(配制见A.l)8 500 mL NY/T 56
24、4-2016 猪胃消化液(配制见A.3)500 mL 氯化纳2.5 g A.5.2 制备方法将A.5.1材料混合后，以氢氧化铀榕液调pH7.67.8，煮沸20mi口TIl让m、白冷却沉淀抽取上清，经滤纸或绒布滤过滤液应为澄清、淡黄色。按需要分装，经121.C灭菌30min 40 min.pH应为7.27.6。A.6 膜蛋白大豆琼脂培养基(TSA)A.6.1 配方膜蛋白脏、大豆蛋白陈氯化铀琼脂粉去离A.6.2制将A.A.7 A.7.1 A.8 A.9 A.9.1 配方蛋白陈.氯化铀5 g 蒸馆水1 000 mL A.9.2 制备方法灭菌40min，置于室40 min。将A.9.1材料混合，加热溶
25、解，调整pH7.4。煮沸滤过，分装于中性容器中，121.C灭菌20min.A.10 糖发酵培养基每种糖(或醇)按质量浓度为1%比例分别加入到装有1%蛋白陈水(配制见A.9)的瓶中。加热府解后，按0.1%的比例加入1.6%澳甲酷紫指示剂。摇匀后，分装小试管(内装有倒置小管)，每支大约6mL，流通蒸汽灭菌3次，每天1次，每次30min.9 NY/T 564-2016 A.11 琵基质试验用试剂一一用|跺试验试剂(欧-.皮Ehrlich-80ehme二氏试剂)A.11.1 配方对二甲氨基苯甲醒95%乙醇1.0g 95 mL 纯浓盐酸20mL A.11.2 制备方法将对二甲氧基苯甲醒榕于乙醇中，然后慢
26、慢加进盐酸。此试剂应如量配制，并保存于冰箱内。A.12 氧化酶试剂(1%盐酸四甲基对苯二肢溶液)将1.0g的盐酸囚甲基对苯二胶洛于100mL的去离子水中。A.13 麦康凯琼脂培养基A.13.1 配方蛋白陈际陈17 g 猪胆盐(牛胆盐或羊胆盐)氯化铀琼脂粉蒸馆水(或去离子水)乳糖0.01%结晶紫水溶液赘0.5%中性红水榕液婪A.13.2 制备方法将蛋白陈、际陈、胆盐和氧化铀榕解于400mL蒸馆水中，校正pH为7.2。将琼脂粉加人600mL 蒸馆水中，加热溶解。将两液合井，分装于烧瓶内，1210C高压灭菌15min，备用。临用时加热融化琼脂，趁热加乳糖，冷至500C550C时，加人结晶紫和中性红水
27、榕液，摇匀后倾注平板。Fbgbgb nUFhJvphd17 g 100 mL 10 g 10 mL 5mL A.14 电泳缓冲液(TAE)50XTAE储存液:分别量取NazEDTA.2HzO 37.2 g、冰醋酸57.1mL、Tris Base 242 g，用一定量(约800mL)的灭菌双蒸水榕解。充分混匀后，加灭菌双蒸水补齐至1000mL。lXTAE缓冲液:取10mL储存液加490mL蒸馆水即可。铸配好后须高压灭菌。10 附录B(规范性附录)多杀性巴氏杆菌kmtI基因扩增引物序列及多杀性巴氏杆菌多重PCR芙膜定型基因扩增引物序列B.1 多杀性巴氏杆菌kmtl基因扩增引物序列见表B.l。表B.
28、1 多杀性巴氏杆菌kmtJ基因扩增引物序列检jU!的引物序列(5-。t上游引物:ATCCGC TAT TTA CCC AGT GG 多杀性巴氏杆菌定种l自下游引物:GCTGTA AAC GAA CTC GCC AC 8.2 多杀性巴氏杆菌多重PCR芙膜定型基因扩增引物序列见表B.2。表8.2多杀性巴氏杆菌多重PCR英膜定型基因扩增引物序列检91日的引物序列(5-3)A型上游引物:TGC CAA AA T CGC AGT CAG 下游引物:1寸、GCCA TCA TTG TCA GTG 英膜定型B型上游引物:CATTTA TCC AAG CTC CAC C 下游引物:GCC CGA GAG Tr
29、CAA TCC D型上游引物:TT A CAA AAG AAA GAC T AG GAG CCC 下游引物:CATCTA CCC ACT CAA CCA TAT CAG NY/T 564-2016 扩增大小，bp460 扩增大小，bp1044 760 657 11 NY/T 564-2016 附录C(规范性附录)多杀性巴氏杆菌kmtl基因扩增反应体系及多杀性巴氏杆菌多重PCR芙膜定型基因扩增反应体系C.1 多杀性巴氏杆菌kmtl基因见表C.l。见表C.2。1)模板为菌落时，休系中超纯水的体积为24.5L;模板为质粒时，体系中超纯水的体积为23.5Lo 2)模板为菌落时，用10J.lL Tip头
30、蘸取少许细菌，沿PCR管壁搅拌;模扳为质粒时，体系巾筷板的体积为1L。12 附录D(规范性附录)多杀性巴氏杆菌芙膜定型抗原及致敏红细胞的制备方法D.1 多杀性巴氏杆菌英膜抗原的制备D.1.1 材料D.1.1.1 改良马丁琼脂。D.1.1.2 生理盐水、pH6.0磷酸盐缓冲盐水。D.1.1.3 透明质酸酶。D.1.2 方法NY/T 564-2016 D.1.2.1 1支改良马丁琼脂斜面中管(30mmX 230 mm)的7h16 h生长的培养物，用3mL灭菌生理盐水洗下，置于5 60C水浴中加热30min.8 000 r/min离心15min.取上清液，即为英膜抗原。D.1.2.2 对勃液型菌株，
31、应采用透明质酸酶进行预处理。制备方法:1支改良马丁琼脂斜面中管7h 16 h的培养物，用3mL pH 6.0磷酸盐缓冲盐水洗下，加人1mL(含15IU)的透明质酸酶溶液(透明质酸酶用pH6.0的磷酸盐缓冲盐水稀释)。混匀后，置于(37士l)OC水浴中3h4 h.再用8000r/min离心15min.上清液即为英膜抗原。D.2 新鲜红细胞的制备D.2.1 材料绵羊脱纤血。D.2.2 方法新鲜绵羊脱纤血用6倍8倍体积的生理盐水洗3次，每次2000r/min离心15min，最后一次收集的红细胞，恢复到原血量的一半。置于20C80C保存.2d内使用。D.3 致敏红细胞的制备D.3.1 材料D.3.1.1 英膜抗原(配制见0.1)。D.3.1.2 新鲜红细胞(配制见0.2)。D.3.1.3 生理盐水。D.3.2 方法取英膜抗原3mL.加人0.2mL洗净的红细胞，混合均匀后置于(3 7士l)OC中作用2h.离心弃上清，再用10mL生理盐水洗1次，最后悬浮于20mL生理盐水中，配制成1%的致敏红细胞悬液。13