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1、中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 3750-2013 苹果壳色单隔抱溃殇病菌检疫鉴定方法Deecion and identification of Botryospherzstevensii Shoemaker 2013-11-06发布2014-06-01实施中华人民八芳和国发布国家质量监告恒L在疫总局SN/T 3750-2013 目IJ 本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。本标准由同家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位:中华人民共和同广东出人境检验检疫局、中同检验检疫科学研究院。本标准主要起草人:王卫芳、张秋娥、黄英、严进、华丽OSN/T 3750-2
2、013 苹果壳色单隔抱溃殇病菌检疫鉴定方法1 范围本标准规定了植物检疫中苹果壳色单隔抱溃病病菌的检疫鉴定方法O本标准适用于苹果壳色单隔子包溃癌病菌所有寄主植物的原木、枝条、苗木和果实的检疫鉴定O2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的O凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件Q凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。SIjT 2122 进出境植物及植物产品检疫抽样3 原理依据苹果壳色单隔于包溃殇病菌的为害症状、菌落特征、病菌的无性型和有性型形态进行该病菌的检疫鉴定。4 试剂及仪器设备4.1 培养基及试剂马铃薯葡萄糖琼脂培养基CPDA:每1000
3、 mL PDA由200g去皮马铃薯，20g葡萄糖，18 g琼脂配制而成)、燕麦琼脂培养基COA:每1000 mL OA由30g燕麦片，20g琼脂自己制而成),100%乳酸、1%的次氯酸铀CNaOCl)、70%乙醇、无菌水。4.2 仪器与设备立体显微镜、生物显微镜(具油镜和测微尺)、普通天平(感量。.1g)、超净工作台、生物培养箱、高斥灭菌器、载玻片、盖玻片、打孔器(直径4mm)0 5 检疫与鉴定5.1 症状检查检查抽取的原木、木制品、枝条和苗木树皮的表面是否有溃房，枝条是否有枯死症状，检查果实是否有腐烂症状(症状描述和阵|片参见A.3、罔B.1)0 按SN/T2122抽样，将有可疑症状的样品带
4、回实验室作进一步检验。5.2 实验室鉴定5.2.1 样品中的病菌形态学观察从树皮上采集子实体，横切片后，将切片组织转移到滴有无菌水的载玻片上，在常温下晾干后加SN/T 3750-2013 1滴100%乳酸并盖上盖玻片，制成非永久性玻片O观察子实体(尤其是子座)的形态特征，记录分生于包子、产咀细胞或者子囊、子囊于包子的形态。分别测量50个子囊于包子、子囊、分生于包子和产子包细胞、10个无性型子座和10个有性型子座的大小，拍摄并保存数码照片，同时将子实体转入培养基巾纯化保存。5.2.2 分离培养在样品中如果没有发现病原菌的子实体，则采用组织分离培养法，分离病部的病原菌。取发病部位的病健交界组织，切
5、成4mmX4 mm的小块，用1%的NaOCl表面消毒10min，无菌水冲洗3遍，置于直径9cm的PDA平板上，每皿放16块，于25oc条件下12h黑暗/光照培养，将长出的菌落边缘的菌丝转至新的PDA平板上纯化。5.2.3 分离物培养性状和形态学观察将纯化后的菌株在PDA平板上培养6d，采用火焰消毒的打孔器从菌落上打取直径4mm的菌丝体块，转移到新的PDA平板上，在全黑暗条件下，分别于20oc、25oc进行培养，每处理重复3次，观察菌落形态、计算菌落的生长速度、分生于包子器形成的速度。待分生于包子器形成后，观察分生于包子器及分生于包子的形态.测量其大小，拍摄并保存数码照片。6 鉴定特征6.1 菌
6、落特征在PDA平板上，菌落圆形，初期白色，培养5d6 d后呈深橄榄色，且有大量的气生菌丝生成，在20 oc、25oc黑暗条件下菌落生长速率分别为6mm/d、11mm/d。培养至6d菌落巾央即现纠结成粒状的大量黑褐色分生于包子器。培养至9d少量的分生于包子器顶部即现白色站稠状分生于包子团，培养至15 d整个培养皿布满黑褐色分生于包子器，并且喷出大量白色于包子团(菌落特征罔参见罔B.2)。6.2 无性繁殖器官的形态分生于包子器，单生或聚生，埋生于黑色的子座上，成熟时部分开裂，深褐色至黑色，近球形，直径可达600m，壁由三层组成，外层黑褐色，由厚壁细胞组成，巾间层由深褐色的薄壁细胞组成，内层由透明的
7、薄壁细胞组成。孔口居巾，圆形，具乳突。分生于包子梗圆柱形，透明，无隔膜，极少数分支具隔膜O产于包细胞(1l)1215J!LmX(45)!Lm，外生芽殖型产捆，离散，圆柱形，透明，光滑，无限生长。分生于包子器成熟后喷射出白色分生于包子国O分生于包子透明，光滑，厚壁，长椭圆形至卵形，大小(23.5)25.125.7(27.4)JmX(12.4)13.2 13.5(14.3)m，平均大小为(25.4土1.0)mX(l3.4土0.5)m，长/宽比率为1.9土0.10分生于包子初无色透明，无隔膜-随着培养时间的延长，分生于包子转为褐色，多具1隔膜，少数23隔膜。6.3 有性繁殖器官形态在自然条件下，如树
8、皮的坏死部位，无性型和有性型可同时产生于同一子座内或不同的子座内O子囊座单腔室，单生或聚生，埋生，成熟时部分开裂，球形，直径可达300!Lm，深褐色至黑色，壁厚，外层由深棕色的厚壁细胞组成，内层由透明的薄壁细胞组成。孔口巾生，圆形，具乳突O拟侧丝透明，具分支，具隔膜，宽2m3mo子囊棍棒状，具柄，双囊壁，大小为(lOO160)!LmX(l422)m(包括柄)，内含8个子囊子包子，双侧排列o子囊子包子大小为(24.8)30.8 32.1(36.2)m X(9.5)11.2 11.7(13.4)Jm，长宽比为2.8土0.3，梭形，巾间宽，两端钝圆，透明，壁薄，光滑，初期元隔膜，后期变为淡褐色具1隔
9、膜，极少数有2个隔膜(病菌的有性型形态罔参见罔B.4)0 2 SN/T 3750-2013 7 结果判定如病原菌的培养性状与形态特征与6.1、6.2、6.3描述的鉴定特征相吻合，即可确定为苹果壳色单隔抱溃殇病菌。8 菌种保存分离获得的苹果壳色单隔子包溃癌病菌，应转人燕麦琼脂培养基试管斜面上，置于4oc黑暗条件下保存至少12个月，以备复验、谈判和仲裁。3 SN/T 3750-2013 附录A(资料性附录)苹果壳色单隔抱溃痛病菌背景资料A.1 学名及分类地位学名:Botry户haeri五tevensiiShoemaker 异名:Botryodilodiarnalorurn(Berk.)Petr.忌
10、.Syd.无性态:Dilodiarnutila CFr.)Mont.分类地位:子囊菌门CAscomycota)，座囊菌日CDothideales)，葡萄座腔菌科(Botryosphaeriaceae),葡萄座腔菌属(Botos户haeria)。A.2 分布亚洲:印度。非洲:摩洛哥。北美洲:加拿大、美国Q南美洲:委内瑞拉、秘鲁O大洋洲:澳大利亚、新西哇o欧洲:阿尔巴尼亚、保加利亚、德同、意大利、匈牙利、波兰、葡萄牙、西班牙、瑞典、乌克兰、英同。A.3 症状苹果壳色单隔于包溃殇病菌CB.可tevensii)主要为害寄主植物的叶和枝干，在不同寄主上的为害症状较相似O在苹果和梨上，主要引起枝干溃房及干
11、枯症状。在致病性测定时，接种苹果树6周后，枝条出现溃殇症状，接种7d 14 d的苹果果实表现出腐烂病斑。橡树被B.stevensii侵染后，主要引起树皮坏死或在枝条上尤其是枝条的顶端形成直径2cm6 cm 的溃房，并伴有流胶症状Q当病斑包围了枝干以后，其顶端很快萎焉随后枯死，叶片变黄并最后萎焉，焉萎的叶片通常依旧粘附在死亡的枝干上。在病部有可能观察到分生于包子器，看起来像黑色的服包。坏死的树皮很容易被剥掉，露出黑色的韧皮部o在其他阔叶树上，B.stevensii可引起类似的症状，例如，在欧洲白蜡的嫩枝上，树皮上形成黑褐色坏死斑，有时会引起叶子变色及萎焉。在意大利西西里岛上，5年7年树龄的花样枝
12、条坏死并开裂，溃痛下面的嫩条和顶端坏死。在柏树上，被B.steverz si i感染后，会引起新枝基部溃扇，顶端变为黄色或褐色OA.4 传播途径该菌可以菌丝、子座和分生于包子器在发病枝干的树皮内越冬，或以菌丝在枝条和芽内越冬，当环境条件适宜时开始侵染。B.steve川II的分生于包子在整个生长季节均可通过风雨传播:雨滴可溶解包有分生于包子的流胶.并使它们溅起，在风的作用下转移到新的寄主上。同时，在风的作用下，子囊于包子的传播更加容易。在意大利中部，B.stevensii可通过一些长蠢科昆虫(Sirzoxylorz如rjr川s，S.比xdentatum),SN/T 3750-2013 以及一些吉
13、I科昆虫叮rehusfZentz川s)在橡树间传播。当分生于包子器裂开时，它们会用分生于包子将自己覆盖起来，并作为新侵染的媒介。该菌可随寄主植物的茎、枝条、叶、苗木及果实的调运进行远距离传播。A.5 寄主范围苹果壳色单隔于包溃殇病菌寄主广，包括11科、18属(参见表A.l)0 表A.1苹果壳色单隔抱溃痛病菌的寄主种类科|属蔷薇利-Rosaceae 葡萄科Vitaceae棕榈科Palmae壳斗科Fag口ae水犀利-01eaceae 柏科Cuprcssaccac榆科Ulmaceae十章和十La盯缸cac胡桃利-Jugla口daceae含羞草:科Mimosaceae豆科Legu日l1Tlosae苹果
14、属Malus(M.domestica,M.户umil，lVI.s.yluestris)，李属Prunus(李P.salicina，桃P.户旷日ca，稠李P.户adus，杏P.armenlaca)，梨属Pyr(梨P.communis)，十比中巴属Eriobotrya(十比把E.jaonica)葡萄属Vitis(葡萄V.vini卢ra)棕榈属Trachycaru:;(棕榈T.furtunei)，刺葵属Phoenix(海枣I.dactylifera)，假槟挪属Archonlohoeni:x(假槟挪A.le:xandrae)标属Q盯erc s(欧沙洲|川栓皮标Q.s川ul:衍r附r，卢橡树Q.al白蜡
15、树属F阳ui、丁Z川川s(欧洲白蜡水F.口celsiur)圆柏属Shinaspp.，刺柏属Juni户eru:川沙皮刺柏J.Sabina，刺柏J.:户uLorwn)，扁柏属Ch阳ecyris(美同扁柏C.lwsot)榆属Ulmu:、(榆树U.户U7月il)晦梨属Persea(晦梨P.americw)山核桃属Carya(美同薄壳I11核桃C.Illinuiensis)金什欢属Acacia(金什欢A.fanwsi川w)长角豆屑。ratonia(长角豆C.siliqua)d SN/T 3750-2013 附录B(资料性附录)苹果壳色单隔抱溃痛病症状、病菌菌落及形态特征图说明:12 病菌在树枝和树干上形
16、成的症状;34 病菌在树皮表面形成分生于包子器O注:罔片来自PaulRachi:http:/www.forestryimages.org/support/contactus.cfm。图B.1 B.stevensii侵染Cryaillinoinensis的病状及病征2 说明:l 在PDA上拈养3d;2 在PDA上拈养14d(可见颗粒状分生于包子器)。注:菌株来源:美国菌种保藏中心，菌株编号:ATCC MYA-3696T川，图片拍摄:张秋娥。图B.2B.stevensii的菌落特征6 SN/T 3750-2013 说明:1 载抱体;2 载于包体纵切面;3 产生分生于包子的子座腔室纵切面;4 产生大
17、型分生于包子的产抱细胞;5 产生小型分生于包子的产抱细胞;6 产生大、小型分生抱子的分生于包子器腔纵切面的一部分;78 大型分生于包子(O3隔膜)。注:标尺:图片45、7l:llJ.m，图片6:2!J.mc图片12、45来自Alvcs，儿，图片3来自Vajna，L.，图片6l王丑芳拍摄。68菌株来源:美同菌种保藏中心，菌株编号:ATCC MY A-3696 0 图B.3B.stevensii无性繁殖器官形态图7 SN/T 3750-2013-说明:1 子囊座;2 子囊座纵切由;3 子幸运;4 子主运子包子O注:标尺:图片2:100，um，图片3:20m，图片4:10，umc图片14来自Alve
18、s，A.等。图B.4B.stevensii有性繁殖器官形态图8 SN/T 3750-2013 参考文献lJ Alves,A.,Correia,A.,Luque,上，andPhillips,A.2004.Btry5haerirti归，spnov.o丑Quercus species,with notes and description of Btry户haeiastevensii and its anamorph,Di户1diamutila.Mycologia 96:598-613.2J Sa盯hez，M.E.,Venega日，上，Romero,M.A.,Phillips,A.J.L.,and T
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