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1、ICS 65.020.30 B 41:才H中华人民共和国水产行业标准SC/T 7240一2020牡肺癌殇病毒1型感染诊断规程Code of diagnosis for infection with Ostreid herpesvirus 1 2020-08-26发布2021-01-01实施中华人民共和国农业农村部发布本标准由全国水产标准化技术委员会CSAC/TC156)归口。本标准起草单位:中国水产科学研究院黄海水产研究所。本标准主要起草人，自昌明、辛鲁生、杨冰、万晓援、王崇明、李晨、梁艳、黄侥。SC/T 7240-2020 I SC/T 7240-2020 牡蜘癌摩病毒1型感染诊断规程范围本
2、标准给出了牡甥炮殇病毒1型(Ostreidherpesvirus 1,OsHV-l)感染的术语和定义、缩略语、试剂和材料、器材和设备、临床症状与表现，规定了采样、组织病理检测、PCR检测、透射电镜检测及综合判定。本标准适用于牡妨痕1$病毒l刑盹甘、气!在r.:始由圣nI2 规范性引用文件下列文件对于升凡是不注日期的引SC/T 7011 SC/T 7205.3 4 下列bp DAFA DNA,dNTPs,EDTA,Epon812 PCR,Tq酶:TE,Tris Tris:三经甲5 试剂和材料5.1 除非另有说明，标准中使用5.2 无水乙醇。5.3 TE缓冲液见附录A中的A.105.4 抽提缓冲液
3、见A.20 5.5 蛋白酶K见A.305.6 10 mol/L乙酸饺见A.4。5.7 平衡盼。5.8 盼/氯仿/异戊醇(25 24 1)。5.9 氯仿/异戊酶(24 1)0 5.10 1 X电泳缓冲液见A.505.11 70%乙醇见A.60 xative)l SC/T 7240-2020 5 12 削TPs(各2.5 mmol/L)，生化试剂，含dATP、dTTP，dGTP，dCTP各2.5mmol/L的混合物.-20C 保存，用于PCR。5.13 10XPCR缓冲液生化试剂，无Mg随TaqDNA聚合酶提供，一20C保存。5.14 MgCl,(25 mmol/L)生化试剂，一20C保存。5.1
4、5 Taq DNA聚合酶(5U/L)，生化试剂.-20C保存。5.16 正向引物C2ClOmol/L),5-CTCTTTACCATGAAGATACCCACC-3.-20C保存。5.17 反向寻|物C6ClOmol/L)，5-GTGCACGGCTTACCATTTTT-3.一20C保存。5.18 PCR检测阳性对照为己知感染牡蜘痕王若病毒1型且PCR结果显示阳性的贝类组织样品，一70C保存。5.19 PCR检测阴性对照为己知未感染牡妨痕12;病毒l型且PCR结果显示阴性的贝类组织样品.-70C 保存。5.20 PCR检测空白对照以灭菌双蒸水作模板。5.21 琼脂糖。5.22 DNA分子量标准。5
5、23 筛绢(600目)过滤海水。5.24 DAFA固定液见A.7囚5.25 i号木精染色液见A.8。5.26 1%伊红储存液见A.9。5.27 1%焰红储存液见A.10，5.28伊红焰红染色液见A.ll。5.29 95%乙酿。5.30 85%乙应见A.12。5.31 80%乙醇见A.13,5.32 75%乙醇见A.14。5.33 50%乙醇见A.15.5.34 二甲苯。5.35 石蜡(熔点52C54C)。5 36 中性树JJlt 5.37 2.5%戊二ll1i见A.16.5.38 1%饿酸储存液见A.17.5.39丙酬。5.40 90%丙酣见A.18.5.41 70%丙酣见A.19.5.42
6、50%丙丽见A.20。5.43 Epon812包埋剂。5.44 醋酸铀染色液见A.2 1，5.45 拧核酸铅染色液见A.22。6 器材和设备6.1 石蜡切片机。6 2 组织、脱水机。SC/T 7240-2020 6.3 包埋机。6.4 染色机。6.5 展片水浴锅。6.6 恒温箱。6.7 平板烘片机。6.8 显微镜。6.9 PCR仪。6.10 电泳仪。6.11 水平电泳梢。6 12 紫外观察仪或凝胶成像仪。6.13 高速离心机。6.14 微量移液器。6 15 超薄切片机。6.16 透射电子显微镜。7 临床症状与表现患病贝类幼虫表现活动力减弱，摄食减少，沉人容器底部;稚贝、幼贝和成贝表现双壳闭合不
7、全，参见附录B，B 采样8.1 采样对象牡妨、扇贝、蛤和蜡类等易感双壳贝类，参见附录B。优先选择濒死或双壳闭合不全的贝类样本。82 采样数量、方法和保存运输应符合SC/T7205.1-2007中附录B的要求。8.3 样品采集8.3.1 幼虫(附着前)使用600目的筛绢过滤后取幼虫整体，稚贝(附着后至2mm)和幼贝(2mm-3 cm)取内脏团，成贝(3cm)取肝膜腺、媳和外套膜。8.3.2 适用于组织病理检测的样品包括郎、外套膜和肝膜腺。取2mm-5 mm厚组织样本，立即保存于DAFA固定液中，固定12h-24 h后，可进行组织病理检测或转移到70%乙晖中暂存。8.3.3 适用于透射电镜检测的样
8、品包括银、外套膜和肝膜腺。取0.5mm3-1 mm3的组织块，立即浸入2.5%戊二M固定液中，4C固定2h-4 h后，可进行透射电镜检测。8.3.4 适用于分子生物学检测的样品包括鲸和外套膜。取30mg-50 mg组织，立即进行DNA提取或暂时保存于20C冰箱。9 组织病理检测9 1 脱水将组织块置于脱水机中或依次浸入盛有不同浓度乙醇溶液的容器中。流程如下，75%乙醇(1h 45 min)85%乙醇(1h 45 min)85%乙醇(1h 45 min)95%乙酶(45min)95%乙醇(45min)无水乙醇(45min)无水乙醇(45min)。9 2 透明脱水后的组织块置于脱水机中或依次浸入盛
9、有无水乙E事:二甲苯(11)混合液和二甲苯溶液的容器中。流程如下:元水乙醇:二甲苯(1,1)(25 min)二甲苯(20min)二甲苯(20min)。9.3 浸蜡3 SC/T 7240-2020 恒温箱温度调节至高于石蜡熔点3.C。流程如下透明后的组织块依次浸入2个盛有融化石蜡的容器中各80min.9.4 包埋将包埋机或恒温箱温度调节至高于石蜡熔点3.C进行熔蜡，将熔蜡倒入包埋盒，也可用折叠纸盒;用预温的辍子迅速夹取组织块，切面朝下平放在模具底部;轻轻提起模具，置于冰上使其冷却l凝固。9.5切片用蜡铲或刀片将包埋块四周修平，使上下两面平行，保留组织周围附着宽2mm-3 mm的石蜡。用石蜡切片机
10、切片，厚度5m。对每个石蜡包埋块至少切取2张不连续的切片。9.6 展片将切片平放阳性。10 11取30f1阳性对照、阴性对J!l!10.12加入2.5L20 10.13将溶液冷却至室温，加入两相。一甲苯(5min)(2 min)80%乙特苏木稍20 s)95%乙30 s)二甲苯1型感染疑似1 h。提取过程同时设50.C水浴3h，不时旋动。，于10000 r/min离心3min分离10.14水相移至新1.5mL离心管中，加入等体积盼/氮仿/异戊醇(25:24:1)，颠倒混合10min，于10 000 r/min离心1min分离两相.10.1 5 水相移至一新1.5mL离心管中，加入等体积氯仿/异
11、戊蹲(24:1)，颠倒混合10min，于10000r/min离心1min分离两相，10.16 水相移至一新1.5 mL离心宫中，加入100L10 mol/L乙酸馁，昆匀后，再加入两倍体积预冷无水乙酶(-20.C)混匀，-20.C放宣2人10000 r/min离心10min，弃上清液。10 1.7 用70%乙蹲(4.C)洗涤沉淀2次，每次10000r/min离心5min，倾去上消液，沉淀于室温l琼干。10.1 8 加人100L灭菌双蒸水溶解DNA.10 19 若DNA样品需要保存，可溶解于100LTE缓冲液中并保存于20.C冰箱。4 SC!T 7240-2020 10.1 10 可以采用同等抽提
12、效果的其他方法或使用商品化DNA抽提试剂盒。102 PCR扩增10.2.1 PCR反应体系:按照表l的要求，加入除Taq酶以外的各项试剂，配制成预混物，分装保存于一200C冰箱。临用前，加入相应体积的T叫酶，混匀，按1个反应体系/支分装到0.2mL PCR管中。分别加入各样品的模板DNA(浓度，50ng/L100 ng/Ll1L，同时设阳性对照、阴性对照和空白对照。表1PCR反应预混物所需试剂和组成试剂25L体系试剂终浓度10X PCR缓冲液(无Mg寸2.5L lX PCR缓冲液MgCI,(25 mmol/L)2.5L 2.5 mmol/L dNTP,(各2.5mmol/L)2.0L 200m
13、ol/L 引物C2(10mol/L)1.0L。.4mol/L引物C6(10 mol/L)1.0L 0.4mol/L 灭菌双蒸水14.7L Taq酶(5U/L)0.3L 1.5U 注25L体系挨板li11L，10.2 2 PCR扩增反应程序:将上述加有DNA模板的PCR管置于PCR仪中，按以下程序进行扩增:940C预变性5min;940C变性30s、570C退火30s、720C延伸30s,35个循环;720C延伸7min，4C保温。10.3 琼脂糖凝胶电泳及测序10.3.1 配制1.5%的琼脂糖凝胶，加入核酸染料，摇匀，制备琼脂糖凝胶。10 3.2 将5LPCR反应产物与lL6X载样缓冲液i昆匀
14、后加入到加样孔中。同时设立DNA分子量标准对照。10.3.3 使用1V/cm5 V/cm电压，在电泳缓冲液中进行电泳，使DNA由负极向正极移动。当载样缓冲液中澳盼蓝指示剂的色带迁移至琼脂糖凝胶的1/22/3处时停止电泳，将凝胶置于紫外观察仪或凝胶成像仪下观察或拍照。10.3.4 如果观察到预期大小条带，对PCR扩增产物进行测序。10.4 结果判定阳性对照在709bp处有特定条带、阴性对!fl在709bp处无条带旦空白对照不出现任何条带，实验结果有效。检测样品在709 bp处有条带，测序结果同参考序列(参见附录0)进行比较，序列符合的可判断待测样品为牡肠癌殇病毒1型PCR结果阳性，检测样品在70
15、9bp处无条带可判为PCR结果阴性。11 透射电镜检测111 脱水将固定的组织块依次浸入盛有不同浓度丙酬溶液的容器中。流程如下，50%丙阴(15min)70%丙酣05min)90%丙丽(15min)100%丙翻05min)100%丙隅05min)100%丙丽(15min)0 112 包埋纯丙酣:包埋flJ(2 1)(30 min)纯丙阴包理部IJ0 2)(370C,1 h 30 min)包埋剂(37C，2h)。113 固化依次在37C、45C和600C困化24ho 11.4切片使用超薄切片机70nm切片，电镜铜网捞片。11 5 染色醋酸铀染色15min，拧棕酸铅染色15mino 11.6 观察
16、5 SC/T 7240-2020 使用透射电子显微镜观察，电镜下牡蜘痕1jj病毒1型呈六边形或近圆形，能分辨衣壳、核衣壳和胞外病毒粒子3种不同发育阶段的病毒颗粒，参见附录E，11.7 结果判定在细胞内或细胞间质观察到11.6所述痕样病毒粒子，判定为牡妨癌痊病毒l型感染疑似阳性。12 综合判定12 1 疑似病例的判定符合以下条及以上，可判定为疑似病例-a)易感贝类出现临床症状与表现，且组织病理检测结果为阳性;b)PCR检j!IJ阳性;c)透射电镜下观察到典型范莎样病毒形态的病毒粒子。12 2 确诊病例的判定12.2.1 对OsHV-l易感的贝类宿主(参见附录囚，组织病理检测结果为阳性，PCR结果
17、显示阳性，且现tl序结果符合，判定为确诊病例。12.2.2 对其他贝类宿主，组织病理检测结果为阳性，PCR结果显示阳性、测序结果符合，且透射电镜检测结果阳性，判定为确诊病例。6 A 1 TE缓冲液(pH8.0)1 mol/L Tris HCl CpH 8 0.5 mol/L EDTA CpH 加水定容至高压蒸气灭菌乙酸镣水t1071定容至A.5 1 x电泳缓冲液Tris 冰乙酸。5mol/L EDTA CpH 8.0)tJ水定容至室温储存。A.6 70%乙醇无水乙醇加水30mL.昆匀，定容至分装后，室温储存。A.7 DAFA固定液95%乙醇附录A规范性附录)试剂自己方1000 mL 70 mL
18、 100 mL 330 mL SC/T 7240-2020 7 SC/T 7240-2020 甲E革(37%)冰醋酸过滤海水混匀，室温密封储存.A 8迈尔班尼特苏木精染色液温水(50C60C)苏木素殃酸销例明矶拧橡酸水合三氯乙酸按上述顺序混合，溶解后即可使用，室温储存。A.9 1%伊红储存液伊红Y(水溶性)水溶解后置于棕色瓶中，室温储存。A.10 1%焰红储存液焰红B(水溶性)水溶解后置于棕色瓶中，室温储存。A 11 伊红-焰红染色液1%伊红储存液1%焰红储存液95%乙蹲冰醋酸?昆匀后即可使用，室温储存。A.12 85%乙醇95%乙醇加水定容至混匀，室温储存。A.13 80%乙醇95%乙醇加水
19、定容至7昆匀，室温储存。A.14 75%Z;醇95%乙醇加水定容至混匀，室温储存。8 220 mL 115 mL 335 mL 1000 mL 1 g 0.2 g 90 g 1 g 50 g 5 g 500 mL 1 g 100 mL 100 mL 10 mL 780 mL 4 mL 850 mL 950 mL 800 mL 950 mL 750 mL 950 mL SC/T 7240-2020 A.15 50%乙醇95%乙蹲500 mL 加水定容至950 mL 混匀，室温储存。A 16 2.5%戊二醒25%戊二ll!t10 mL 0.2 mol/L磷酸盐缓冲液50 mL 过滤海水定容至100
20、 mL 混匀，4C冰箱储存。A.17 1%锻酸储存液钱酸1 g 110水定容至100 mL 混匀，室温储存。A.18 90%丙丽100%丙翻900 mL 加水定容至1 000 mL 1昆匀，室温储存。A.19 70%丙翻100%丙酣700 mL 加水定容至1 000 mL 混匀，室温储存。A.20 50%丙酬100%丙翻500 mL 力口水定容至1 000 mL I昆匀，室温储存。A.21 醋酸铀染色液醋酸双氧铀2 g 50%乙醇100 mL 混匀，棕色瓶避光保存。A.22 拧橡酸铅染色液硝酸铅1.3g 拧核酸=纳1.8g 1 mol/L NaOH 8 mL 加双蒸水定容至50 mL 混匀，室
21、温储存。9 SC/T 7240-2020 附录B(资料性附录)牡航癌病毒1型感染简介牡妨痕E若病毒病是一种由牡肪殖病毒1型COstreidherpesvirus 1,OsHV-l)感染双壳贝类，并引起3122311Zfffff性主匈国困苦;133532，可贯主allgulata)gensis)13种HV-1为痕目前众多实验室等间结果的可比10,phili户户口wrum)、欧洲扇)、福建牡妨(Crassostrea C Crassostr，hongkon 报告，认定Os-、牡妨病毒属co俨，OsHV-1感在世界其他国改变。例如SC/T 7240-2020 报U-不变病胞细)和C录织附组录性染料感
22、附资型,t.E 毒病由殇陪痕蜗牡C 1 受感染贝类结缔出现组织坏死和细胞浸润。图C.l给出了健康魁蚓肝胶腺，图C.2给出了牡妨殖病毒l型感染魁蚓肝膜腺组织病理变化。图C.1健康魁蚓肝膜腺(比例尺:100m)图C.2受感染魁蚓肝肢腺小管结构紊乱(比例尺:100m)C 2 受感染贝类结缔组织的成纤维细胞和血细胞呈现染色体边集或核浓缩等细胞病变.图C.3给出了牡妨痕莎病毒l型感染魁蚓细胞病理变化。图C.3受感染细胞出现染色质边集(黑箭头)和核浓缩(自箭头)(比例尺:10 fLm)11 SC/T 7240-2020 附录D(资料性附录)牡航瘪掺病毒1型PCR产物序列1 CTCTTDC兀ATGAAGKI
23、h CA二A础。TGG1AAGA:x;AACAJCI1T TCDGGATA 61二rGGAGCTGCGGCGCI泪GGATT孔J旧:;AGTGCCAC巳AAAAGGGGATAAGJJTT1JGA121 ATAGATGTGAGTGCGGCAA GATGAATGGC AAGATACACA ATGAGCD叮TGCCCGA!AC 181 AAAccrAACG TTG叉口刀ATDXAT1AGAAA虹口GGTTC纪ACA用C1AAAT1AA241 AAAAACAT GGGGGCCAAG GAATTIAACX刀GGGAAAAAGT:AJlAAT AGGCGCGATT 301 TGTCAG1TD GA厄泪瓦C
24、CCACACAcrcA虹口CGAGTA四:ACAACTGCDAAT1A 361 CAGCfIJCDC TACIiC队.CTAC队C队.CIiCTGAAAAAAT GCAG丁CACAGAATTTT 421 GCACC1丁GACCAAAGCCATC AC且CAGCCAGCAA:;ACTTTT姐CAACCAGA!:;AGGT 481 1ACATGCGA CATT下GAAGAGCTCGCTCTTTC刀AT下GCGAAGATAAA G刀GGCAT541 CATTGGCTGC AGTCAG必CTGACP.肌.CCCA1GAAGTCAC GGAACGCAAA GI了ffiAACC601 TCCTCGA士fG
25、厄CCAGlCT刀AAAAGAAGP.卫GAGTT:;ACl口CATTGA!:;AAT 661 TGTTCAC于GCCCACAAAGAC C次TTGTCAGAAAAATGGTAA GCCGTGCAC 注.单下划线标注为引物C2和C6结合位点.12 SC/T 7240-2020 附录E(资料性附录)牡蜗癌病毒1型形态特征示例受感染细胞核内出现六边形或近圆形殖彦样病毒颗粒，直径75nm110 nm;胞外组织间隙发现具囊膜的近圆形病毒粒子，直径100nm 155 nm，图E.1给出了牡妨殖*病毒1型感染魁蚓外套膜内炮声苦样的病毒粒子。B 只K-一一-一!.注:(A)细胞核内分布核衣壳(黑色箭头)、衣
26、壳(黑色短箭头)和正在装配的核衣壳(白色箭头).比例尺1m;(B)图为(A)中方框区域的局部放大，比例尺2200 nm,(C)细胞外分布病毒位子(黑色箭头).比例尺dm，(D)图为(C)中方框区域的局部放大，比例尺200nm.图E.l不同发育阶段牡蜗瘪殇病毒形态特征13 ONON-O寸NhF川只中国农业出版社出版(北京市朝阳区麦子店街18号楼)(ilJ政编码100125网址帆叭.c四)化学工业出版柑印刷厂印刷新华书店北京发行所发行各地新华书店经销4民提*开本880mmX1230mm 1/16 印张1.25 字数25千字2020年12月第1版2020年12月北京第l次印刷书号16109 8363 定价32.00元4陪奇峰版权专有侵权必究举报电话(010)59194261 7240-2020