《SN∕T 3278-2012 风信子黄腐病菌检疫鉴定方法(出入境检验检疫).pdf》由会员分享，可在线阅读，更多相关《SN∕T 3278-2012 风信子黄腐病菌检疫鉴定方法(出入境检验检疫).pdf（13页珍藏版）》请在taowenge.com淘文阁网|工程机械CAD图纸|机械工程制图|CAD装配图下载|SolidWorks_CaTia_CAD_UG_PROE_设计图分享下载上搜索。
1、书书书中华人民共和国出入境检验检疫行业标准犛 犖犜 风信子黄腐病菌检疫鉴定方法犇 犲 狋 犲 犮 狋 犻 狅 狀犪 狀 犱犐 犱 犲 狀 狋 犻 犳 犻 犮 犪 狋 犻 狅 狀狅 犳犡 犪 狀 狋 犺 狅 犿 狅 狀 犪 狊 犺 狔 犪 犮 犻 狀 狋 犺 犻（犠 犪 犽 犽 犲 狉）犞 犪 狌 狋 犲 狉 犻 狀犲 狋 犪 犾 发布 实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局发 布书书书前言本标准按照 给出的规则起草。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国山东出入境检验检疫局、中国检验检疫科学研究院。本标准主要起草人：邵秀玲、尼秀媚、厉艳、甘琴华、赵文军
2、、吴兴海、王英超、纪瑛。犛 犖犜 风信子黄腐病菌检疫鉴定方法范围本标准规定了风信子黄腐病菌的常规检测鉴定方法、实时荧光 检测方法、结果判定和菌株保存等方法。本标准适用于百合科风信子属等植物种球及产品中风信子黄腐病菌的检疫鉴定。规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。食品卫生微生物学检验染色法、培养基和试剂 进出境植物苗木检疫规程风信子黄腐病菌基本信息学名犡 犪 狀 狋 犺 狅 犿 狅 狀 犪 狊 犺 狔 犪 犮 犻 狀 狋 犺 犻（）英文名称 属于原核生物界（）薄璧
3、细菌门（）暗细菌纲（）假 单 胞 菌 目（）假单胞菌科（）黄单胞菌属（犡 犪 狀 狋 犺 狅 犿 狅 狀 犪 狊）。病原菌分布、寄主范围、危害、传播途径等资料参见附录。方法原理经现场查验，实验室用显微镜、定量 仪等仪器设备对样品进行检测，根据病原菌的菌落特征、菌体形态、生理生化特性及致病性测定和分子生物学检测结果进行判定。仪器设备和用具 仪器设备电子天平（感量 ）、植物生长培养箱、恒温培养箱、恒温振荡培养箱、高压灭菌器、超净工作台、生物显微镜（具照相系统）、高速冷冻离心机（）、小型离心机、纯水仪、恒温水浴锅、低温冰箱、定量 仪、电泳仪、电泳槽、凝胶成像分析仪、微生物鉴定系统、电动搅拌器等。用具
4、培养皿、试管、可调式微量进样器（、）及其枪头、研钵、离心管（、）、管（）、量筒、烧杯等。犛 犖犜 试剂除另有规定外，所有试剂均为分析纯或生化试剂。培养、鉴定风信子黄腐病菌所用培养基中的试剂及其配方参见附录。检测鉴定 现场检疫 样品查验数量按 的规定执行。症状观察被侵染的球茎可产生扭曲的叶，叶片上可发展狭长的水浸状不规则条斑，后变褐色，花茎也可被侵染并引起枯萎。横切叶片、花梗和鳞茎病部，可见维管束有大量淡黄色粘性细菌溢出，风信子叶片、球茎危害症状参见附录。实验室检测鉴定 样品初筛通过肉眼或显微镜观察，对危害症状不明显的潜在感染可直接通过分子生物学检测进行样品初筛，初筛阳性的样品需完成 的检测。危
5、害症状明显的样品需进行 的检测，以上的培养条件可提高症状出现的速度。实验室检测鉴定流程图参见附录。病原菌的分离与培养取可疑植物组织，酒精消毒，无菌水洗次后，放在无菌的载玻片上用无菌的玻璃棒研碎，滴一滴无菌水于研碎的病组织上。静置 后，用稀释法或无菌的移植环蘸取以上组织液在 培养基平板上划线，至少培养 后，观察菌落生长情况，进行菌种纯化。菌落特征纯化的病原菌在 培养基上培养，可生成圆形单菌落，表面隆起，不透明，光滑，菌落粘稠，呈典型的黄单孢菌属的黄色，颜色随菌落的厚度增加而加深，菌落特征图参见附录。形态特征按 中规定的方法或商业染色产品进行革兰氏与鞭毛染色，显微镜观察菌体形态。风信子黄腐病菌菌体
6、呈长直杆状，末端圆形，有一根极生鞭毛，大小约为（）（），菌体扫描症状图片参见附录。生理生化革兰氏染色阴性。呼吸代谢，永不发酵。氧化酶反应阴性或弱。接触酶阳性。在弱缓冲的培养基上，可利用很多碳水化合物产生少量的酸，但不从鼠李糖、菊根粉、卫矛醇、阿东醇、肌醇或柳醇产酸，从山梨醇很少产酸。碳源利用情况可通过 微生物鉴定系统进行判定。犛 犖犜 致病性测定将纯化培养 的菌株用无菌水配成 的菌悬液，挑取健康的风信子种球无菌条件下种植培养，选取叶龄健康的风信子用注射法将菌悬液接种于球茎内，无菌水作阴性对照，标准菌株作阳性对照，保湿培养，左右观察病菌侵染症状。如果产生典型的症状，表明所分离的菌株具有致病性，需
7、要从接种植株上再次分离病菌，再分离的纯菌株应具有与原菌株一致的病原特征，否则判定所分离的菌株不具有致病性。犘 犆 犚法检测实时荧光 检测方法见附录。结果判定 无症状植物对无症状的植物体直接进行分子生物学检测进行初筛，如果检测结果为阴性，实验最终判定为阴性；如果检测结果为阳性，需完成 的检测，如果所分离的菌株的形态特征、在培养基上的菌落特征、生理生化特性与标准相符，且菌株致病性测定为阳性，结果可判定为阳性，否则结果判定为阴性。有症状植物对有症状的植物体需进行病菌分离，如果所分离的菌株的形态特征、在培养基上的菌落特征、生理生化特性与标准相符，且菌株致病性测定为阳性，需做分子生物学方法进行确认，如果
8、 检测结果为阳性，可以最终判定为检出风信子黄腐病菌，否则结果判定为阴性。菌株保存从检测样品中分离到并鉴定为风信子黄腐病菌的菌株，应妥善保存。将菌株转接到试管斜面上，恒温培养。然后置于冰箱中保存，定期（）转接，防止病菌死亡；或在菌悬液中加入 的甘油于 下保存；必要时将菌株用真空冷冻干燥机制成冻干粉，下长期保存。犛 犖犜 附录犃（资料性附录）风信子黄腐病菌的相关资料犃 分布日本、瑞典、丹麦、德国、法国、意大利、英国、芬兰、新西兰、奥地利、南斯拉夫、匈牙利、爱尔兰、俄罗斯、瑞典、荷兰、波兰、罗马尼亚、澳大利亚、美国等。犃 寄主范围风信子黄腐病菌的寄主范围较广，主要危害百合科风信子属（犎 狔 犪 犮
9、犻 狀 狋 犺 狌 狊）、蔓穗草（犛 犮 犻 犾 犾 犪 狊 狆）、葡萄风信 子（犕 狌 狊 犮 犪 狉 犻犫 狅 狋 狉 狔 狅 犻 犱 犲 狊）、条 纹 海 葱（犘 狌 狊 犮 犺 犽 犻 狀 犻 犪狊 犮 犻 犾 犾 狅 犻 犱 犲 狊）等，接 种 寄 主 有 聚 铃 花（犛犺 犻 狊 狆 犪 狀 犻 犮 犪）、亚美尼亚麝香兰（犕 狌 狊 犮 犪 狉 犻 犪 狉 犿 犲 狀 犻 犪 犮 狌 狀）等。犃 病原菌形态特征及为害状病菌先从叶尖侵染叶片，受害部位产生水渍状黄色病斑，向下扩展成条斑，后变褐色坏死；病菌从叶扩展到芽，在芽上局部腐烂，几天内蔓延至全芽，可见浅黄色、粘状渗出物；花梗受害，
10、出现水渍状变褐色，皱缩枯萎，鳞茎中心部也变黄色黄腐。病芽上的叶和花梗很容易脱落，高温多湿时发病重。横切叶片、花梗和鳞茎病部，可见维管束有大量淡黄色粘性细菌溢出，被侵染的球茎可产生扭曲的叶，叶片上可发展成狭长的水浸状不规则条斑，后变褐色，花茎也可被侵染并引起枯萎，风信子叶片、球茎危害症状见图 。图 犃 风信子叶片、球茎危害症状（引自 犚 犕犻 犵 犾 犻 狀 狅）犃 传播途径病菌存活于鳞球茎内，并可从球茎传播至叶片，早春病害可通过风雨在农田内传播，另外，农机具的耕作刀具的使用都可以导致病菌从病株传播到健株上。犛 犖犜 附录犅（资料性附录）犖 犃培养基配方牛肉浸膏 蛋白胨 琼脂 酵母膏 氯化钠 蒸
11、馏水 调整 至，湿热灭菌 。犛 犖犜 附录犆（资料性附录）实验室检测鉴定流程图图犆 实验室检测鉴定流程图犛 犖犜 在培养基上培养阴性不符分子生物学检测(未进行分子检测的)阴性附录犇（资料性附录）菌落特征及接种症状图 犇 在 犖 犃培养基上犱的菌落特征图犇 犡犺 狔 犪 犮 犻 狀 狋 犺 犻菌体扫描电镜图片犛 犖犜 图 犇 接种犱 犱后风信子花序症状犛 犖犜 附录犈（规范性附录）实时荧光犘 犆 犚检测方法犈 细菌 犇 犖 犃模板的制备无菌操作下，将纯化后的待测菌制成菌悬液，或取可疑植物组织，按照细菌基因组 提取试剂盒方法或常规细菌核酸提取方法提取基因组，测定 浓度，保存备用。犈 引物与探针：探
12、针：犈 犘 犌 犚反应体系体系为：，引物（）各，探针（），模板，去离子水。犈 犘 犆 犚反应条件 预变性 ；，；，；，同时收集 荧光信号；进行 个循环；最后 延伸 。犈 犘 犆 犚结果判定 反应 值，结果判定为阳性：值，结果判定为阴性；值，需重做实验。犛 犖犜 参考文献东秀珠，蔡妙英 常见细菌系统鉴定手册 北京：科学出版社，王金生 植物病原细菌学 北京：中国农业出版社，许志刚 拉汉 汉拉植物病原生物名称 北京：中国农业出版社，任欣正 植物病原细菌的分类和鉴定 北京，中国科学院植物研究所 新编拉汉英植物名称 北京：航空工业出版社，李怀方，刘风权，等园艺植物病理学北京：中国农业大学出版社，邵秀玲，
13、甘琴华，等利用实时荧光 技术检测风信子黄腐病菌植物检疫，（）：漆艳香，朱水芳，等 菜豆细菌性萎蔫病菌 基因克隆及犜 犪 狇 探针实时荧光 检测仲恺农业技术学院学报，（）：漆艳香，谢艺贤，等香蕉细菌性枯萎病菌实时荧光 检测方法的建立华南热带农业大学学报，（）：冯建军，许勇，等 免疫凝聚试纸条和犜 犪 狇 探针实时荧光 检测西瓜细菌性果斑病菌比较研究植物病理学报，（）：钱国良，胡白石，等 梨火疫病菌的实时荧光 检测 植物病理学报，（）：，犅 狌 狉 犽 犺 狅 犾 犱 犲 狉 犻 犪犵 犾 狌 犿 犪 犲，：张驰宇，张高红，等 四步法消除 实时定量 中引物二聚体的影响 中国生物化学与分子生物学报，（）：，犡 犪 狀 狋 犺 狅 犿 狅 狀 犪 狊 犺 狔 犪 犮 犻 狀 狋 犺 犻 ，犳 犻犿犃 犡 犪 狀 狋 犺 狅 犿 狅 狀 犪 狊 犺 狔 犪 犮 犻 狀 狋 犺 犻：，（）：犛 犖犜 书书书犜犖犛中华人民共和国出入境检验检疫行业标准风信子黄腐病菌检疫鉴定方法 中 国 标 准 出 版 社 出 版北京市朝阳区和平里西街甲号（）北京市西城区三里河北街 号（）总编室：（）网址 中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷开本 印张字数 千字 年月第一版 年月第一次印刷印数 书号：定价 元