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1、ICS 11.020 C 62 WS 中 华 人 民 共 和 国 卫 生 行 业 标 准 WS/T 5712017 裂头绦虫幼虫检测 Detection of diphyllobothroid larvae 2017-08-01 发布 2018-02-01 实施 中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会 发 布 WS/T 5712017 I 前 言 本标准依据GB/T 1.12009给出的规则起草。本标准起草单位：中国疾病预防控制中心寄生虫病预防控制所、上海出入境检验检疫局、上海市疾病预防控制中心。本标准起草人：陈韶红、李树清、张小萍、许学年、卢艳、蔡玉春、张永年、李浩、艾琳、郑彬。WS/T 5
2、712017 1 裂头绦虫幼虫检测 1 范围 本标准规定了裂头绦虫幼虫检测的操作流程。本标准适用于各级疾病预防控制机构、医疗机构和食品检测机构对鱼、蛙和蛇中裂头绦虫幼虫的检测。2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 18088 出入境动物检疫采样标准 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。3.1 裂头蚴 plerocercoid larvae 裂头绦虫的幼虫，是假叶目（Pseudophyllid
3、ea）、裂头科（Diphyllobothriidae）绦虫第三期幼虫的总称（参见附录A）。3.2 阔节裂头蚴 plerocercoid larvae of Dibothriocephalus latus 或phyllobothrium latum 寄生在鱼体内阔节裂头绦虫的第三期幼虫。3.3 曼氏裂头蚴 plerocercoid larvae of Spirometra mansoni 寄生在蛙、蛇或人体内曼氏迭宫绦虫的第三期幼虫。4 仪器器材 WS/T 5712017 2 4.1 生物显微镜。4.2 体视显微镜。4.3 PCR 扩增仪。4.4 电泳仪。4.5 凝胶成像系统。4.6 超净工作台
4、。4.7 高速离心机。4.8 解剖用手术器械。5 试剂材料 5.1 试剂 胃蛋白酶消化液；Tris-乙酸电泳缓冲液（TAE）；琼脂糖凝胶；6加样缓冲液；1002000 bp DNA marker；灭菌双蒸馏水(ddH2O)；70%乙醇（配制见附录 B 的 B.1）。5.2 引物 扩增裂头蚴核糖体 DNA 转录间隔区（ITS）引物序列；扩增裂头蚴细胞色素 C 氧化酶（Cox1）引物序列；阔节裂头蚴特异性引物序列及曼氏裂头蚴特异性引物序列（见附录 B 的 B.2）。5.3 阳性对照 阳性对照为裂头绦虫相应基因片段的阳性克隆质粒或裂头蚴、裂头绦虫全基因组 DNA。6 检测步骤 6.1 样品准备 6.
5、1.1 样品种类：海鱼、淡水鱼、蛙和蛇。6.1.2 样品采集：采样按照 GB/T 18088 执行。6.2 样品检测 6.2.1 压片检查法 WS/T 5712017 3 用手术剪对受检的鱼、蛙和蛇逐条/只进行解剖。取出内脏，将腹腔壁内膜刮下，观察腹腔内壁表面，若有可疑白色点状物，用手术剪或手术刀分离皮肉，用两把小镊子将肌肉撕开，取含有白色点状物的组织用载玻片压片，用生物显微镜镜检判定结果。6.2.2 蛋白酶消化法 称取样品 250 g 并剪成小块，按样品与胃蛋白酶消化液 1:5 的比例加入消化液，37消化至无肉眼可见的肉组织为止。消化后用 0.8mm0.8mm（10 目）网筛过滤，滤液置于尖
6、底量筒内，加水（用水参照 GB/T 66828）至最大刻度处，沉淀洗涤至水清，全部沉渣置平皿，用体视显微镜镜检判定结果。6.2.3 核酸检测法 6.2.3.1 取样 在体视显微镜下挑取虫体，初步鉴定后备用。PCR 反应设立阳性对照，对照为裂头绦虫相应基因片段的阳性克隆质粒或裂头蚴、裂头绦虫全基因组 DNA。无菌水作空白对照。6.2.3.2 DNA 的提取（见附录 B 的 B.3）6.2.3.3 反应体系 总体积为 25 L,模板 DNA 2 L，上下游引物（10 mol/L）各 0.5 L，dNTPs 2 L，MgCl2 2.5 L，10 Buffer 2.5 L，Taq 酶(5 U/L)0.
7、2 L，补充 ddH2O 至 25 L。6.2.3.4 PCR 反应程序 94预变性 3 min；94变性 30 s，55退火 30 s，72延伸 1 min，35 个循环；72延伸 7 min。6.2.3.5 电泳 取 10 L 产物与 2 L 的 6加样缓冲液混合，加样于含溴化乙锭的 1.5%琼脂糖凝胶中。在 1TAE缓冲液中，3 V/cm4 V/cm 电泳约 30 min，当溴酚蓝到达底部时停止电泳，用凝胶成像系统分析。6.3 结果判定 6.3.1 裂头属的裂头蚴判定 若从鱼体内检出的幼虫大小若长 2mm20 mm，宽 2mm3 mm，乳白色，头节呈匙形，其背腹面各有一条窄而深凹的吸槽，
8、体前端有凹陷且稍大，体不分节但具有横皱褶，尾部细，呈棍棒状，具有与成虫相似的头节，可初步判定裂头属的裂头蚴（参见附录 C）。6.3.2 迭宫属的裂头蚴形态判定 若从蛙或蛇体内检出的幼虫大小若长 0.5cm80 cm，宽 0.3cm1 cm，长带形，乳白色或淡黄色，虫体前端无吸槽，顶端中央有一孔向内凹陷成隧道状，并向后延伸形成盲管，虫体不分节，具有不规则的WS/T 5712017 4 皱褶，可初步判定为迭宫属的裂头蚴（参见附录 C）。6.3.3 核酸扩增结果判定 6.3.3.1 目的基因扩增片段出现条带而空白对照未出现条带，实验结果成立。6.3.3.2 阔节裂头蚴特异引物扩增，出现 428 bp
9、 的特征条带，初步判定该虫种为阔节裂头蚴。6.3.3.3 曼氏裂头蚴特异引物扩增，出现 156 bp 的特征条带，初步判定该虫种为曼氏裂头蚴。6.3.3.4 若要进一步对幼虫定种，需将引物扩增产物进行测序，将其序列与 GenBank 上序列进行比对后定种。WS/T 5712017 5 A A 附 录 A（资料性附录）病原学资料 裂头蚴（plerocercoid）是假叶目（Pseudophyllidea）、裂头科（Diphyllobothriidae）绦虫的第三期幼虫的总称。裂头科中的裂头属（Dibothriocephalus）又名双叶槽属（Diphyllobothrium）及迭宫属（Spiro
10、metra）的裂头蚴可感染人体。A.1 形态形态 A.1.1 裂头属的裂头蚴的形态 阔节裂头蚴长 2 mm20 mm，宽 2mm3 mm，乳白色，头节呈匙形，其背腹面各有一条窄而深凹的吸槽，体前端有凹陷且稍大，体不分节但具有横皱褶，尾部细，呈棍棒状，具有与成虫相似的头节，裂头蚴皮层表面覆盖微毛，长度约 1.5 m。A.1.2 迭宫属的裂头蚴形态 曼氏裂头蚴长 0.5cm80 cm，宽 0.3cm1 cm，长带形，乳白色或淡黄色，虫体前端无吸槽，顶端中央有一孔向内凹陷成隧道状，并向后延伸形成盲管，虫体不分节，具有不规则的皱褶。A.2 生活史生活史 阔节裂头绦虫成虫寄生在人以及犬、猫、猪等动物的小
11、肠内。虫卵随宿主粪便排出后，在 1525的水中，经过 7d15d 的发育，孵出钩球蚴。当钩球蚴被剑水蚤吞食后，在其血腔内经过 2 周3 周的发育成原尾蚴。当受感染的剑水蚤被小鱼或幼鱼吞食后，原尾蚴可在鱼的肌肉、性腺、卵内发育为裂头蚴，裂头蚴并可随着鱼卵排出。当大鱼吞食含有裂头蚴的小鱼或鱼卵后，裂头蚴可侵入大鱼的肌肉组织内继续生存，直到终宿主食入带裂头蚴的鱼时，裂头蚴方能在其肠内经 5 周6 周发育为成虫。成虫在终宿主体内可活 5 年13 年。可感染阔节裂头蚴的第二中间宿主有：白斑狗鱼（Esox lucius）、江鳕（Lota lota）、河鲈（Perca fluviatilis）、三刺鱼（Ga
12、sterosteus aculeatus）、樱花钩吻鲑（Oncorhynchus masou）、鮻鱼（Liza haematocheila）、溪红点鲑（Salvelinus fontinalis）、虹鳟鱼（Oncorhynchus mykiss）、雅罗鱼属鲤（Leuciscus rutilus）、八目鳗（Lampetra japonicum）等。曼氏迭宫绦虫的成虫寄生在猫、犬及食肉野生动物为终宿主的小肠内，虫卵随宿主粪便排出体外，在适宜温度下，经过 2 周5 周发育孵出六钩蚴，被剑水蚤吞食后发育成原尾蚴，原尾蚴被蛙类吞食可发育成裂头蚴，人吞食含有裂头蚴的第二中间宿主可引起曼氏裂头蚴病。可感染曼
13、氏裂头蚴的第二中间宿主为蛙类；鸟类、蛇类、猪可作为转续宿主。WS/T 5712017 6 B B 附 录 B（规范性附录）与检测相关的技术方法 B.1 试剂配制 B.1.1 胃蛋白酶消化液 胃蛋白酶2 g，浓盐酸0.7 mL，加蒸馏水至100 mL，现用现配。B.1.2 Tris-乙酸电泳缓冲液（TAE）三羟甲基氨基甲烷（Tris碱）242 g，冰乙酸57.1 mL，pH 8.0的 0.5 mol/L EDTA液100 mL，加蒸馏水定容至1000 mL，制成50 TAE缓冲液，混匀4保存备用。临用前50倍稀释。B.1.3 1 TAE使用液 50 TAE 20 mL，加蒸馏水定容至1000 m
14、L，混匀备用。B.1.4 10 mg/mL溴化乙锭液 溴化乙锭1 g，加蒸馏水定容至100 mL，磁力搅拌至完全溶解，室温避光保存。B.1.5 1.5%琼脂糖凝胶 琼脂糖1.5 g，加1 TAE定容至100 mL，完全融化后，溶液冷却至60，加10 mg/mL 溴化乙锭5 L（终浓度0.5 g/mL)，轻轻混匀后，制备凝胶。B.1.6 6 加样缓冲液 溴酚蓝0.25 g，蔗糖40 g，加蒸馏水至100 mL。置4保存备用。B.1.7 商品化试剂盒 Taq酶、dNTP等核酸提取及PCR试剂可选用商品化试剂和试剂盒。B.2 引物模板 裂头绦虫幼虫相关引物见表B.2 表B.2裂头绦虫幼虫相关引物 引
15、物名称 引物编号 序列 片段大小/bp 裂头蚴 ITS 通用引物 18S-DF1 5-ACTTGATCATTTAGAGGAAGT-3 1409 28S-DR4 5-CTCCGCTTAGTGATATGCT-3 裂头蚴 Cox1 通用引物 JB6 5-GATAGTAAGGGTGTTGA-3 650 JB5R 5-CAAGTATCRTGCAAAATATTATCAAG-3 阔节裂头蚴特异引物 Dl/Dn-1805F 5-CAGTGGGAATGGTGCTTGTAATGT-3 428 WS/T 5712017 7 Dl-2211R 5-TAACCTTTACTTATAACTACT-3 曼氏裂头蚴特异性引物
16、F965 5-CTTGGCTTTATATGATTTAAATAG-3 156 R1120 5-GTTTGGTGCACAGTACGTTTTAAAA-3 B.3 DNA的提取 B.3.1 挑取单条待鉴定虫体放入灭菌离心管，加入灭菌蒸馏水，半小时换一次水，重复洗涤3次，洗涤完毕后弃掉离心管中蒸馏水，用碾磨棒将离心管中虫体碾碎，加入180 l Buffer ATL，20 l蛋白酶K，混匀后于56孵育13 h至消化完全，期间不时振荡摇晃。B.3.2 消化完全后，漩涡震荡15 s，加200 l Buffer AL，立即漩涡振荡混匀，再加入200 l 乙醇(96100%)，漩涡振荡混匀。B.3.3 离心柱置于
17、收集管上，将上一步的混合物吸入离心柱中，8000 r/min离心 1 min，弃收集管。B.3.4 将离心柱置于新的收集管中，加500 l Buffer AW1，8000 r/min离心 1 min，弃收集管。B.3.5 将离心柱置于新的收集管中，加500 l Buffer AW2，14000 r/min离心 3 min，弃收集管。B.3.6 将离心柱置于灭菌的1.5 ml离心管中，加入200 l Buffer AE室温孵育1 min，8000 r/min离心 1 min，离心所得DNA于-20冰箱保存备用（重复该步骤可扩大DNA回收率）。B.4 实验试剂代码解释（试剂盒自带）Buffer A
18、L：裂解缓冲液（Lysis buffer）Buffer AW1：洗涤缓冲液1 Buffer AW2：洗涤缓冲液2 Buffer ATL：组织溶解缓冲液 Buffer AE：溶解缓冲液 WS/T 5712017 8 C C 附 录 C（资料性附录）裂头蚴实物图 C.1 白鱼肌肉中的阔节裂头蚴见图C.1 图C.1 C.2 鳟鱼肌肉中的阔节裂头蚴见图C.2 图C.2 C.3 蛙体内的曼氏裂头蚴见图C.3 图C.3 C.4 蛇体的曼氏裂头蚴见图C.4 WS/T 5712017 9 图C.4 注：图C.1来自参考自文献：Tom Scholz,Hector H.Garcia,Roman Kuchta,Ba
19、rbara Wicht.Update on the Human Broad Tapeworm(Genus Diphyllobothrium),Including Clinical Relevance.JClin Microbiol Rev.2009 January;22(1):146160.doi:10.1128/CMR.00033-08 图 C.2、C.3、C.4 为检测样品自己拍摄.WS/T 5712017 10 参 考 文 献 1 吴观陵.人体寄生虫学.第 4 版.北京:人民卫生出版社,2013.2 Scholz T,Garcia HH,Kuchta R,Wicht B.Update o
20、n the human broad tapeworm(genus diphyllobothrium),including clinical relevance.Clin Microbiol Rev.2009,22(1):146-160.3 余森海,许隆祺.人体寄生虫学彩色图谱.第 1 版.北京:中国科学技术出版社,1992.4 刘自逵,刘国华,戴荣四,刘伟,李芬,等.湖南省猬迭宫绦虫的线粒体 cox1 和 nad1 基因的序列测定及种系发育分析.畜牧兽医学报.2010,41:463-468.5 Wicht B,Ruggeri-Bernardi N,Yanagida T,Nakao M,Pedu
21、zzi R,et al.Inter-and intra-specific characterization of tapeworms of the genus Diphyllobothrium(Cestoda:Diphyllobothriidea)from Switzerland,using nuclear and mitochondrial DNA targets.Parasitol Int.2010,59:35-39.6 SH Chen,L Ai,YN Zhang,JX Chen,WZ Zhang,et al.Molecular Detection of Diphyllobothrium nihonkaiense in Humans,China.Emerg Infect Dis,2014,20:315318._