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1、以正式出版文本为准I C S6 5.0 2 0.0 1C C S B1 6中华人民共和国出入境检验检疫行业标准S N/T5 3 7 82 0 2 1 线型湿螺检疫鉴定方法D e t e c t i o n a n d i d e n t i f i c a t i o n o f H y g r o m i a c i n c t e l l a(D r a p a r n a u d,1 8 0 1)2 0 2 1-0 6-1 8发布2 0 2 2-0 1-0 1实施中华人民共和国海关总署发 布以正式出版文本为准以正式出版文本为准前 言 本文件按照G B/T 1.12 0 2 0 标准化工作
2、导则 第1部分:标准化文件的结构和起草规则 的规定起草。本文件由中华人民共和国海关总署提出并归口。本文件起草单位:中华人民共和国福州海关、福建省农业科学研究院生物资源研究所、中华人民共和国杭州海关。本文件主要起草人:胡美玲、周卫川、王沛、吴宇芬、吴志毅、陈晟、肖琼。S N/T5 3 7 82 0 2 1以正式出版文本为准以正式出版文本为准线型湿螺检疫鉴定方法1 范围本文件规定了线型湿螺Hy g r o m i a c i n c t e l l a(D r a p a r n a u d,1 8 0 1)的检疫鉴定方法。本文件适用于线型湿螺的检疫鉴定。2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文
3、中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中,注日期的引用文件,仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。S N/T 3 0 6 72 0 1 1 软体动物常规检疫规范。3 术语与定义 S N/T 3 0 6 7界定的以及下列术语和定义适用于本文件。3.1矢囊 d a r t s a c k蜗牛生殖系统中一个藏有1枚中空的钙质或壳质骨针的肌肉质的囊。3.2外套膜 m a n t l e 为陆生软体动物躯体背部皮质层皱褶延伸而成,是一层覆盖内脏囊的膜状物,肺血管网密布其上,可行呼吸作用,且与分泌碳酸钙形成贝壳。3.3环唇肋 i n t e
4、r n a l l i p r i b 蜗牛壳口外唇内侧增厚,与外唇同向形成一条环状的肋,即为环唇肋。3.4龙骨 k e e l 蜗牛贝壳体螺层外侧周缘尖锐的肋状突起,有时也称棱角。3.5轴唇 c o l u m e l l a l i p 贝壳壳口的边缘为口唇,按其在壳口中的位置不同可分为内唇、外唇、轴唇、上唇和下唇,靠近螺轴的口唇即称轴唇。注:有些种类的轴唇常外折导致脐孔部分或完全被覆盖。3.6脐孔 u m b i l i c u s 螺轴旋转时在基部遗留下来的小窝。3.7C O I基因 c y t o c h r o m e o x i d a s e s u b u n i t I g
5、 e n e1S N/T5 3 7 82 0 2 1以正式出版文本为准 线粒体D NA上的一段蛋白质编码基因,常被用于系统发育和D NA条形码研究,为软体动物D NA条形码的标靶基因,广泛应用于软体动物的分子鉴定。4 基本信息 学名:Hy g r o m i a c i n c t e l l a(D r a p a r n a u d,1 8 0 1)。异名:H e l i x c i n c t e l l a D r a p a r n a u d,1 8 0 1。英文名:G i r d l e d S n a i。中文名:线型湿螺。分类地位:软体动物门M o l l u s c a,腹
6、足纲G a s t r o p o d a,肺螺亚纲P u l m o n a t a,柄眼目S t y l o mm a-t o p g o r a,湿螺科H y g r o m i i d a e,湿螺属(Hy g r o m i a,R i s s o,1 8 2 6)。该属记述3种,其他两种分别是树篱湿螺H.l i m b a t a(D r a p a r n a u d,1 8 0 5)和塔氏湿螺H.t a s s y i(B o u r g u i g n a t,1 8 8 4)。线型湿螺的其他信息参见附录A。5 原理 线型湿螺主要随来自疫区的运输工具和货物远距离传播。该蜗牛为
7、杂食性的有害生物,不需要特定的寄主,凡接触过地面的物品都有可能携带该蜗牛,大宗进境麦类、豆类等原粮是其重要的传播媒介。传播方式、途径和生态习性是确定现场检疫的依据。贝壳、螺体、生殖系统形态特征和C O I基因序列是实验室鉴定的主要依据。6 器具和试剂6.1 仪器和用具 仪器:体视显微镜、微型离心机、恒温金属浴、P C R仪、凝胶成像系统。用具:放大镜、手电筒、塑料自封袋、广口标本瓶、4 mm孔径土壤筛、小铁铲、游标卡尺、搪瓷盘、培养皿、镊子、剪刀、小剪刀、显微镊子、显微剪刀、微针(直径0.1 5 mm)、解剖蜡盘、标签、1.5 m L离心管、0.2 m L P C R反应管、移液枪。6.2 试
8、剂 除另有规定外,所有试剂均为分析纯。7 5%乙醇、无水乙醇、硫酸镁、动物基因组D NA提取试剂盒、P C R M a s t e r M i x、d d H2O。7 现场检疫 对来自疫区(参见附录A)的粮船、集装箱、木质包装材料应重点检查,仔细观察船舱四壁、集装箱的底部和四角部位以及所装货物与木质包装材料是否有蜗牛。对来自疫区的原粮、原木、盆景、苗木、水果、蔬菜等未经加工的植物性原材料也应认真检查,尤其需注意潮湿或有枝叶的区域。对可能被蜗牛污染的物品可用高压水枪冲洗后再检查或做预防性的熏蒸灭蜗处理。蜗牛爬行过后,一般都会留下银灰色的丝带状黏液痕迹,这是判定是否有蜗牛污染的重要依据。若发现蜗牛
9、标本,及时装入塑料自封袋或标本瓶带回实验室做进一步的检疫鉴定。发现盆景等携带土壤或其他细碎衬垫材料时,需过筛检查是否有卵或幼螺。2S N/T5 3 7 82 0 2 1以正式出版文本为准8 实验室鉴定8.1 饲养 单独查获的卵粒,按照 S N/T 3 0 6 72 0 1 1中 8.4方法,将其孵化和饲养为成螺后,再做鉴定。8.2 测量观察和软体解剖 用游标卡尺测量蜗牛贝壳的壳高和壳宽、卵粒直径或长和宽。用肉眼或放大镜或体视显微镜仔细观察卵和螺的形态特征。将闷杀处理后的标本,按照S N/T 3 0 6 72 0 1 1中8.3.1进行软体解剖,分离出生殖系统。8.3 湿螺属H y g r o
10、m i a的鉴定特征 贝壳扁圆锥形,薄而坚实。体螺层多具有不明显的周缘角,在前端略下降。螺旋部圆锥形或圆顶形。壳面浅角色至栗色,具有若干淡的色带。胚螺层平滑。壳口卵圆形,倾斜,边缘薄,锋利,轻微的外折或无外折,有时具有白色的内环唇肋。脐孔小,圆形,半封闭。8.4 线型湿螺H y g r o m i a c i n c t e l l a(D r a p a r n a u d)鉴定特征8.4.1 卵 圆球形,白色,直径1.5 mm2.0 mm。8.4.2 贝壳8.4.2.1 成螺 贝壳中等大小,右旋,呈扁圆锥形。壳质薄,易碎,有5个6 个螺层,各螺层缓慢均匀增长,螺旋部稍高,下侧扁平,缝合线浅
11、,体螺层周缘形成一尖锐的龙骨或棱角。贝壳半透明,活体可以透过贝壳看到外套膜形状。脐孔狭小,基本上被轴唇外折覆盖。壳口简单、宽大、椭圆形。口唇基本上不向外扩展,内侧也不增厚形成环唇肋。壳面为淡黄色至红褐色,颜色变异较大,具有细的轴向生长线和排列间距不规则的微弱螺纹。沿体螺层周缘上有一条鲜明的奶白色螺旋状色带,是该种的典型特征。壳高6 mm7 mm,壳宽1 0 mm1 2 mm。(参见图B.1)8.4.2.2 幼螺 幼螺外形与成螺基本相似,贝壳透明,脐孔稍大,最初开放,随生长脐孔逐渐被轴唇外折所遮盖,至成螺时呈缝隙状。8.4.3 螺体 腹足淡黄色或浅灰色,头部黄色。前触角颜色比后触角深。由于壳质较
12、薄,透过贝壳可以看到深浅不一的黑色斑块,为外套膜覆盖于蜗牛体背的形状。(参见图B.2)8.4.4 生殖系统 阴茎长度适中,膨大,阴茎本体细长,比阴茎稍长。鞭状体短,输卵管短,输精管细长。矢囊和副矢囊大小相近,恋矢弯曲。黏液腺两对4枝,每枝又分叉成两分枝。受精囊柄长,不分枝,受精囊大,椭圆形。边缘稍长,圆锥形,顶端具有开口孔和一中央沟槽。有时在阴茎内壁上有一圈小的裂陷或空隙。(参见图B.3)3S N/T5 3 7 82 0 2 1以正式出版文本为准8.4.5 C O I基因序列鉴定 按附录C方法提取D NA、P C R扩增和双向测序,将所测序列与G e n b a n k登录号为K X 6 2
13、2 0 2 5.1已知线型湿螺C O I 基因的标准序列进行比对,一致性9 5%的待鉴样品确认为线型湿螺的疑似样品。(应符合附录C的规定)9 结果判定 以贝壳形态和生殖系统解剖形态特征为基本鉴定依据,螺体的特征作为参考,C O I基因序列鉴定为辅助鉴定方法,并注意与近似种鉴别(参见附录 D)。对于贝壳特征典型的个体符合8.4.2判定为线型湿螺,对于贝壳特征有变异的个体,同时符合8.4.2、8.4.3和8.4.4判定为线型湿螺。单独查获的卵粒符合8.4.1,需通过孵化和饲养实验(见S N/T 3 0 6 72 0 1 1中8.4饲养鉴定)做进一步的鉴定。符合8.4.5确定为线型湿螺的疑似样品,需
14、参考形态特征进行结果判定。1 0 标本处理和保存1 0.1 标本处理 标本处理方法见S N/T 3 0 6 72 0 1 1即可。1 0.2 保存时间 经过鉴定线型湿螺的标本应永久保存,并注明时间、产地、寄主、采集人等信息。4S N/T5 3 7 82 0 2 1以正式出版文本为准附 录 A(资料性)线型湿螺的寄主、地理分布及其他信息A.1 寄主 幼螺以腐植质和植物的幼苗和嫩芽为食,成螺取食各种绿色植物的茎、叶和果实,喜食蔬菜等多汁的作物。A.2 地理分布 线型湿螺起源于地中海盆地及沿岸地区,具体包括:法国、瑞士、克罗地亚、意大利(包括西西里岛)、斯洛文尼亚等国家和地区,入侵的国家和地区有:英
15、国、奥地利、捷克、匈牙利、比利时、德国、荷兰、美国、爱尔兰岛、科西嘉岛、巴尔干半岛。目前欧洲的大部地区都有分布。A.3 生物学与危害性 线型湿螺是美国农业部关注的重要有害生物,不但直接危害各种果蔬、花卉等农作物,是农业生产上的重要有害生物。该螺种群密度高时,以大量聚集的方式生栖繁衍和危害作物,能在短时间内对农作物造成较大损失。例如,在美国入侵新区的线型湿螺能在较短时间内建立起较高密度的种群水平。线型湿螺常生活在开放、具有低灌木和草本植物的栖息地,尤其是小水流或河谷附近地区。在意大利常发现栖息于凉爽和潮湿的栖息地,如河岸和山谷。在瑞士几乎完全生栖于栽培作物的田园、灌木丛和草本花园,而在天然森林则
16、很少发现。在德国该种也主要分布于人口稠密的地区。5S N/T5 3 7 82 0 2 1以正式出版文本为准附 录 B(资料性)线型湿螺形态特征 线型湿螺形态特征见图B.1图B.3。说明:上 侧面观;左下 背面观;右下 腹面观。图B.1 成螺贝壳形态特征6S N/T5 3 7 82 0 2 1以正式出版文本为准 注:引自h t t p:/ww w.w i l d e w i j d e w e r e l d.n l/w p-c o n t e n t/u p l o a d s/2 0 1 3/0 8/H y g r o m i a-c i n c t e l l a_I MG_7 1 5 2
17、_1 3 0 8 2 4_8 0 0 x 6 0 0-e 1 3 7 7 9 0 1 2 3 3 1 2 3.j p g。图B.2 螺体爬行形态特征7S N/T5 3 7 82 0 2 1以正式出版文本为准 标引序号说明:P 阴茎;E 阴茎本体;F 鞭状体;V D 输精管;MG 黏液腺;P B C 受精囊柄;B C 受精囊;V 边缘;S 矢囊;A S 副矢囊;P R 阴茎牵引肌;V P 阴道乳突。图B.3 生殖系统形态特征(仿S h i l e y k o,2 0 0 5)8S N/T5 3 7 82 0 2 1以正式出版文本为准附 录 C(规范性)线型湿螺C O I基因辅助鉴定方法C.1 D
18、 N A提取 取腹足肌肉1 0 m g 3 0 m g,用动物基因组D NA试剂盒按照商品化试剂盒说明书提取D NA。C.2 C O I基因引物 L C O 1 4 9 0:5-G G T C AA C AAAT C AT AAAGAT AT T G-3 HC O 2 1 9 8:5-T AAA C T T C AG G G T GA C C AAAAAAT C A-3C.3 反应体系 反应体系为 2 0 L:其中D NA模板 2 L,L C O 1 4 9 0(1 0 m o l/L)0.5 L,HC O 2 1 9 8(1 0 m o l/L)0.5 L,2M a s t e r M i
19、x 1 0 L,d d H2O 7 L。C.4 P C R扩增条件 9 4 5 m i n;9 4 5 0 s,4 5 3 0 s,7 2 5 0 s,3 0个3 5个循环;7 2 1 0 m i n,4。C.5 测序 将P C R扩增样品送有资质的生物技术公司测序。C.6 比对鉴定 双向测序获得长度约为6 2 0 b p的D NA序列,经软件拼接和人工校对后,与G e n b a n k登录号K X 6 2 2 0 2 5.1已知线型湿螺C O I基因的标准序列进行比对,一致性9 5%的待鉴样品为线型湿螺的疑似样品,需参考形态特征进行结果判定。9S N/T5 3 7 82 0 2 1以正式出
20、版文本为准附 录 D(资料性)线型湿螺与近似种的鉴别 鉴别特征比较见表D.1。表D.1 线型湿螺与近似种鉴别特征比较鉴别特征H.l i m b a t a(D r a p a r n a u d,1 8 0 5)树篱湿螺H.c i n c t e l l a(D r a p a r n a u d,1 8 0 1)线型湿螺H.t a s s y i(B o u r g u i g n a t,1 8 8 4)塔氏湿螺螺层数565655.5贝壳螺旋部圆锥形螺旋部凸透镜形螺旋部圆锥形体螺层周缘较为圆钝的角周缘有尖锐的龙骨周缘较为圆钝或为钝的角壳口有一明显的内环唇肋无内环唇肋无内环唇肋脐孔脐孔小,圆
21、形,部分被轴唇覆盖脐孔小,缝隙状,几乎被轴唇完全覆盖脐孔小,缝隙状,几乎被轴唇完全覆盖分布欧洲西部欧洲大部分地区及美国局限于庇里牛斯山,濒危物种壳高壳宽(8 mm1 4 mm)(1 2 mm1 7 mm)(6 mm7 mm)(1 0 mm1 2 mm)(5 mm8 mm)(8 mm1 2 mm)典型贝壳照片对比 注:H.t a s s y i(B o u r g u i g n a t,1 8 8 4)塔氏湿螺贝壳图片引自h t t p s:/w w w.m a l a c o w i k i.o r g/f i l e s/h y g r o m i a t a s s y i.j p g。
22、01S N/T5 3 7 82 0 2 1以正式出版文本为准以正式出版文本为准12028735T/NS中华人民共和国出入境检验检疫行 业 标 准线型湿螺检疫鉴定方法S N/T 5 3 7 82 0 2 1*中国海关出版社有限公司出版发行北京市朝阳区东四环南路甲1号(1 0 0 0 2 3)编辑部:(0 1 0)6 5 1 9 4 2 4 2-7 5 3 1网址 w ww.c u s t o m s k b.c o m/b o o k中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷*开本8 8 01 2 3 0 1/1 6 印张1 字数2 4千字2 0 2 1年7月第一版 2 0 2 1年7月第一次印刷印数 15 0 0*书号:1 5 5 1 7 56 8 1 定价1 6.0 0元