《GA∕T 1965-2021 法庭科学 硅藻rbcL基因特异片段检测 毛细管电泳荧光检测法(公共安全).pdf》由会员分享，可在线阅读，更多相关《GA∕T 1965-2021 法庭科学 硅藻rbcL基因特异片段检测 毛细管电泳荧光检测法(公共安全).pdf（9页珍藏版）》请在taowenge.com淘文阁网|工程机械CAD图纸|机械工程制图|CAD装配图下载|SolidWorks_CaTia_CAD_UG_PROE_设计图分享下载上搜索。
1、 ICS 13.310 CCS A 92 中 华 人 民 共 和 国 公 共 安 全 行 业 标 准 GA 法庭科学 硅藻rbcL 基因特异片段检测 毛细管电泳荧光检测法 Forensic sciences Methods for detection of rbcL gene of diatom Capillary electrophoresis and fluorescence method（报批稿）-发布-实施 中华人民共和国公安部 发 布 GA/T XXXXXXXX GA/T XXXXXXXX I 前 言 本文件按照GB/T 1.12020标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草
2、规则的规定起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本文件由全国刑事技术标准化技术委员会（SAC/TC 179）提出并归口。本文件起草单位：广州市刑事科学技术研究所、中山大学、广东省公安厅。本文件主要起草人：刘超、徐曲毅、刘宏、赵建、肖成、李越、汪冠三、刘长晖、杨幸怡、徐际超。GA/T XXXXXXXX 1 法庭科学 硅藻rbcL 基因特异片段检测 毛细管电泳荧光检测法 1 范围 本文件规定了法医物证检验水中尸体组织中硅藻的材料准备、操作方法、PCR扩增硅藻叶绿体核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶大亚基基因特异片段和实时荧光定量检验结果判定及注意事项。本文件
3、适用于法庭科学检验中对硅藻rbcL基因片段的检验。2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GA/T382-2014 法庭科学DNA实验室建设规范 GA/T383-2014 法庭科学DNA实验室检验规范 3 术语和定义 下面界定的术语和定义适用于本文件。3.1 rbcL 基因 rbcL gene 叶绿体核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶大亚基基因。4 原理 在溺死过程中，肺泡-毛细血管屏障损伤导致水中的浮游生物（如硅藻）随溺液进入血液循环，
4、从而到达人体内各器官。检测这些浮游生物的存在，可用于诊断溺死。溺死相关硅藻（舟形藻、菱形藻、小环藻、变异直链藻、针杆藻、骨条藻等）的叶绿体中含有rbcL基因，该基因片段与人类及共生菌没有同源性。在水中尸体的体循环器官（肝脏或肾脏）中检测到该基因的特异片段，可证实溺死相关硅藻DNA的存在。5 仪器设备 包括：a)可调微量移液器（2 L，10 L，100 L，1000 L）；b)高速台式冷冻离心机，可控温至 4 且离心速度可达 12000 r/min 以上；c)PCR 扩增仪；d)实时荧光定量 PCR 扩增仪；e)毛细管电泳仪；GA/T XXXXXXXX 2 f)超净工作台；g)高压灭菌锅；h)涡
5、旋仪。6 试剂耗材 6.1 DNA 提取试剂，以 Powersoil 土壤 DNA 提取试剂盒为例：a)细胞裂解液，常温保存；b)石英砂，常温保存；c)20 mg/mL 蛋白酶 K，4 保存；d)抑制因子去除溶液，常温保存；e)蛋白沉淀溶液，常温保存；f)DNA 结合盐溶液，常温保存；g)硅膜离心纯化柱，常温保存；h)乙醇冲洗液，常温保存；i)DNA 溶解液，常温保存。6.2 参考 SYBR Green 实时荧光定量 PCR 扩增试剂及引物：a)rbcL（F）：5 CTCAACCATTCATGCG 3；b)rbcL（R）：5 CTGTGTAACCCATAAC 3；c)SYBR Green Pr
6、eMix 荧光染料预混酶；5 U/L，-20 保存。6.3 参考 PCR-CE 扩增电泳试剂及引物：a)rbcL（F）：5FAM-CTCAACCATTCATGCG 3；b)rbcL（R）：5 CTGTGTAACCCATAAC 3；c)PCR PreMix Taq 酶；5 U/L，-20 保存；d)甲酰胺；e)分子量内标（75 bp500 bp）；f)POP-4 胶；g)纯水；h)透明薄壁 PCR 管（0.2 mL）；i)96 孔微孔板；j)离心管（0.5 mL 和 2 mL）。7 实验室环境要求 符合GA/T382-2014的要求。8 操作步骤 GA/T XXXXXXXX 3 8.1 样本准备
7、 8.1.1 剪取尸体的肺、肝、肾样本各 0.5 g，加入 600 L DNA 提取裂解液，匀浆裂解；8.1.2 样本匀浆裂解液，按照 DNA 提取试剂盒使用说明提取 DNA，调整 DNA 浓度至 0.51.0 ng/L，-20 分装保存待检。8.2 实时荧光定量 PCR 检测 采用20 L qPCR反应体系：SYBR Premix Ex Taq II（2）：10 L，正向引物及反向引物各0.5 L，DNA模板2 L，纯水7 L，反应参数见附录A中A.1。8.3 PCR-CE 毛细管电泳分离检测 8.3.1 样品PCR准备 8.3.1.1 取出冷藏的 PCR-CE 扩增试剂使其温度达到室温，轻
8、弹混匀，离心。8.3.1.2 准备扩增样品、阳性对照、阴性对照、PCR 反应管，编号并进行扩增，PCR-CE 扩增体系为20 L，并参照附录 A 中 A.2 计算反应用量。8.3.1.3 按照计算结果混合各种成分，混匀、离心，分装到透明薄壁 PCR 管内。8.3.1.4 将透明薄壁 PCR 管放入扩增仪中，见附录 A 中 A.3 中设定的程序运行。8.3.1.5 扩增产物置于 4 保存。8.3.2 毛细管电泳分离检测 8.3.2.1 在 1 mL 甲酰胺中加入 50 L 分子量内标，配制成上样混合液，涡旋混匀。8.3.2.2 在 96 孔微孔板的样本测试孔中，加入 10 L 上样混合物和 1
9、L 扩增产物，3000 r/min 离心 30 s，去除气泡。8.3.2.3 95 变性 3 min，立即放置冰上冷却 3 min，待测。8.3.2.4 将加样变性后的 96 孔微孔板，置于遗传分析仪中进行电泳检测。详细电泳步骤参见毛细管电泳仪厂家配套的操作手册。8.3.2.5 电泳完毕后，使用数据分析软件进行分析，获得扩增产物的片段长度。详细分析步骤参见分析软件厂家配套的操作手册。9 结果判断 9.1 根据实时荧光定量 PCR 仪的数据分析软件使用说明（以 QuantStudio 6 and 7 Flex Real-Time GA/T XXXXXXXX 4 PCR System Softwa
10、re,v1.0 为例），若 Ct 值小于等于 35，且呈现典型的扩增曲线，则可判定为阳性结果，样品扩增曲线参考附录 A 中 A.4，熔解曲线参考附录 A 中 A.5；若 Ct 值大于 35，或无扩增信号，则可判定为阴性结果。9.2 当扩增产物电泳分析结果，出现特异性片段的荧光峰，则表明该检测样本含有硅藻。样品检测结果参照附录 A 中 A.6。不同批次检测的标准株阳性对照样本的特异性片段可能有长度差异，结果判断时按 10.6 判定。9.3 当电泳分析结果未出现荧光峰时，样本仍有可能含有硅藻，需做进一步的检测分析。10 注意事项 10.1 扩增试剂与检测试剂需分开保存：Premix Taq 酶于-
11、20 保存；荧光引物、分子量内标需 4 避光保存，长期保存需置于-20。10.2 有效检测信号峰值应大于 150 RFU（RFU：相对荧光单位）以上。当检测信号峰值超过仪器检测最高阈值时，应减少上样量重新电泳检测。10.3 检验中应做已知标准藻株的阳性对照、空白对照和非溺死的人类 DNA 的阴性对照。10.4 在阳性对照和阴性对照均正确的前提下，样品检验过程方可判定为可靠。10.5 本文件中所列分析数据为使用遗传分析仪电泳检测（以 3500 遗传分析仪检测和 GeneMapper ID-X 软件分析为例），系统误差为0.5 bp。不同的检测条件可能会导致样本检测结果出现系统误差，需参考同批次检
12、测的阳性对照结果进行分析。10.6 应使用硅藻标准株（舟形藻、菱形藻、小环藻、变异直链藻、针杆藻、骨条藻等）提取DNA制作阳性对照样本与尸体样本同步按8.3的方法进行扩增检测，两者均出现特异性扩增峰结果时，可判定尸体样本结果为阳性。10.7 若实时荧光定量 PCR 的扩增曲线未出现平台期，呈非典型扩增，可适当增加循环数，重新检测。GA/T XXXXXXXX 1 附录A（资料性）法庭科学 硅藻rbcL基因特异片段检测 毛细管电泳荧光检测法相关资料 A.1 表A.1提供了本文件中硅藻rbcL基因特异片段实时荧光定量PCR检测体系反应参数。表A.1 硅藻rbcL基因特异片段实时荧光定量PCR检测体系
13、参考的反应参数 反应 温度（）时间（s）循环数 实时荧光定量PCR 预变性 95 300 1 变性 95 5 40-45 退火 60 25 延伸 熔解曲线分析 95，1 min；60，1 min；升温至95，升温过程中收集信号。1 A.2 表A.2提供了本文件中硅藻rbcL基因特异片段PCR-CE扩增检测体系。表A.2 硅藻rbcL基因特异片段实时荧光定量PCR-CE扩增检测体系参考组分 试剂 用量(L)PreMix Taq酶 10 引物（10 mol/L）1.5 纯水 7.5 模板DNA（0.51.0）ng 1.0 注：DNA模板量控制在（0.51.0）ng；对于DNA量较少的样品，在扩增时
14、可增加模板用量，并用纯水补足20 L体系。A.3 表A.3提供了本文件中 硅藻rbcL基因特异片段PCR-CE扩增体系反应参数。表A.3 硅藻rbcL基因特异片段实时荧光定量PCR-CE扩增检测体系参考的反应参数 程序 温度（）时间（min）循环数 预变性 95 10 1 变性 94 1 35 退火 47 1/延伸 72 1/终延伸 72 7 1 4/GA/T XXXXXXXX 2 A.4 rbcL引物扩增硅藻标准株的qPCR扩增曲线见图A.4。图A.4 rbcL引物扩增硅藻标准株的qPCR扩增曲线 A.5 rbcL引物扩增硅藻标准株的qPCR熔解曲线见图A.5。图A.5 rbcL引物扩增硅藻标准株的qPCR熔解曲线 GA/T XXXXXXXX 3 A.6 rbcL引物扩增硅藻标准株标准株的电泳图谱A.6。图A.6 rbcL引物扩增硅藻标准株标准株的电泳图谱