《SN∕T 5386-2021 葡萄灰皮诺病毒检疫鉴定方法(出入境检验检疫).pdf》由会员分享，可在线阅读，更多相关《SN∕T 5386-2021 葡萄灰皮诺病毒检疫鉴定方法(出入境检验检疫).pdf（16页珍藏版）》请在taowenge.com淘文阁网|工程机械CAD图纸|机械工程制图|CAD装配图下载|SolidWorks_CaTia_CAD_UG_PROE_设计图分享下载上搜索。
1、以正式出版文本为准I C S6 5.0 2 0.0 1C C SB1 6中华人民共和国出入境检验检疫行业标准S N/T5 3 8 62 0 2 1 葡萄灰皮诺病毒检疫鉴定方法D e t e c t i o n a n d i d e n t i f i c a t i o n o f G r a p e v i n e P i n o t g r i s v i r u s2 0 2 1-0 6-1 8发布2 0 2 2-0 1-0 1实施中华人民共和国海关总署发 布以正式出版文本为准以正式出版文本为准前 言本文件按照G B/T 1.12 0 2 0 标准化工作导则 第1部分:标准化文件的结构
2、和起草规则 的规定起草。本文件由中华人民共和国海关总署提出并归口。本文件起草单位:中华人民共和国北京海关、北京爱普拜生物技术有限公司、中国检验检疫科学研究院。本文件主要起草人:邓丛良、赵晓丽、向军、郑祖亮、刘兴亮、郑春生、吕玉峰。S N/T5 3 8 62 0 2 1以正式出版文本为准以正式出版文本为准葡萄灰皮诺病毒检疫鉴定方法1 范围本文件规定了葡萄灰皮诺病毒的检疫鉴定方法。本文件适用于可能带有葡萄灰皮诺病毒的葡萄苗木、接穗及其产品的检疫鉴定。2 规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中,注日期的引用文件,仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引
3、用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。G B/T 6 6 8 2 分析实验室用水规格和试验方法3 术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1微滴式数字P C R d r o p l e t d i g i t a l P C R一种核酸单分子扩增技术,基于扩增前将混匀的P C R反应液被微滴发生器分成数万个单独的微反应,核酸分子分布在不同的微反应中,独立进行单分子P C R扩增,降低了可能存在的竞争,待荧光P C R反应结束后,逐一检查每个微滴是否有扩增发生,就可以精确测得待测D NA或R NA模板的分子数。注:不同于常规P C R和实时荧光P C R技术,该技术不需要制作标准
4、曲线,也与待测分子P C R扩增效率无关,可以直接测出样品中待测核酸模板的绝对数目,实现了D NA或R NA的绝对定量。4 葡萄灰皮诺病毒基本信息学名:G r a p e v i n e P i n o t g r i s v i r u s。缩写:G P GV。分类地位:线形病毒科(B e t a f l e x i v i r i d a e),纤毛病毒属(T r i c h o v i r u s)。传播途径:主要通过嫁接传播和机械传播。葡萄灰皮诺病毒的其他信息参见附录A。5 方法原理根据该病毒基因组特异性进行普通R T-P C R、实时荧光R T-P C R和数字R T-P C R检测
5、,通过电泳条带大小、扩增曲线、产生微滴的变化和基因组序列进行结果判定。1S N/T5 3 8 62 0 2 1以正式出版文本为准6 仪器设备和试剂6.1 仪器设备和用具电子天平(感量0.0 0 1 g)、普通天平(感量0.1 g)、高速冷冻离心机、超低温冰箱(-8 0)、凝胶成像系统、P C R仪、实时荧光P C R仪、数字P C R检测系统(微滴发生器、封膜仪、普通P C R仪和微滴荧光检测器)、核酸定量仪、可调移液器(2.5 L,1 0 L,2 0 L,2 0 0 L,1 0 0 0 L)、无R NA酶吸头(1 0 L,2 0 L,2 0 0 L,1 0 0 0 L)、无R NA酶离心管、
6、P C R反应管(2 0 0 L)、实时荧光9 6孔反应板、数字P C R微反应体系生成联排管、9 6孔荧光定量P C R反应板和封膜。6.2 试剂除另有规定外,所有试剂均为分析纯,实验用水应符合G B/T 6 6 8 2中相关规定。普通R T-P C R检测试剂应符合附录B要求;实时荧光R T-P C R检测试剂应符合附录C要求;数字R T-P C R检测试剂应符合附录D要求。7 检疫鉴定7.1 检测样品的制备苗木及接穗:有症状(节间缩短,叶片出现变色、卷叶和坏死症状)的苗木及接穗单独编号,每株采集症状嫩叶片5 g用于后续检测;无症状的植株每1 0株分为1组编号,混合采集植株嫩叶1 0 g用
7、于后续检测。植物产品(果实):有坏死症状的葡萄果粒单独采样用于后续检测,无症状的葡萄果粒每5穗分为1组编号,每穗取4果粒,总计取2 0用于后续检测。7.2 普通R T-P C R方法提取样品总R NA,设置阳性对照、阴性对照和空白对照,进行普通R T-P C R检测,具体操作步骤按照附录B执行。7.3 实时荧光R T-P C R方法提取样品总R NA,设置阳性对照、阴性对照和空白对照,进行实时荧光R T-P C R检测,具体操作步骤按照附录C执行。7.4 数字R T-P C R方法提取样品总R NA,设置阳性对照、阴性对照和空白对照,进行数字荧光R T-P C R检测,具体操作步骤按照附录D执
8、行。8 结果判定同时符合普通R T-P C R检测和实时荧光R T-P C R检测结果为阳性,判定待检测样品携带葡萄灰皮诺病毒。同时符合普通R T-P C R检测和数字荧光R T-P C R检测结果为阳性,判定待检测样品携带葡萄灰皮诺病毒。2S N/T5 3 8 62 0 2 1以正式出版文本为准当普通R T-P C R检测结果为阳性,则进行序列测定,测定序列经对比分析为葡萄灰皮诺病毒的,判定待检测样品携带葡萄灰皮诺病毒。9 样品保存与结果记录9.1 样品保存检测结果判定为阳性的样品应妥善保存于-8 0 冰箱中,并做好登记和标记,以备复核用。9.2 结果记录完整的实验记录要包括:样品的来源、种
9、类、采集时间、实验检测时间、地点、方法和结果,并有实验人员的签字;普通R T-P C R检测结果保存电泳图片,测序保留序列对比结果;实时荧光R T-P C R检测结果保存荧光曲线图及C t值;数字R T-P C R检测结果保存微滴生成图。3S N/T5 3 8 62 0 2 1以正式出版文本为准附 录 A(资料性)葡萄灰皮诺病毒相关资料A.1 寄主范围自然条件下侵染葡萄(V i t i s v i n i f e r a)。A.2 危害症状寄主受G P GV侵染后,叶片出现变色、卷叶和坏死症状,果实表面出现坏死斑点,如图A.1所示。说明:A、B、C、D 受侵染葡萄叶片症状(A n n a i
10、s a G i a m p e t r u z z i,2 0 1 2);E、F 受侵染葡萄果实症状(C h o I S,2 0 1 3)。图A.1 G P G V侵染葡萄植株和果实的症状4S N/T5 3 8 62 0 2 1以正式出版文本为准A.3 分布地区韩国、意大利、斯洛文尼亚、西班牙、法国、加拿大、中国、捷克、斯洛伐克和希腊。A.4 传播方式主要通过嫁接传播和机械传播A.5 基因组病毒粒子为非常弯曲的长线形(见图A.2),长6 4 0 n m7 6 0 n m,核酸为单分子线形正义s s R NA,长约7.5 k b,核酸约占病毒粒子重量的5%。图A.2 病毒粒体形态(G i o v
11、 a n n i P M a r t e l l i,2 0 0 7)5S N/T5 3 8 62 0 2 1以正式出版文本为准附 录 B(规范性)普通R T-P C R检测方法B.1 主要试剂B.1.1 R N A提取的主要试剂T r i z o l裂解液、三氯甲烷、异丙醇、7 5%乙醇。B.1.2 5 0T A E T r i s 2 4 2 g 冰醋酸 5 7.1 m L N a2E D T A2 H2O 3 7.2 g 加去离子水至1 L,使用时加水稀释至1T A E。B.2 实验步骤B.2.1 R N A提取取0.1 g叶片样品(果实取果皮),加液氮研磨成粉末状,将研磨物迅速移入1.
12、5 m L离心管中,加入1 m L T r i z o l 试剂,颠倒混匀,2 8,1 2 0 0 0 g,离心1 0 m i n。取上清,1 5 3 0,放置5 m i n;加入0.2 m L三氯甲烷,用手剧烈振荡(勿涡旋振荡),约1 5 s。1 5 3 0,放置2 m i n3 m i n;2 8,1 2 0 0 0 g,离心1 5 m i n。小心吸取约为6 0 0 L的上层水相。加5 0 0 L异丙醇混合上清液,1 5 3 0,放置1 0 m i n。2 8,1 2 0 0 0 g,离心1 0 m i n。去除上清液,沉淀中加入1 m L 7 5%乙醇,洗涤;2 8,1 2 0 0 0
13、 g,离心5 m i n。去除上清液,沉淀自然干燥后,将其溶于3 0 L5 0 L无R NA酶的水中。同时以携带G P GV的葡萄叶片作为阳性对照提取其总R NA,以健康的葡萄叶片作为阴性对照提取其总R NA。R NA也可使用相应市售R NA提取试剂盒提取。B.2.2 普通R T-P C RB.2.2.1 引物序列根据已报道的G P GV基因组序列(I.S.CHO,2 0 1 3),合成一对扩增G P GV外壳蛋白基因的寡核苷酸引物。正向引物G P GV-F P:5-AT G T C GAT T C G T C AG GAG C T G-3反向引物G P GV-R P:5-C T A C AT
14、 A C T AAAT G C A C T C-3R T-P C R产物大小5 8 8 b p。B.2.2.2 c D N A合成反转录总体系为2 0 L。在0.2 m L P C R管中加入提取的总R NA 2 L,d NT P s(1 0 mm o l/L)2 L,D E P C-H2O 9.5 L,引物G P GV-R P(2 0 m o l/L)1 L,5M-ML V缓冲液 4 L,反转录酶(2 0 0 U/L)1 L,R NA酶抑制剂(4 0 U/L)0.5 L。4 2 反应1 h。逆转录产物置于-2 0 保存,应尽快进行检测。也可采用R T-P C R一步法试剂盒,操作步骤按使用说
15、明进行。6S N/T5 3 8 62 0 2 1以正式出版文本为准B.2.2.3 P C R反应反应体系(2 5 L):在0.2 m L P C R管中加入1 0P C R缓冲液2.5 L,d NT P s(2.5 mm o l/L)0.5 L,引物G P GV-F P(2 0 m o l/L)和G P GV-R P(2 0 m o l/L)各0.5 L,T a q酶(5 U/L)0.5 L,模板2 L,D E P C处理过的水补足到2 5 L。每个样品设2个平行处理。反应条件为:9 4 5 m i n;9 4 2 0 s,5 6 2 0 s,7 2 3 0 s,3 5个循环;7 2 1 0
16、m i n。B.3 琼脂糖凝胶电泳检测用1T A E配制1.5%的琼脂糖凝胶(5 5 6 0 时加入溴化乙锭至终浓度为0.5 g/m L,也可在电泳后进行染色)。取5 L的P C R产物与1 L的6上样缓冲液混合均匀,加入样品孔。恒压5 V/c m电泳2 0 m i n 3 0 m i n。凝胶成像系统中观察电泳结果,拍照并记录结果。B.4 结果判定在阴性对照和空白对照没有产生预期大小条带、阳性对照产生约5 8 8 b p的预期大小条带情况下:如果检测样品出现与阳性对照大小一致的条带,则为阳性;进行序列测定,用B l a s t N工具将得到的序列在G e n a n k中进行同源性比对,若测
17、定核苷酸序列与葡萄灰皮诺病毒同源性最高达到9 0%以上,判定待检测样品携带葡萄灰皮诺病毒。如果检测样品没有出现与阳性对照大小一致的条带,则为阴性。7S N/T5 3 8 62 0 2 1以正式出版文本为准附 录 C(规范性)荧光R T-P C R检测方法C.1 试剂P r e m i x E x T a q (P r o b e q P C R),R O X p l u s。C.2 实验步骤C.2.1 R N A提取及c D N A合成操作方法按照附录B。C.2.2 实时荧光P C RC.2.2.1 引物序列根据已报道的G P GV基因组序列,设计一对扩增部分外壳蛋白基因的寡核苷酸引物和探针。
18、G P GV-F5-A C AAT T T A C C C C A C C A C AAT G G-3G P GV-R5-C AG C T AAG C T G T AT T C C T T T A C G-3G P GV-P5-F AM-T T AT GAAT C T T T T AAT C C T T C C C T G C C G G-B HQ 1-3C.2.2.2 荧光P C R反应反应体系(2 5 L):在0.2 m L P C R管中加入2P r e m i x E x T a q(P r o b e q P C R)2.5 L,引物G P GV-F(2 0 m o l/L)和G P
19、 GV-R(2 0 m o l/L)各0.5 L,探针G P GV-P(2 0 m o l/L)0.2 5 L,模板2 L,D E P C处理过的水补足到2 5 L。每个样品设2个平行处理。反应条件为:9 5 3 0 s;9 5 5 s,6 0 3 0 s,共4 0个循环。C.3 结果判定在空白对照及阴性对照无C t值且无扩增曲线、阳性对照C t值3 0并出现典型扩增曲线的条件下:待测样品的C t值4 0时,判定实时荧光R T-P C R结果为阴性;待测样品的C t值3 5时,判定实时荧光R T-P C R结果为阳性;待测样品的C t值小于4 0而大于3 5时,应重新进行测试;如果重新测试的C
20、 t值4 0,则判定实时荧光R T-P C R结果为阴性;如果重新测试的C t值小于4 0而大于3 5,且分离曲线明显时,则判定实时荧光R T-P C R结果为阳性。8S N/T5 3 8 62 0 2 1以正式出版文本为准附 录 D(规范性)数字R T-P C R检测方法 D.1 试剂按照不同的数字P C R反应平台的说明书选择适合的数字P C R反应试剂盒。D.2 实验步骤D.2.1 R N A提取操作方法按照附录B。D.2.2 数字R T-P C R检测D.2.2.1 引物序列根据已报道的G P GV基因组序列,设计一对扩增部分外壳蛋白基因的寡核苷酸引物和探针,探针5 端含有F AM报告
21、荧光染料,3 端含有不发荧光的淬灭基团并具有MG B分子。G P GV-F 15-G GA C AA C AT T GAT AG G T A C-3G P GV-R 15-C C C AA C AT C AT T T C T G T G-3G P GV-P 15-F AM-T A C C T T C G GA C AG T T C AT C C AT T G T-B HQ-3D.2.2.2 数字R T-P C R反应反应 体 系(2 0 L):采 用 一 步 法 R T-d d P C R A d v a n c e d K i t f o r P r o b e s推 荐 的2 0 L体 系
22、,4S u p e r m i x 5 L,引物G P GV-F 1(2 0 m o l/L)和G P GV-R 1(2 0 m o l/L)各0.4 L,探针G P GV-P 1(2 0 m o l/L)0.2 L,R T E n z y m e M i x(2 0 0 U/L)2 L,模板2 L,D E P C处理过的水补足到2 0 L。每个样品设2个平行处理。将上述2 0 L样品反应体系加入到微滴生成卡中,再加入7 0 L微滴生成油,混匀后转移到微滴生成仪上自动生成微滴;将产生的微滴仔细全部转移到9 6孔反应板P C R反应管中;再将9 6孔反应板在封膜仪上封膜,并置于普通P C R仪上
23、进行P C R反应。反应条件:5 0 反转录1 0 m i n;9 5 预变性1 0 m i n;9 5 变性3 0 s,6 0 退火1 m i n,4 5个循环。打开微滴荧光检测器应用软件,将完成P C R反应的9 6孔放入微滴读取仪中,设备自动检测每P C R反应管中所有微滴的P C R反应情况,最后软件按照泊松分布原理给出待测R NA序列的拷贝数。D.3 结果分析与判定D.3.1 阈值的设定根据数字P C R体系中阴性微滴簇荧光幅度的最高点为界来设定阈值线,阈值线需要对阴性和阳性扩增结果进行明显的区分。D.3.2 对照的设置阴性对照:采用不含有G P GV的葡萄R NA作为数字P C R
24、反应模板。空白对照:采用水作为数字P C R反应模板。阳性对照:采用含有G P GV的葡萄R NA作为数字P C R反应模板。9S N/T5 3 8 62 0 2 1以正式出版文本为准D.3.3 质控标准阳性对照为G P GV阳性基因有明显阳性微滴信号,扩增终点荧光信号大于或等于阈值。阴性对照为G P GV阳性基因无阳性微滴信号,扩增终点荧光信号小于阈值。空白对照为G P GV阳性基因无阳性微滴信号,扩增终点荧光信号小于阈值。与以上实验结果不符,需要重复验证实验步骤。D.3.4 结果判定如果待测样品产生阳性微滴信号,则判定数字R T-P C R检测结果为阳性。如果待测样品不产生阳性微滴信号,则
25、判定数字R T-P C R检测结果为阴性。01S N/T5 3 8 62 0 2 1以正式出版文本为准参 考 文 献1 G i a m p e t r u z z i A,R o u m i V,R o b e r t o R,e t a l.A n e w g r a p e v i n e v i r u s d i s c o v e r e d b y d e e p s e-q u e n c i n g o f v i r u s-a n d v i r o i d-d e r i v e d s m a l l R NA s i n C v P i n o t g r i sJ.
26、V i r u s R e s e a r c h,2 0 1 2,1 6 3(1):2 6 2-2 6 8.2 C h o I S,J u n g S M,C h o J D,e t a l.F i r s t r e p o r t o f G r a p e v i n e p i n o t g r i s v i r u s i n f e c t i n g g r a p e v i n e i n K o r e aJ.N e w D i s e a s e R e p o r t s,2 0 1 3,2 7,1 0.3 G l a s a M,P r e d a j n a
27、L,K o m i n e k P,e t a l.M o l e c u l a r c h a r a c t e r i z a t i o n o f d i v e r g e n t g r a p e v i n e P i-n o t g r i s v i r u s i s o l a t e s a n d t h e i r d e t e c t i o n i n S l o v a k a n d C z e c h g r a p e v i n e sJ.A r c h i v e s o f V i r o l o g y,2 0 1 4,1 5 9(8):
28、2 1 0 3-2 1 0 7.4 M a v r i c-P l e s k o I,M a r n VK,S e l j a k G,e t a l.F i r s t r e p o r t o f G r a p e v i n e p i n o t g r i s v i r u s i n f e c-t i n g g r a p e v i n e i n S l o v e n i aJ.P l a n t D i s e a s e,2 0 1 4,9 8(7):1 0 1 4.5 B e u v e M,C a n d r e s s e T,T a n n i e r
29、 e s M,e t a l.F i r s t r e p o r t o f G r a p e v i n e P i n o t g r i s(G P G v)i n g r a p e v i n e i n F r a n c eJ.P l a n t D i s e a s e,2 0 1 5,9 9(2):2 9 3.6 A l R w a h n i h M,G o l i n o D,R o w h a n i A.F i r s t r e p o r t o f G r a p e v i n e P i n o t g r i s v i r u s i n f e
30、 c t i n g g r a p e v i n e i n t h e U n i t e d S t a t e sJ.P l a n t D i s e a s e,2 0 1 6,1 0 0(5):1 0 3 0.7 X i a o H,S h a b a n i a n M,M c F a d d e n-S m i t h W,e t a l.F i r s t r e p o r t o f G r a p e v i n e P i n o t g r i s v i r u s i n c o mm e r c i a l g r a p e v i n e s i n
31、C a n a d aJ.P l a n t D i s e a s e,2 0 1 6,1 0 0(5):1 0 3 0.8 R u i z-G a r c i a A B,O l m o s A.F i r s t r e p o r t o f G r a p e v i n e P i n o t g r i s v i r u s i n g r a p e v i n e i n S p a i nJ.P l a n t D i s e a s e,2 0 1 7,1 0 1(6):1 0 7 0.9 F a n X D,D o n g Y F,Z h a n g Z P,e t
32、a l.F i r s t R e p o r t o f G r a p e v i n e P i n o t g r i s v i r u s i n g r a p e v i n e s i n C h i n a.P l a n t D i s e a s e,2 0 1 5,1 0 0(2):5 4 0.R u i z-G a r c i a A B,O l m o s A.F i r s t r e p o r t o f G r a p e v i n e P i n o t g r i s v i r u s i n g r a p e v i n e i n S p a
33、 i nJ.P l a n t D i s e a s e,2 0 1 7,1 0 1(6):1 0 7 0.1 0 G i o v a n n i P M a r t e l l i,M i c h a e l J A d a m s,J a n F K r e u z e,e t a l.F a m i l y F l e x i v i r i d a e:a c a s e s t u d-y i n v i r i o n a n d g e n o m e p l a s t i c i t yJ.P h y t o p a t h o l o g y,2 0 0 7,4 5:7
34、3-1 0 0.11S N/T5 3 8 62 0 2 1以正式出版文本为准12026835 T/NS中华人民共和国出入境检验检疫行 业 标 准葡萄灰皮诺病毒检疫鉴定方法S N/T 5 3 8 62 0 2 1*中国海关出版社有限公司出版发行北京市朝阳区东四环南路甲1号(1 0 0 0 2 3)编辑部:(0 1 0)6 5 1 9 4 2 4 2-7 5 3 1网址 w ww.c u s t o m s k b.c o m/b o o k中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷*开本8 8 01 2 3 0 1/1 6 印张1 字数2 8千字2 0 2 1年7月第一版 2 0 2 1年7月第一次印刷印数 15 0 0*书号:1 5 5 1 7 56 7 8 定价1 6.0 0元