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1、以正式出版文本为准中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 51812020金鱼造血器官坏死病检疫技术规范Quarantine protocol for gold fish haematopoietic necrosis2020-12-30 发布2021-07-01 实施ICS 65.150CCS B 41中华人民共和国海关总署发 布以正式出版文本为准以正式出版文本为准SN/T 51812020I前 言本文件按照 GB/T 1.12020 给出的规则起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本文件由中华人民共和国海关总署提出并归口。本文件起草单位：
2、中华人民共和国深圳海关、深圳市检验检疫科学研究院。本文件主要起草人：贾鹏、王津津、刘莹、于力、郑晓聪、何俊强、刘荭、史秀杰、兰文升。以正式出版文本为准以正式出版文本为准1SN/T 51812020金鱼造血器官坏死病检疫技术规范1 范围本文件规定了检测鲤疱疹病毒 2 型的临床症状，检测的器材和设备，试剂和材料，采样，诊断方法及综合判定。本文件适用于金鱼造血器官坏死病的诊断、监测和检测。2 规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 66
3、82 分析实验室用水规格和实验方法GB/T 18088 出入境动物检疫采样GB 19489 实验室 生物安全通用要求3 术语、定义和缩略语本文件没有需要界定的术语和定义。下列缩略语适用于本文件。GFHN（golden fish haematopoietic necrosis）：金鱼造血器官坏死。CyHV 2（cyprinid herpesvirus 2）：鲤疱疹病毒 2 型。Ct（cycle threshold）：循环阈值。CTAB（hexadecyl trimethyl ammonium bromide）：十六烷基三甲基溴化胺。DNA（deoxyribonucleic acid）：脱氧核糖核
4、酸。dNTPs（deoxynucleotide triphosphates）：三磷酸脱氧核糖核苷酸。PCR（polymerase chain reaction）：聚合酶链式反应。4 概述金鱼造血器官坏死病（Gold Fish Haematopoietic Necrosis，GFHN）是由鲤疱疹病毒 2 型（Cyprinid Herpesvirus 2，CyHV 2）感染金鱼和鲫鱼等鲤科鱼类并引起发病的一种病毒性传染病（参见附录 A）。5临床症状金鱼等感染 GFHNV 后，表现为昏睡、食欲不振或废绝，鳃丝发白。濒死鱼可见大量血液从鳃盖下缘自然溢出，体表充血，腹部肿胀，眼眶基部充血。解剖后，可见肌
5、肉出血，脾肾不同程度出血，肝脾肿大，鳔点状出血。以正式出版文本为准2SN/T 518120206器材和设备6.1普通冰箱和超低温冰箱。6.2制冰机。6.3无菌组织研磨器。6.4二级生物安全柜。6.5冷冻高速离心机。6.6PCR 仪。6.7水平电泳仪。6.8凝胶成像仪。6.9实时荧光 PCR 仪。6.10不同规格的微量移液器，量程包括 0.5 L10 L、10 L100 L、100 L1 000 L。6.11高压灭菌器。6.12剪刀、镊子、酒精棉球、离心管和 PCR 管等耗材。7试剂和材料7.1水：符合 GB/T 6682 中一级水的规格。7.2磷酸盐缓冲液（见 B.1）。7.3CTAB 溶液（
6、见 B.2）。7.4抽提液 1（见 B.3）。7.5抽提液 2（见 B.4）。7.6无水乙醇，分析纯。7.7TE 缓冲液（见 B.5）。7.810PCR 扩增缓冲液（见 B.6）。7.9Taq 酶：-20 保存，避免反复冻融或温度剧烈变化。7.10dNTPs：含 dCTP、dGTP、dATP、dTTP 各 10 mmol/L。7.11TBE 电泳缓冲液（见 B.7）。7.12溴乙啶（见 B.8）。7.136上样缓冲液（见 B.9）。7.142实时荧光 PCR 预混液（见 B.10）。7.15PCR 用引物：浓度为 20 mol/L。上游引物 JF：5-GGACTTGCGAAGAGTTTGATT
7、TCTAC-3下游引物 JR：5-CCATAGTCACCATCGTCTCATC-3扩增 GFHNV 解螺旋酶基因 366 bp 的片段（参见附录 C.1）。7.16实时荧光 PCR 用引物和探针：浓度为 10 mol/L。上游引物 rtF1：5-TCGGTTGGACTCGGTTTGTG-3下游引物 rtR1：5-CTCGGTCTTGATGCGTTTCTTG-3探针：5-FAM-CCGCTTCCAGTCTGGGCCACTACC-BHQ1-3扩增 GFHNV DNA 聚合酶基因 92 bp 片段（参见附录 C.2）。8采样采样对象包括健康的、发病的和濒死的金鱼和鲫鱼等，采样数量按照 GB/T 18
8、088规定执行，以正式出版文本为准3SN/T 51812020实验室应符合 GB 19489 的规定。冰浴条件下，每 5 尾 10 尾鱼作为一个小样，每个小样至少采集 0.1 g 组织。体长小于 4 cm的鱼苗取整条鱼；4 cm6 cm 的鱼苗取所有内脏（含肾脏）；体长大于 6 cm 的鱼取肾、脾脏、鳃（用酒精棉球去除鳃表面黏液）、脑。9诊断方法9.1PCR 方法9.1.1设立对照从提取样品 DNA 起，均需要设立阳性对照、阴性对照、空白对照。取已知含有 GFHNV 的阳性组织作为阳性对照；取健康鱼组织作为阴性对照；取等体积的无菌去离子水作为空白对照。9.1.2核酸抽提（CTAB 法）无菌条件
9、下，将取得的组织在无菌研钵中进行匀浆，用预冷的磷酸盐缓冲液以1:10（质量:体积）将组织重悬，4 8 000 r/min 离心 5 min，取上清液待检。取450 L组织悬液加入1.5 mL的离心管，加450 L CTAB溶液，充分混匀，25作用2.5 h。向离心管中加 600 L 抽提液 1，剧烈振荡混匀 30 s 以上，12 000 r/min 离心 5 min。取上层水相（约 800 L）至新的离心管，加 700 L 抽提液 2，振荡混匀 30 s，12 000 r/min 离心 5 min。小心取上层水相（约 600 L）至新的离心管，加入 1.5 倍体积的预冷无水乙醇（约 900 L
10、），上下颠倒混匀后，-20 沉淀核酸 2 h 以上。12 000 r/min 离心 30 min，弃上清液。将离心管倒置于吸水纸上，室温干燥 30 min。向 DNA 沉淀中加 50 L TE 缓冲液，-20 保存备用。可使用同等效果的商品化核酸抽提试剂盒代替以上方法。9.1.3反应体系在反应管中加入 10PCR 扩增缓冲液 5 L、上下游引物（20 mol/L）各 1 L、dNTPs（10 mmol/L）1 L、Taq 酶（5 U/L）1 L，加双蒸水至总体积 50 L。将反应管瞬时离心后，置于 PCR 仪。9.1.4反应条件94 预变性 4 min；94 变性 1 min，60 退火 1
11、min，72 延伸 30 s，40 次循环；72再延伸 10 min。9.1.5琼脂糖凝胶电泳用 TBE 电泳缓冲液配制 1.5%的琼脂糖（含 0.5 g/mL 溴乙啶）凝胶板。将其放入水平电泳槽，使电泳缓冲液刚盖过胶面。取 5 L PCR 产物和 1 L 6上样缓冲液混匀后加入样品孔，5 V/cm电泳约 30 min，将凝胶置于凝胶成像仪观察结果。也可采用同等效果的其他方法，例如毛细管电泳分析仪。9.1.6测序对 PCR 扩增产物进行基因序列测定，并将测序结果与参考序列（参见附录 C）进行同源性比对，或在 Genbank 中进行序列同源性分析，同源性应大于 98%。9.1.7结果判定9.1.
12、7.1被检样品结果的判定均建立在阳性和阴性对照成立的基础之上。阳性对照可扩增出一条以正式出版文本为准4SN/T 51812020大小为 366 bp 的特异性条带。阴性对照和空白对照不能扩增出 366 bp 条带。9.1.7.2被检样品未扩增出条带，或者虽有条带但大小不是 366 bp，则判定为 PCR 方法检测结果阴性。若被检样品扩增出大小为 366 bp 的特异性条带，且测序结果与参考序列相符，判定为PCR 方法检测结果阳性。9.2实时荧光 PCR 方法9.2.1对照设立见 9.1.1。9.2.2核酸抽提见 9.1.2。9.2.3反应体系2实时荧光 PCR 预混液 10 L，上游引物（10
13、 mol/L）0.5 L，下游引物（10 mol/L）0.5 L，探针（10 mol/L）0.5 L，20ROX 荧光矫正试剂 1 L，模板 DNA 2.5 L，双蒸水 5 L，总体积 20 L。可使用其他等效的荧光 PCR 试剂盒代替以上反应体系。9.2.4反应参数将反应管瞬时离心后，置于实时荧光 PCR 仪。条件如下：95 2 min；95 15 s，58 45 s，40 次循环。可根据所使用仪器要求，经过等效性验证后，将反应参数作适当调整。9.2.5结果判定9.2.5.1被检样品结果的判定均建立在阳性和阴性对照成立的基础之上。当阳性对照 Ct 值小于35，阴性对照和空白对照无 Ct 值时
14、，实验成立。若实验对照不成立，应更换试剂和对照样品重新实验。9.2.5.2被检样品无 Ct 值，或 Ct 值大于 40，可判定实时荧光 PCR 方法检测结果阴性。9.2.5.3若被检样品 Ct 值小于等于 35，可判定实时荧光 PCR 方法检测结果阳性。9.2.5.4若被检样品 Ct 值大于 35 而小于 40，应调整模板浓度，重新实验。若重新实验后，Ct 值小于等于 35，判定为实时荧光 PCR 方法检测结果阳性；Ct 值大于 35，则判定为实时荧光 PCR方法检测结果阴性。10综合判定10.1对具有临床症状的鱼10.1.1PCR 方法检测结果为阳性，判定为 GFHN 检测结果阳性。10.1
15、.2实时荧光 PCR 方法检测结果为阳性，判定为 GFHN 检测结果阳性。10.2对没有临床症状的鱼10.2.1PCR 方法检测结果阳性，判定为 GFHN 检测结果阳性。10.2.2实时荧光 PCR 方法检测结果为阳性，判定为 GFHN 检测结果可疑。以正式出版文本为准5SN/T 51812020附录A（资料性）金鱼造血器官坏死病金 鱼 造 血 器 官 坏 死 病（Goldfish Haematopoietic Necrosis，GFHN）是 由 鲤 疱 疹 病 毒 2 型（Cyprinid Herpesvirus 2，CyHV 2）引起金鱼等鲤科鱼类死亡的一种病毒性传染病。该病对鱼卵、鱼苗、
16、鱼种和亲鱼均可感染，危害严重，一旦暴发死亡率达 80%以上。金鱼等感染后，临床症状包括精神沉郁，昏睡，食欲不佳或厌食，呼吸频率增加，患病鱼停留在池塘或水箱底部，解剖后可见鳃苍白，脾和肾肿胀并呈苍白色，偶尔能见多处白色病灶，肝苍白，肠道空，鳔呈瘀斑性出血。患病金鱼鳍上有水泡状脓疱，有些鱼还表现腹部膨大，眼球突出。最初，对 GFHN 的病原定义为金鱼造血器官坏死病毒（Goldfish Haematopoietic Necrosis Virus，GFHNV），后因该病原是第二个分离自鲤科鱼类的疱疹病毒，按照国际病毒系统分类委员会的系统命名规则，正式命名为鲤疱疹病毒 2 型。CyHV 2 是一种大小为
17、 290 304 bp、二十面体、病毒粒子直径约 120 nm、有囊膜的双链 DNA 病毒，属于疱疹病毒目（Herpesvirrales）鱼疱疹病毒科（Alloherpesviridae）鲤疱疹病毒属（Cyprinivirus）。该病主要发生在春秋季节，但主要受水温影响，15 25 易发病。水温高于 25 时，发病率降低。GFHNV 与其他疱疹病毒相似，也能够形成潜伏感染，带毒鱼成为传染源。CyHV 2 分布广泛，全球多个国家或地区均有分布，包括日本、中国、美国、英国、澳大利亚和捷克共和国等。实践工作中，由于缺乏敏感细胞系，病毒分离方法不是目前检测 GFHN 的有效方法，主要通过分子生物学方法
18、进行检测。以正式出版文本为准6SN/T 51812020附录B（规范性）试剂及配制B.1磷酸盐缓冲液（PBS，0.01 mol/L，pH 7.2）每升蒸馏水中加入氯化钠 8 g、氯化钾 0.2 g、碳酸氢钠 1.15 g、磷酸二氢钾 0.2 g，经 121、15 min 高压灭菌，4 备用。B.2CTAB 溶液NaCl 8.19 gEDTA 0.744 gTris-HCl 1.12 g超纯水 60 mL充分混匀后，用盐酸调节溶液 pH 值至 7.58.0，加入 CTAB 2 g，充分搅拌溶解，用超纯水定容至终体积 100 mL。使用前加巯基乙醇至终浓度为 0.25%。B.3抽提液 1用 1.0
19、 mol/L pH（7.90.2）Tris 过饱和酚:三氯甲烷:异戊醇按 25:24:1 的比例混合，密闭避光保存。B.4抽提液 2将三氯甲烷和异戊醇按 24:1 的比例混合，密闭避光保存。B.5TE 缓冲液（pH 8.0）1 mol/L Tris-HCl 缓冲液（pH 8.0）10 mL0.5 mol/L EDTA（pH 8.0）2 mL加入约 800 mL 的去离子水，均匀混合。溶液定容至 1 000 mL。高温高压灭菌后，4 保存。B.610PCR 扩增缓冲液KCl 500 mmol/LTrisCl（pH 8.3，室温）100 mmol/LMgCl2 15 mmol/L明胶 0.1%B.
20、7TBE 电泳缓冲液（10 倍浓缩液，pH8.3）Tris 108 g以正式出版文本为准7SN/T 51812020硼酸 55 gNa2EDTA.2H2O 2.9 g加水定容至 1 000 mL，用 5.00 mol/L 的 HCl 调 pH 至 8.3。B.8溴乙啶用水配制成 10 mg/mL 的浓缩液。每 10 mL 琼脂糖溶液中加 1 L 溴乙啶。B.96上样缓冲液溴酚蓝 100 mg，加双蒸水 5 mL，在室温下过夜，待溶解后再称取蔗糖 25 g，加双蒸水溶解后移入溴酚蓝溶液中，摇匀后定容至 50 mL，加入 NaOH 溶液 1 滴，调至蓝色。B.102实时荧光 PCR 预混液为商业试
21、剂。主要成分为 AmpliTaq Gold DNA Polymerase，UNG 酶，含有 dUTP 的 dNTPs，实时荧光 PCR 缓冲液。可采用同等效果的其他试剂。以正式出版文本为准8SN/T 51812020附录C（资料性）PCR 扩增目的基因序列C.1 PCR 扩增的目的序列ggacttgcgaagagtttgatttctacacgcctcgcatcatgcatcaggacaacgcggtcagacaactcaacgagtcttgtatgaaaaagactgtgggcgccgaacggatcttcaagcccaagatcaatcacaataacgtgcagaacccggacgagcg
22、tagaaagtttgcagccgtggtccgtcaacggttcaagcacattgacttctttcaaggcgtccgaatcaaggtcggatctctggtgtgcgtactaaaatatcaaactcaagtgtttgaaggctgtctgggaatagtggaatcagtacaacccgtcatggtacgcctttttttgtttgtttgtttgtttgatgagacgatggtgactatgg在 GFHNV 解螺旋酶 311 bp676 bp 位置设计引物，扩增产物大小为 366 bp。C.2 实时荧光 PCR 扩增的目的序列tcggttggactcggtttgtgacc
23、tacaccgcttccagtctgggccactacctctctatgagatctcagtacaagaaacgcatcaagaccgag以 GFHNV 参考毒株（Genbank AY939863）DNA 聚合酶基因为参考序列，设计引物和探针，扩增产物大小为 92 bp。以正式出版文本为准以正式出版文本为准SN/T 51812020中华人民共和国出入境检验检疫开本 8801230 1/16 印张 1 字数 28 千字2021 年 6 月第一版 2021 年 6 月第一次印刷印数 1500书号：155175150 定价 18.00 元金鱼造血器官坏死病检疫技术规范行 业 标 准SN/T 51812020*北京市朝阳区东四环南路甲 1 号（100023）编辑部：（010）65194242-7509中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷中国海关出版社有限公司出版发行网址