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1、书 书 书中华人民共和国出入境检验检疫行业标准犛犖犜 韦塞尔斯布朗病抗体血凝抑制试验检测方法犙狌 犪 狉 犪 狀 狋 犻 狀 犲狆 狉 狅 狋 狅 犮 狅 犾犳 狅 狉犪 狀 狋 犻 犫 狅 犱 犻 犲 狊犪 犵 犪 犻 狀 狊 狋犠犲 狊 狊 犲 犾 狊 犫 狉 狅 犾犱 犻 狊 犲 犪 狊 犲狏 犻 狉 狌 狊犫 狔犎犐 发布 实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局发 布书 书 书前言本标准按照 给出的规则起草。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国北京出入境检验检疫局。本标准主要起草人：刘艳华、高志强、谷强、张伟、蒲静、乔彩霞、尹羿、汪琳、张利峰
2、、凌凤俊。犛犖犜 韦塞尔斯布朗病抗体血凝抑制试验检测方法范围本标准规定了进出口动物韦塞尔斯布朗病抗体的血凝抑制试验检测方法。本标准适用于进出口动物韦塞尔斯布朗病抗体的检测。缩略语下列缩略语适用于本文件。：磷酸盐缓冲盐水：血凝试验：血凝抑制试验：血凝单位设备、材料和试剂 设备 台式离心机。振荡器。冰箱。恒温箱。微量可调移液器。材料和试剂 孔型微量反应板。含 卵清蛋白的 和含 卵清蛋白的，配制方法见附录。阿氏（）液，配制方法见附录的。鹅红细胞悬液，配制方法见。韦塞尔斯布朗病血凝抗原，阳性血清和阴性血清。被检血清无菌采集动物血液，凝固后离心分离血清，灭活处理 后，置于或 保存备用。被检血清须采用高岭
3、土鹅红细胞吸附法去除非特异性凝集素。按如下方法进行处理：被检血清，加入 磷酸盐缓冲液，再加入 高岭土，充分振荡混合，室温作用 ，然后 离心 取上清，加入 鹅红细胞悬液，轻轻振荡，冰浴吸附 ，离心 ，吸取上清，即为 稀释的被检血清。犛犖犜 操作步骤 血凝试验（见表）在微量反应板的每孔均加入 含 卵清蛋白的。吸取 韦塞尔斯布朗病血凝抗原加入第孔，反复吹打混匀。从第孔吸取 液体加入第孔，混匀后吸取 液体加入第孔，如此对倍稀释至第 孔，第 孔混匀后吸弃。每孔加入 含 卵清蛋白的。每孔加入 鹅红细胞悬液（加之前，红细胞悬液要充分摇匀）。轻轻振荡混匀，在 下静置 后观察结果。血凝效价确定：对照孔（第 孔）
4、红细胞应呈现明显的纽扣状沉淀于孔底。将板倾斜，观察红细胞有无呈泪珠状流淌，完全血凝（不流淌）的抗原最高稀释倍数为该抗原的血凝效价，代表个血凝单位（）。根据 的结果，使用含 卵清蛋白的 配制的病毒抗原，以完全血凝的病毒最高稀释倍数作为终点，终点稀释倍数除以即为抗原的稀释倍数。例如表抗原效价为（），抗原的稀释倍数为（）。将 含个血凝单位的抗原用做等量倍比稀释，使每孔（）含有、和 ，每孔补加，再加入 鹅红细胞悬液，判定血凝结果与预期结果是否相符合。、孔红细胞应出现完全凝集，孔红细胞应出现 凝集，孔红细胞应不凝集。若不相符，应重新配制抗原，测定效价。表血凝试验 血凝抑制试验（见表）在微量反应板的每孔均
5、加入 含 卵清蛋白的。吸取 已经处理 稀释的被检血清加入第孔内，充分混匀后吸取 于第孔内，如此对倍稀释至第 孔，混匀后吸弃。最后孔不加血清，分别作抗原对照和空白对照。除空白对照孔外，每孔加入的抗原，空白对照孔加入 含 卵清蛋白的，在 下静置 。每孔加入 鹅红细胞悬液（加之前，红细胞悬液要充分摇匀）。犛犖犜 步骤孔号序号试验项日对照I 2 3 5 G 7 8 9 10 11 1 0.4%卵清蛋白的pH7.5 25 25 PBS/IL h 2 抗原倍比稀释/IL25J 25J 25J 25J 25J 25J 25J 25J 奔去3。.:1%卵清蛋白的pHJ.7 25 25 25 25 25 25
6、25 25 25 25 25 25 PBS/J1L 0.5%鹅红细胞/IL50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 J 作用时间及温度条件在20oC25 oC下静置60min 6 判定举例+1+1十1+1-1-1-1-1-1-1-1 轻轻振荡混匀，在 下静置 后观察结果。每次测定应设阳性血清和阴性血清对照，按被检血清进行系列稀释测定。表血凝抑制试验结果判定 判定时首先观察对照孔是否成立。红细胞凝集：红细胞均匀分散在孔底周围，将板倾斜，红细胞不流淌判为完全凝集，判定为血凝作用阳性，记作“”。无凝集：红细胞集中在孔底中央呈圆点、倾斜血凝板时呈泪珠状流淌，判定为不凝集或
7、血凝抑制，记作“”。血凝抑制价：以能使个抗原凝集红细胞作用完全被抑制的血清最高稀释倍数，称为该血清的血凝抑制价（如表的血凝抑制价为 ）。血凝抑制价大于或等于 为阳性，血凝抑制价等于 为可疑，需重复试验，重复试验结果仍为，判为阳性。犛犖犜 步骤孔号抗原空内序号试3命项目对照对照1 2 3 4 J 自7 8 9 10 l。.:1%卵清蛋白的pH5.7 25 50 PBS/L 卜2 被检血清倍比稀释/fLL25J 25J 25J 25J 25J。o 飞、唱h弃去3!lHAU抗原/L25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25。4 作用时间及温度条件在20oC25 oC下静置60m
8、in J 0.5%鹅红细胞/!LL 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 6 作用时间及温度条件在20oC 25 oC下静置60min 7 判定举例I-I-I-I十l十I+I十I+I十I+I 附录犃（规范性附录）含 卵清蛋白犘犅犛配制犃 犃液 磷酸二氢钠水溶液：，溶于蒸馏水中，最后稀释至 。犃 犅液 磷酸氢二钠水溶液：（或 或 ），加蒸馏水溶解，最后稀释至 。犃 含 卵清蛋白狆犎 犘犅犛的配制 液 液 氯化钠 卵清蛋白用蒸馏水定容至 ，过滤除菌后冰箱保存。犃 含 卵清蛋白狆犎 犘犅犛的配制 液 液 氯化钠 卵清蛋白用蒸馏水定容至 ，过滤除菌后冰箱保存。犛犖犜 附录犅（规范性附录）阿氏（犃 犾 狊 犲 狏 犲 狉 狊）液、鹅红细胞悬液配制犅 阿氏（犃 犾 狊 犲 狏 犲 狉 狊）液配制葡萄糖 二水合柠檬酸钠 柠檬酸 溶于蒸馏水，并稀释至 ，用 的或 的 调节至，用孔径为 的滤膜进行过滤除菌。犅 鹅红细胞悬液制备采集鹅血液与等体积阿氏液混合摇匀，用倍量生理盐水洗涤次，每次均以 离心 ，直至上清透明无色。配制红细胞悬液时，再用含 卵清蛋白 洗涤次，以 离心 ，取沉淀红细胞用含 卵清蛋白 配成体积分数为 鹅红细胞悬液，保存备用。犛犖犜