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1、ICS 11.020 c59 23222-2008 引TS中华人民共和国卫生行业标准ws 281-2008 狂犬病诊断标准Diagnostic criteria for rabies 2008-02-28发布2008-09-01实施叶1主只、民三主是奉日OOJ主当三音民发布ws 281-2008 目。吕根据中华人民共和国传染病防治法制定本标准。按照国家质检总局国家标准委公告(2005年第146号)，GB17014-1997(狂犬病诊断标准及处理原则自本标准实施之日起废止。本标准的附录A是规范性附录，附录B、附录C、附录D是资料性附录。本标准由卫生部传染病标准专业委员会提出。本标准由中华人民共和
2、国卫生部批准。本标准起草单位:中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所、山东省疾病预防控制中心、泸州医学院附属医院、武汉生物制品研究所、中国疾病预防控制中心疾病控制与应急处理办公室。本标准主要起草人:唐青、王显军、余光开、严家新、许真。ws 281-2008 狂犬病诊断标准1 范围本标准规定了狂犬病的诊断依据、诊断原则、诊断和鉴别诊断。本标准适用于全国各级医疗卫生机构及其工作人员对狂犬病的诊断、报告。2 术语和定义下列术语和定义适用于本标准。2.1 狂犬病街毒street virus 自然状态下从感染动物或患者中发现的狂犬病病毒。2.2 狂犬病实验室固定毒fixed virus 狂犬病街毒株经过动
3、物或细胞系列传代适应特定宿主后，其致病性减弱。3 诊断侬据3.1 流行病学史有被犬、猫、野生食肉动物以及食虫和吸血蝙蝠等宿主动物咬伤、抓伤、舔献黠膜或未愈合伤口的感染史。3.2 临床表现3.2.1 狂躁型狂躁型是我国最常见的类型。主要表现有:在愈合的伤口及其神经支配区有痒、痛、麻及蚁走等异常感觉，以后出现高度兴奋、恐水、怕风、阵发性咽肌瘟孪和交感神经兴奋症状如流涎、吐沫、多汗、心率加快、血压增高等。逐渐发生全身弛缓性瘫痪，最终因呼吸、循环衰竭而死亡。3.2.2 麻癖型麻痹型在我国较为少见。临床表现为:前驱期多为高热、头痛、呕吐及咬伤处疼痛等，无兴奋期和恐水症状，亦无咽喉瘟孪和吞咽因难等表现。前
4、驱期后即出现四肢无力、麻痹症状，麻痹多开始于肢体被咬处，然后呈放射状向四周蔓延。部分或全部肌肉瘫痪，咽喉肌、声带麻痹而失音，故称哑狂犬病。3.3 实验室检查3.3.1 直接荧光抗体法(dFA)(见A.1)或ELISA(见A.2)检测患者唾液、脑脊液或颈后带毛囊的皮肤组织标本中狂犬病毒抗原阳性，或用RT-PCRC见A.3)检测狂犬病病毒核酸阳性。3.3.2 细胞培养方法(见A.4)从患者唾液、脑脊液等标本中分离到狂犬病病毒。3.3.3 脑组织检测尸检脑组织标本，用直接荧光抗体法CdFA)C见A.1)或ELISAC Jh!,A.2)检测狂犬病病毒抗原阳性、RT-PCRC见A.3)检测狂犬病病毒核酸
5、阳性、细胞培养方法(见A.的分离到狂犬病病毒。4 诊断原则根据患者的流行病学史、临床表现和实验室检查结果进行综合判断，病例确诊需要实验室证据。狂犬病的病原学、流行病学和临床表现参见附录D，狂犬病特异性抗体检测参见附录B。1 ws 281-2008 5 诊断5.1 临床诊断病例符合下列任一项即可诊断:5.1.1 符合3.2.1者。5.1.2 符合3.1加3.2.2者。5.2 确诊病例临床诊断病例加3.3.1、3.3.2、3.3.3中的任何-项者。6 鉴别诊断本病尚需与狂犬病恐怖症、破伤风、病毒性脑膜脑炎、脊髓灰质炎等鉴别，参见附录C。2 ws 281-2008 附录A(规范性附录)狂犬病特异性病
6、原学检测A.1 直接荧光抗体方法(dFA)检测狂犬病病毒抗原、1皮肤组织和体液(唾A.1.3.1 A.1.3.2 室温斗，印片或切片上，A.2.1 原理根据抗原抗体特异性结合特点，用抗狂犬病病毒特异性单克隆抗体包被塑料板，与标本中待检抗原结合，其中待检抗原又与后加入的辣根过氧化物酶标记抗狂犬病病毒单克隆抗体特异性结合，再通过辣根过氧化物酶与底物作用产生可见的颜色反应，最终达到检测目的。显色程度与待检抗原含量呈正相关。A.2.2 试验材料A.2.2.1 用于检测的标本为狂犬病患者脑脊液或死亡后脑组织。A.2.2.2 多株抗狂犬病病毒特异性单克隆抗体混合包被的酶标板条。A.2.2.3 阳性病毒对照
7、(冻干，已灭活)。3 ws 281-2008 A.2.2.4 样品稀释液:pH7.4 PBS。A.2.2.5 辣根过氧化物酶标记的抗狂犬病病毒单克隆抗体。A.2.2.6 洗涤液:pH7.4PBS-T(PBS十0.05%吐温-20)。A.2.2.7 底物液:OPD或TMB。A.2.2.8 终止液:4NH2S04oA.2.2.9 酶标仪。A.2.3 检测步骤A.2.3.1 取待检脑组织加样品稀释液研磨制成10%脑组织悬液，或直接取待检脑脊液约0.5mL，用稀释液将待检脑悬液和阴性、阳性对照各1:20稀释(阴性对照自设，待检脑脊液不稀释)，加人各自对应孔中，其中待测样品各1孔，阴性、日性对照各2孔，
8、100L/孔。设2孔为空白对照，只加样品稀释液，100L/孔，将酶标可拆板置湿盒内，370C温育30min。剩余的阳性病毒对照保存于200C 备用。A.2.3.2 将浓缩的洗涤液用蒸馆水30倍稀释成工作浓度，取出酶标板，甩干，将洗涤液加满各孔，倾出，甩干，重复以上操作共3次。A.2.3.3 取酶结合物加入各孔(空白对照孔中不加酶结合物)，100L/孔或2滴，置湿盒内，3 7C温育30min。A.2.3.4 取出酶标板、倾出液体，甩干，同上法洗板6次。A.2.3.5 将显色液A/B各一滴加入各孔中，置湿盒内至阳性对照显蓝色。将终止液加人各孔，50L/孔或1滴，终止反应。置酶标仪上读数。A.2.4
9、 结果判断空白和阴性对照孔元色，而阳性对照孔显蓝色，则结果成立。以空白两孔的平均数调零，在酶标仪上测定450nm处各孔吸光(A)值，待测样品A值大于或等于阴性对照A平均值十0.08，即30D阴性对照十0.08，则表明该样品为狂犬病病毒抗原阳性。A.2.5 意义检测到狂犬病病毒抗原阳性有诊断意义。A.3 RT-PCR法检测狂犬病病毒核酸A.3.1 原理PCR技术是依据双链DNA分子碱基配对原则，采用耐热DNA聚合酶和DNA合成引物，以目的基因为模板在体外特异性扩增DNA片断。狂犬病病毒为负链RNA病毒，PCR前需要经过逆转录酶作用，合成第一条cDNA链(RT)，再进行PCR扩增，即RT-PCR。
10、基于这一原理，设计狂犬病病毒基因片断特异性扩增引物，对狂犬病患者的标本进行狂犬病病毒特异性核酸的扩增和检测，阳性结果可以判定为狂犬病病毒感染。A.3.2 试验材料A.3.2.1 可用于狂犬病患者诊断的标本:唾液、泪液、尿液、鼻咽洗液、后颈带毛囊的皮肤组织或脑脊液等;死亡后用于诊断的标本:脑组织。A.3.2.2 PCR扩增引物:以特异性扩增狂犬病病毒核蛋白(NP)基因最保守区域为目的基因片断，设i十一对寻|物:N1(十):(587)5-TTT GAG ACT GCT CCT TTT G(605)-3;N2C一):(092)5-CC CAT AT A GCA TCC TAC0013)-3 0 A.
11、3.2.3 细胞总RNA分离试剂:TRlzol(用于组织标本);TRlzol SL(用于液体标本)。A.3.2.4 AMV逆转录酶、DNA聚合酶、dNTPMixture等。A.3.3 检测步骤A.3.3.1 病毒RNA的提取:待检标本用细胞总RNA分离试剂提取病毒RNA，按照细胞总RNA分4 ws 281-2008 离试剂说明提取，制备模板RNA。A.3.3.2 逆转录合成cDNA:根据AMV逆转录酶反应要求，按照说明书通过逆转录反应合成与目的基因RNA序列互补的cDNA。A.3.3.3 PCR扩增:PCR循环特异性扩增目的基因cDNA，反应条件:950C预变性5min;940C 45s、50
12、0C50s、720C60s，共扩增30个35个循环;最后720C延伸10min。A.3.3.4 用1%2%琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物。A.3.4 结果判断如果电泳条带的分子量与预期片段大小相同，表明为狂犬病病毒N基因特异性扩增区段阳性。A.3.5 意义阳性结果表明有狂犬病病毒感染，有确诊意义。A.4 细胞培养方法分离狂犬病病毒A.4.1 原理狂犬病病毒感染动物，经过在中枢神经系统繁殖后，病毒可以随神经纤维离心性散播到身体其他部位的绝大多数器官，因此狂犬病病毒适应的宿主细胞较为广泛。通过观察狂犬病病毒感染细胞后所产生的细胞病理改变，结合特异敏感的检测技术检测出病毒的存在，证明为狂犬病病毒感
13、染。A.4.2 试验材料A.4.2.1 可用于狂犬病病毒分离的标本患者的唾液、脑脊液或皮肤组织等;死亡后用于病毒分离的标本:脑组织。A.4.2.2 细胞系鼠神经瘤细胞、BHK细胞、Vero细胞等。A.4.2.3 细胞培养基成分Eagles培养液、谷氨眈胶、青霉素/链霉素、胎牛或小牛血清、7.5%碳酸氢锅。A.4.2.4 BHK或Vero细胞培养基a)生长液:100mL Eagles生长液中包含Eagles液84mL、胎牛或小牛血清10mL、青霉素/链霉素2mL、1%谷氨酷胶1mL，用7.5%碳酸氢铀调pH值至7.27.4。b)维持液:100mL Eagles维持液中包含Eagles液92mL、
14、胎牛或小牛血清2mL、青霉素/链霉素2mL、1%谷氨酷胶1mL，用7.5%碳酸氢铀调pH值至7.27.40 A.4.2.5 培养条件3rc 5%C02培养箱中培养。A.4.3 实验步骤脑脊液可直接接种细胞，以BHK细胞为例:A.4.3.1 培养单层细胞至80%汇合度;A.4.3.2 弃去培养液，加入0.2mL液体标本或组织悬液，3rc孵箱吸附1h;A.4.3.3 1h后，补加维持液，置于3rc5%CO2培养箱中培养;A.4.3.4 培养至第4天第5天，刮取细胞涂在载玻片上，室温干燥后丙酣固定，按免疫荧光法进行鉴定;A.4.3.5 阴性者需要继续盲传3代:将细胞培养瓶反复冻融3次，40C，120
15、00r/min，离心15min后取上清液，按照上述方法在细胞内连续传代3次。A.4.4 结果判定细胞传代出现病变，免疫荧光法检测病毒抗原阳性。A.4.5 意义阳性结果表明有狂犬病病毒感染，有确诊意义。5 ws 281-2008 附录B(资料性附录)狂犬病特异性抗体检测在自然感染情况下，狂犬病病毒通常在被疯动物咬伤时通过其带有病毒的唾液进人机体伤口内，在入侵部位，狂犬病病毒基本上不增殖，一般也不侵入血流，故不能形成病毒血症。因此，在感染后的一段时间内狂犬病病毒或其抗原不能与机体免疫系统广泛接触，不能有效剌激机体产生抗狂犬病病毒感染的免疫应答反应。狂犬病的晚期因血面屏障华揭一勘h血肉大量病毒抗原得
16、以进人血流，可以剌激机体的免疫系统产生大量特异性抗体，由比，拉多狂犬病患者在要植早期血清中查不到抗体或抗体滴度很低，狂犬病特异性抗体只在I如-宁哩也到狂:病毒特异性抗体对诊断有参考意义。B.1.1 试验材料B.1.1.1 用于检B.1.1.2 B.1.1.3 B.1.1.4 B.1.1.5 B.1.1.6 B.1.1.7 B.1.1.8 80%B.1.1.10 B.1.1.11 560C B.1.1.12 荧光显B.1.2 检测步骤B.1.2.1 攻击病毒的B.1.2.1.1 通常采用B.1.2.1.2 细胞上B.1.2.1.3 最适攻击剂量为B.1.2.2 血清病毒中和反应B.1.2.2.1
17、 待检血清经560C30min灭活。B.1.2.2.2 在96孔板上设置未感染细胞对照和病毒对照孔。B.1.2.2.3 每个血清稀释度设2个孔。B.1.2.2.4 除病毒对照孔外，每个孔加入100LD-MEM培养基。mL谷氨酷肢，涵体的最高病毒稀释度。B.1.2.2.5 直接在孔中进行待检血清和参考血清的系列3倍稀释:(每孔己加入100fLL培养基)将50L血清加入第一排孔，依次从1/3到1/81稀释。在病毒对照孔，加人100fLL培养基。B.1.2.2.6 在含稀释血清的每个孔内，加人15 0L预先滴定的病毒悬液。在未感染细胞对照孔内，加人50L培养基。6 在病毒对照孔对病毒悬液进行4次2倍
18、稀释，从1/2到1/16。B.1.2.2.7 在370C5%C02恒湿孵温箱中保温1h。B.1.2.3 加入细胞ws 281-2008 B.1.2.3.1 用膜酶消化细胞，制备浓度为1X 106细胞/mL的细胞悬液，每孔加入50L细胞悬液(5X104细胞)。B.1.2.3.2 在3rc5%COz恒湿孵箱中，温育24hoB.1.2.4 固定和染色B.1.2.4.1 用与盛有漂白粉溶液的大瓶相连的真空装置抽吸去各孔中的上清液。B.1.2.4.2 用PBS浸泡各孔3次，每次5m山JB.1.2.4.3 以80%丙酣浸洗各孔，B.1.2.4.4 每孔加入20L温30min。20稀释)，在3rc湿盒中保B
19、.1.2.4.5 吸出结合物B.1.2.4.6 空气干燥，B.1.2.4.7 荧光显饱B.1.3 结果判断B.1.3.1 记录每1B.1.3.2 与病毒B.1.3.3 与参B.2 酶联免疫B.2.1 试验材-B.2.1.1 用于B.2.1.2 狂犬jB.2.1.3 阴阳A、B.2.1.4 己知滴B.2.1.5 B.2.1.6 B.2.2.2 B.2.2.3 取酶结合物加入各孔，100L/孔或2滴，置湿盒内，3rc温育30minoB.2.2.4 取出酶标板、倾出液体，甩干，同上法洗板6次。B.2.2.5 将显色液A/B液各一滴加入各孔中，置湿盒内370C显色15mi口，加终止液-滴，置酶标仪上读
20、数。B.2.3 结果判断空白和阴性对照孔无色，而阳性对照孔显蓝色，则结果成立。7 ws 281-2008 在酶标仪上测定450nm处各孔A值。以IU/mL的对数为横坐标，以各孔A值对数为纵坐标，将阳性对照各孔依次在对数坐标纸上标出相应位点，各位点应形成一条直线，在该直线上找出样品A值的对数，其横坐标所示即为该样品相应的IU/mL的对数。B.2.4 意义接种过狂犬病疫苗的患者抗体滴度大于O.5IU/mL，表明已获得保护。未接种过疫苗的患者的抗体滴度大于lIU/mL，且近期有4倍增高，可考虑为狂犬病。部分狂犬病患者在临死前抗体滴度也可能异常增高。8 C.l 狂犬病恐怖症附录C(资料性附录)狂犬病的
21、鉴别诊断ws 281-2008 狂犬病恐怖症Crabiesphobia)国外称唐症性假性狂犬病Chysterical pseudo-rabies)、狂犬病撞症Crabies hysteria)、狂犬病样恐水Clyssapho bia)及恐水性恐怖症Chydrophobia)。由于狂犬病是一种非常恐怖的疾病，一些痛病患者在暴露后想象自己患有此病。通过暗示，他们常有较为悲观的表现，如攻击行为、咬人、吼叫甚至恐水。假性恐水是一种夸张的表现，不能准确地产生反射特点，缺乏发热，特殊的前驱症状和特异性的实验室检查结果。患者的病情不再发展，甚至可自行恢复。在这些病例中，被动物咬伤至出现临床症状仅几小时或ld
22、剑，而狂犬病的潜伏期不可能这样短，了解患者以前的个性有助于诊断。C.2 破伤凤破伤风(tetanus)的早期症状是牙关紧闭Clockjaw)，以后出现苦笑面容及角弓反张。破伤风患者试图吞咽可引起痛苦的肌痊孪，但不恐水。一种罕见的局限性破伤风，即仅仅累及支配吞咽肌群的颈神经所致的恐水性破伤风Chydrophobictetanus)，在临床上易与狂犬病混淆。破伤风受累的肌群在瘟李的间歇期仍保持较高的肌张力，而狂犬病患者的这些肌群在间歇期却是完全松弛的。破伤风通过现代的精心治疗，多半能够恢复。C.3 病毒性脑膜脑炎有明显的颅内高压和脑膜剌激征，早期可出现意识障碍，常见的病原体有乙脑病毒、麻彦病毒、腮
23、腺炎病毒、肠道病毒、单纯殖痊病毒。除了狂犬病脑炎外，这些病毒中任何一种脑部感染都不会引起恐水表现。C.4 脊髓灰质炎脊髓灰质炎Cpo1iomyelitis)通过免疫预防，目前发病已经很少。麻痹型脊髓灰质炎(paralyticpo1io-mye1itis)易与麻痹型狂犬病?昆淆。此病起病时可出现双向热型，双侧肢体出现不对称弛缓性瘫痪外，常常伴有感觉过敏，脑脊液呈细胞蛋白分离现象，其分类以多形核粒细胞为主，而狂犬病的整个病程中以淋巴细胞为主。更主要的是可自脑脊液、咽部和大使中分离出脊髓灰质炎病毒。补体结合抗体阳性，特异性IgM抗体阳性均可作出确诊。9 ws 281-2008 D.1 病原学D.1.
24、1 分类附录D(资料性附录)狂犬病的病原学、流行病学和临床表现狂犬病致病因子为狂犬病病毒，该病毒利亚。蝙蝠是6种狂犬病病毒唯一D.1.4 理化特D.1.5 诊断意d检测到狂犬j才可作为实验室确D.2 流行病学D.2.1 传染源和宿几乎所有的哺乳动动物是犬科与猫科动物以一些已经基本控制了犬狂犬、D.2.2 传播途径D.2.3 易感性应;基因V型和基因VI型毒和实验室固定毒良于东半球和澳大合物、酸CpH4 人类对狂犬病病毒普遍易感，人接触狂犬病病毒后影响发病的因素很多，如皮肤或站膜受伤的程度、受伤部位、伤口的处理和预防性治疗措施及时、科学与否等。D.3 临床表现D.3.1 潜伏期10 ws 281
25、-2008 狂犬病的潜伏期一般为2周8周，极少数可长达1年以上。D.3.2 临床表现根据狂犬病临床表现特点，狂犬病分为狂躁型、麻痹型(哑狂犬病)两型。狂犬病的临床表现复杂，有时诊断比较困难，除非出现了特异性的临床体征，如恐水症或气流恐惧症。D.3.2.1 狂躁型狂犬病狂躁型是最常见的临床类型，一般分为前驱期、兴奋期(痊孪期)和麻痹期三期。D.3.2.1.3 麻痹兴奋期后，应肢体软瘫较多见。腥等生理反射消过24h。飞-;-D.3.2.2麻痹型(吨嘻飞)我国仅见零星报、驱期表现无明显区别。肢无力、麻痹症状。麻痹巫山失。早期典型体征，主要表珊飞叩其他表现有腹胀、尿漏留或大小刺激，也能激惹，而可能出现
26、四肢抽11 88|?创民国华人民共和卫生行业标准中狂犬病诊断标准WS 281-2008 印张12008年8月第1版第1次印刷长出版发行:人民卫生出版社(中继线010-67616688)地址:北京市丰台区方庄芳群园3区3号楼邮编100078网址http:/E-mail:pmph 购书热线010-67605754010-65264830 印刷:北京新丰印刷厂经销:新华书店开本880X1230 字数29千字版次2008年8月第1版书号14117 210 定价9.00元版权所有，侵权必究，打击盗版举报电话010-87613394(凡属印装质量问题请与本社销售部联系退换)1/16|.EE-MHMMMMMMMno 咱明明明忡忡MMM川2川川川一-HHHHHHHHHHnO Emmm剧配肌肉丘|川川川川川S川川川川W