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1、书 书 书中华人民共和国出入境检验检疫行业标准犛犖犜 淋巴细胞性脉络丛脑膜炎检疫技术规范犙狌 犪 狉 犪 狀 狋 犻 狀 犲狆 狉 狅 狋 狅 犮 狅 犾犳 狅 狉犾 狔犿狆 犺 狅 犮 狔 狋 犻 犮犮 犺 狅 狉 犻 狅犿犲 狀 犻 狀 犵 犻 狋 犻 狊 发布 实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局发 布书 书 书前言本标准按照 给出的规则起草。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国上海出入境检验检疫局、中华人民共和国江西出入境检验检疫局、中华人民共和国广东出入境检验检疫局。本标准主要起草人：张强、王艳、杨春华、熊炜、林颖峥、李树清、王巧全、朱事
2、康、李健。犛犖犜 淋巴细胞性脉络丛脑膜炎检疫技术规范范围本标准规定了淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒荧光 和血清抗体酶联免疫吸附试验的技术规范。本标准适用于大鼠、小鼠、豚鼠和地鼠淋巴细胞性脉络丛脑膜炎的诊断及流行病学调查。规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。实验室生物安全通用要求缩略语下列缩略语适用于本文件。：血清白蛋白（）：酶联免疫吸附试验（）：辣根过氧化物酶（）：淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒（）初步诊断参照附录疫病概述中的临床症状和流行病学资料可作出初步诊断，进一步
3、应采集样品进行实验室检测。涉及到病原的检测应在二级生物安全实验室进行，样品保存和废弃物处理应按照 要求进行。实验室诊断 荧光定量犚犜 犘犆犚试验 试剂 。三氯甲烷。异丙醇：预冷。水。乙醇。酶抑制剂（）。犛犖犜 聚合酶（）及相应 缓冲液。反转录酶（）及相应反转录反应缓冲液。（）。（）设备 二级生物安全柜。高压灭菌锅。微量移液器。高速冷冻离心机。荧光仪。引物和探针引物和探针针对基因组片段序列设计，由生物公司合成，纯度为级，用溶解至 后，保存于 备用。引物、探针的名称、序列及位置见附录的表。质控物质 阳性对照将基因片段克隆入质粒载体，提取质粒，并将其线性化，线性化时保证片段完整，经体外转录后制备成溶
4、液，用做阳性对照。阴性对照阴性小鼠组织，经匀浆后，犵离心，取上清用做阴性对照。样品的采集制备处死受检动物，采集脑、脏器组织作为检测样本。采样过程中样品不得交叉污染，采样及样品前处理过程中须戴一次性手套。用无菌剪刀和镊子剪取待检样品于研磨器中充分研磨，再加入倍体积的混匀，然后将组织悬液转入无菌 管中，编号备用。存放与运送采集或处理的样品在条件下保存不超过；若需长期保存，应放置 冰箱，但应避免反复冻融（最多冻融次）。样品核酸的提取 取狀个 灭菌 管，其中狀为待检样品数、一管阳性对照及一管阴性对照之和，对每个管进行编号标记。每管加入 裂解液，然后分别加入待测样品、阴性对照和阳性对照各 ，一份样品换用
5、一个吸头；再加入 三氯甲烷，混匀器上震荡混匀。于条件下，犵离心 。取与 中相同数量的 灭菌 管，加入 异丙醇（预冷），对每个管进行编号。吸取 离心后各管中的上清液转移至相应的管中，上清液至少吸取 ，注意不要吸出中间层，颠倒混匀。犛犖犜 于条件下，犵离心 。轻轻倒去上清液，倒置于吸水纸上，吸干液体，不同样品应在吸水纸不同地方吸干。加入 乙醇，颠倒洗涤。于条件下，犵离心 。轻轻倒去上清液，倒置于吸水纸上，吸干液体，不同样品应在吸水纸不同地方吸干。犵离心，将管壁上的残余液体甩到管底部，用微量加样器尽量将其吸干，一份样品换用一个吸头，吸头不要碰到有沉淀一面，室温干燥。不宜过于干燥，以免不溶。加入 水，
6、轻轻混匀，溶解管壁上的，犵离心，冰上保存备用。提取的须在内进行 扩增或放置于 冰箱，将核酸转移至反应混合物配制区。也可采用其他等效的商业化试剂盒提取核酸。扩增试剂准备与配制本步骤在反应混合物配制区进行。每个测试反应体系需使用 荧光 反应液，反应液配方见表。根据 中所设定的狀值，计算各试剂的使用量，加入适当体积试管中，充分混合均匀后，向每个管中各分装，转移至样品处理区。加样在样品处理区进行。在 的管中分别加入制备好的溶液，使总体积达。盖紧管盖后，犵离心。荧光犚犜 犘犆犚反应在检测区进行。将 中加样后的管放入荧光检测仪内，记录样品摆放顺序，选定检测通道读取检测结果，选择作为淬灭基团。设置如下反应参
7、数：第一阶段，反转录 ；第二阶段，预变性 ；第三阶段，个循环，荧光收集设置在第三阶段每次循环的退火延伸时进行。结果判定 质控标准阴性对照无 值并且无特定扩增曲线。阳性对照的 应，并出现特定的扩增曲线。如阴性对照和阳性对照不满足以上条件，此次实验视为无效。结果描述及判定阴性：无 值并且无扩增曲线，表明样品中无核酸。阳性：，且出现特定的扩增曲线，表示样品中存在核酸。可疑：，判为可疑；可疑样品须重做，重做结果无 值者为阴性，否则为阳性。酶联免疫吸附试验（犈犔 犐 犛犃）试剂 抗原：在生物安全实验室，用感染 细胞，当病变达 时，收获培养物。犛犖犜 反复冻融三次或超声波处理后，犵离心 去除细胞碎片，上清
8、液经超速离心浓缩后制成 抗原；或用基因工程表达纯化抗原作为 抗原。也可购买商品化抗原。对照抗原：未染病毒 细胞冻融破碎后，犵离心 去除细胞碎片，上清液可作为对照抗原；或用基因工程抗原用空白载体表达物破碎获得。阳性对照血清：用丙内脂灭活抗原，免疫清洁级或级大鼠、小鼠、豚鼠、地鼠所获得的抗血清。阴性对照血清：清洁级或级大鼠、小鼠、豚鼠、地鼠血清。酶标记物：标记羊或兔抗小鼠、豚鼠、地鼠 抗体，用于检测相应动物血清抗体；标记葡萄球菌蛋白（）可用于检测小鼠、豚鼠、地鼠血清抗体。缓冲液（见）。抗原稀释液（见）。洗涤液（见）。吐温。封闭液（见）。显色剂（见）。终止液（见）。酶稀释液（同洗涤液）。设备 微量移
9、液器。酶标仪。洗板机。高速冷冻离心机。样品采集制备无菌操作采集动物血，自然凝固后无菌分离血清，分装，加盖密封后冷藏保存。样品周内检测可存放于，超过周应置于。操作步骤 用抗原稀释液稀释抗原，将稀释好的抗原加入酶标板奇数列孔内，每孔加 ，包被过夜；偶数列用细胞对照抗原按同样方法处理。用 洗涤液冲洗微量板次。每孔加封闭液 ，反应。洗板次。待检血清用稀释液作 稀释，把稀释好的血清加入已包被阳性和阴性抗原孔各一孔，每孔 ；同时设立阳性血清、阴性血清对照（见附录）。置 孵育。洗板次。把稀释好的标记抗体加入各孔，每孔加 ，置室温反应。洗板次。每孔加入显色剂底物溶液 ，室温避光反应 。每孔加 终止液终止反应，
10、内以 波长测值。犛犖犜 也可采用其他等效的商业化试剂盒。结果判定每份检测血清的病毒抗原孔值与阴性抗原对照孔值之差即为样品值。阴性对照血清的 ，阳性对照血清的 ，本试验成立。待检血清平均值高于阴性血清对照平均值倍以上者，判为阳性；否则判为阴性。犛犖犜 附录犃（资料性附录）疫 病 概 述犃 淋巴细胞性脉络丛脑膜炎（）是由淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒（）引起的人和多种动物共患的病毒性疾病。小鼠感染表现为大脑型、内脏型和迟发型三种病型；人类感染主要表现流感样症状和脑膜炎。犃 小鼠、大鼠、豚鼠、地鼠、犬、猴、鸡、马、兔均易感。在自然状态下可感染啮齿类动物，其储存宿主是小家鼠（犕狌 狊犿狌 狊 犮 狌 犾
11、狌 狊）、家鼠（犕狌 狊犱 狅犿犲 狊 狋 犻 犮 狌 狊）和仓鼠（犛狔 狉 犻 犪 狀犺 犪犿狊 狋 犲 狉）等啮齿类动物，由于此类啮齿动物遍布全球，广泛分布在人类的活动区域，并且接触患病动物的排泄物和分泌物是主要的感染途径，人被感染的几率也较大。但只有持续感染的小鼠和急性感染的金黄地鼠才能传播病毒。在带毒小鼠的所有器官（包括肾脏和唾液腺）中，终身还有高滴度的病毒，带毒小鼠可经唾液、鼻分泌物和尿液向外排毒。含病毒的鼻分泌物可能引起呼吸道传播，随后，病毒在鼠群内散播，许多小鼠成为无症状的带毒者，并通过子宫和乳汁传给后代，其后代可成为终身带毒者。犃 在家鼠间存在的主要方式是通过子宫垂直传播。除带
12、毒小鼠以外，能使在物种间传播或散发到其他物种的动物只有金黄地鼠。节肢动物（蚊、蜱、臭虫、虱等）可在实验条件下传播本病。犃 小鼠感染依年龄、感染途径及其他因素的不同，表现为三种病型：）大脑型成年小鼠脑内接种可产生一种具有显著特征的疾病，病毒株、接种剂量或小鼠品系对其影响甚微。接种后天天，有的小鼠突然死亡；多数小鼠表现呆滞、嗜睡、不愿走动、被毛粗乱、眼睛半闭、弓背、消瘦，并常见结膜炎和面部水肿。特征性的表现是抓着尾巴倒提时，小鼠头部震颤，肢体阵挛性惊厥，最终表现后肢强制性伸展。小鼠多在症状出现后天天内死亡。）内脏型成年小鼠经神经外途径感染所呈现的临床反应很不同，这主要受到接种途径、剂量，病毒株的毒
13、力以及小鼠品系等因素影响。经腹腔接种 毒株，天天感染小鼠被毛粗乱，结膜炎等症状，部分小鼠出现腹水。）迟发型此型见于出生后即刻感染的带毒小鼠和先天性带毒小鼠。出生后，即在各组织器官中增殖，但无症状表现，日龄 日龄时，病鼠表现被毛粗乱、弓背、体重减轻、蛋白尿、腹水、行为异常、生长缓慢、产仔减少、寿命缩短等症状。犛犖犜 附录犅（规范性附录）荧光犚犜 犘犆犚试验犅 水。去离子水中加入终浓度为 的，搅拌处理，高压蒸汽灭菌 ，冷却后密闭冷藏备用。犅 引物、探针的名称、序列及基因组位置见表。表犅 引物、探针的名称、序列及基因组位置引物、探针名称序列位置上游引物 下游引物 探针 （）（）注：或或，：或，：或，
14、：或或或，：或，：或，：或或。犅 荧光 反应液配方见表。表犅 犔犆犕犞荧光犚犜 犘犆犚反应液配方荧光 反应液组分体积（）反应 （浓度 ）（）上游引物（）下游引物（）探针（）反转录酶（）酶抑制剂（）聚合酶（）水 总体积 犛犖犜 附录犆（规范性附录）犈犔 犐 犛犃试验溶液的配制犆 犿狅 犾犔狆犎 犘犅犛（磷酸盐缓冲液）氯化钠（）氯化钾（）磷酸氢二钠（）磷酸二氢钾（）加蒸馏水至 将上述成分依次溶解，分装，高压灭菌 。室温保存，有效期个月。犆 抗原稀释液（犿狅 犾犔碳酸盐缓冲液，狆犎）碳酸氢钠 ，碳酸钠 ，双蒸水加至 ，保存备用，一周内用完。犆 洗涤液（犿狅 犾犔犘犅犛 吐温，狆犎）吐温 ，加 至 ，现用现配。犆 封闭液牛血清白蛋白（）稀释液 置于冰箱备用。犆 底物溶液液：称取 柠檬酸（）加蒸馏水溶解并定容至 ，配制成 柠檬酸。液：称取 磷酸氢二钠（）加蒸馏水溶解并定容至 ，配制成 磷酸氢二钠。取液 ，液 ，混合后加入 邻苯二胺（），充分溶解，临用前加 ，即配成酶底物液。犆 终止液（犿狅 犾犔犎犛犗）取分析纯浓硫酸（含量 ）缓缓加入到 蒸馏水中，混匀即成 终止液。犛犖犜 附录犇（规范性附录）犈犔 犐 犛犃试验样品添加图 试验样品添加图见图。注：为阳性对照样品的英文缩写；为阴性对照样品的缩写；为待检样品的英文缩写。图犇 犈犔 犐 犛犃试验样品添加图犛犖犜