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1、以正式出版文本为准I C S6 5.0 2 0.0 1C C SB1 6中华人民共和国出入境检验检疫行业标准S N/T5 3 8 92 0 2 1香蕉黄条叶斑病菌检疫鉴定方法D e t e c t i o na n d i d e n t i f i c a t i o no fM y c o s p h a e r e l l am u s i c o l aR.L e a c he xJ.L.M u l d e r2 0 2 1-0 6-1 8发布2 0 2 2-0 1-0 1实施中华人民共和国海关总署发 布以正式出版文本为准中华人民共和国出入境检验检疫行 业 标 准香蕉黄条叶斑病菌检疫鉴
2、定方法S N/T5 3 8 92 0 2 1*中国海关出版社有限公司出版发行北京市朝阳区东四环南路甲1号(1 0 0 0 2 3)编辑部:(0 1 0)6 5 1 9 4 2 4 2-7 5 3 1网址w w w.c u s t o m s k b.c o m/b o o k中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷*开本8 8 01 2 3 0 1/1 6 印张0.7 5 字数2 1千字2 0 2 1年7月第一版 2 0 2 1年7月第一次印刷印数15 0 0*书号:1 5 5 1 7 56 8 2 定价1 2.0 0元以正式出版文本为准前 言 本文件按照G B/T1.12 0 2 0 标准化工作导则
3、第1部分:标准化文件的结构和起草规则 的规定起草。本文件由中华人民共和国海关总署提出并归口。本文件起草单位:中华人民共和国乌鲁木齐海关、中国科学院微生物研究所、广西科学院。本文件主要起草人:张祥林、蔡磊、王翀、赵鹏、刘芳、刁永朝、李典鹏、史向向。S N/T5 3 8 92 0 2 1以正式出版文本为准以正式出版文本为准香蕉黄条叶斑病菌检疫鉴定方法1 范围本文件规定了香蕉黄条叶斑病菌M y c o s p h a e r e l l am u s i c o l aR.L e a c he xJ.L.M u l d e r的检疫鉴定方法。本文件适用于香蕉属的植物及相关寄主植物的种苗、其他繁殖材料
4、及其产品(尤其是果实)中香蕉黄条叶斑病菌的检疫鉴定。2 规范性引用文件本文件没有规范性引用文件。3 术语和定义本文件没有需要界定的术语和定义。4 香蕉黄条叶斑病菌基本信息中文名:香蕉黄条叶斑病菌、香蕉假尾孢菌学名:M y c o s p h a e r e l l am u s i c o l aR.L e a c he xJ.L.M u l d e r,M y c o l.P a p.1 4 0:1 4 8.1 9 7 6.无性阶段:P s e u d o c e r c o s p o r am u s a e(Z i mm.)D e i g h t o n分类地位:香蕉黄条叶斑病菌隶属于
5、真菌界(F u n g i),子囊菌门(A s c o m y c o t a),座囊菌纲(D o t h i d e o-m y c e t e s),煤炱目(C a p n o d i a l e s),球腔菌科(M y c o s p h a e r e l l a c e a e),小球壳属(M y c o s p h a e r e l l a)。5 鉴定原理和流程5.1 鉴定原理根据香蕉黄条叶斑病菌的危害症状(参见附录A),分离培养形态特征进行初步判断,设计特异性P C R引物和探针,建立基于实时荧光P C R方法,对香蕉黄条叶斑病菌进行鉴定。5.2 鉴定流程鉴定流程见图1。1S
6、N/T5 3 8 92 0 2 1以正式出版文本为准图1 鉴定流程6 仪器和试剂6.1 仪器显微镜、解剖镜、天平、研钵、烘箱、高压灭菌锅、水浴锅、摇床、制冰机、纯水仪、旋涡振荡器、台式离心机、核酸蛋白分析仪、高速冷冻离心机、真空抽干仪、冰箱、超净工作台、生化培养箱、通风橱、实时荧光P C R仪、微量移液器(0.1L 2.5L,1L 1 0L,1 0L 5 0L,2 0L 2 0 0L,1 0 0L 10 0 0L)。6.2 试剂除另有规定外,所有试剂均为分析纯或生化试剂。应至少购置如下试剂或者相应的真菌D NA提取试剂盒:分离培养所需要的试剂为1%次氯酸钠(N a C l O)、7 5%酒精、
7、无菌水、马铃薯葡萄糖琼脂培养基(马铃薯葡萄糖琼脂粉3 7g,蒸馏水10 0 0m L,1 2 1湿热灭菌2 0m i n备用)、硫酸链霉素、氨苄青霉素钠、磷酸二氢钾(KH2P O4)、硝酸钾(KNO3)、七水硫酸镁(M g S O47 H2O)、氯化钾(K C l)、葡萄糖、蔗糖、琼脂。D NA提取试剂或真菌D NA提取试剂盒:C T A B提取液(2%C T A B,1.4m o l/LN a C l,2 0mm o l/LE D T A,1 0 0mm o l/LT r i sHC l p H8.0)、三氯甲烷、异戊醇、异丙醇、无水乙醇、R N a s e。荧光P C R反应所需试剂:P
8、C R混合液(含缓冲液,氯化镁,d NT P s,T a q酶)、特异性引物探针、超纯水。7 检疫鉴定方法7.1 病原菌的分离培养症状检查:观察叶片是否出现微变色,形成细小、黄绿色病纹或暗褐色条纹病斑或有外围黄色晕环;是否有椭圆形褐色或锈红色,外缘有黑色或深褐色细线黄色晕圈的病斑;是否有灰色霉状物。挑取发病材料病斑用流水充分冲洗后,用1%次氯酸钠和7 5%酒精分别浸泡1m i n进行表面灭菌,然后用无菌水冲洗3次,用灭菌镊、剪在无菌水中将分离材料剪成2c m3c m大小的方块,置于灭菌滤纸上,吸干水分后放置于倒有P D A的培养皿中。培养皿放置在2 5条件下光照培养箱中培养(光照和黑暗1 2h
9、交替),第3天开始观察,发现疑似菌落后纯化培养,显微观察形态特征。2S N/T5 3 8 92 0 2 1以正式出版文本为准7.2 实时荧光P C R检测按照附录B进行检测。7.3 致病性测定致病性测定为选做。将形态特征与香蕉黄条叶斑病菌相符且实时荧光P C R检测阳性的分离物进行致病性测定。选用健康的香蕉植株进行致病性测定,对香蕉叶片进行表面消毒,无菌水冲洗,进行针刺接种。用灭菌牙签或刀片在果皮处穿刺或切开组织,用无菌打孔器在培养基上取香蕉黄条叶斑病菌菌丝块,接种在伤口上,用湿润的脱脂棉包裹伤口,用塑料袋覆盖,2 5左右,相对湿度1 0 0%,黑暗条件下保湿4 8h,接种后5d 1 0d后观
10、察接种点附近是否出现可疑病斑,观察症状并对果实发病处再做病原菌分离,若接种样品中分离出的菌株培养性状和形态特征符合第8章中的描述,且P C R扩增结果呈阳性,可判定致病性测定阳性。8 形态学鉴定特征病原菌的形态观察:香蕉黄条叶斑病菌菌落在培养基上初为白色,培养2d后菌落中央变为深灰色,菌落疏展,培养4d后菌落变为灰绿色,培养1 0d后成熟的菌落进一步变为灰绿色。分生孢子梗培养2d后出现,丛生,直立或稍弯曲,瓶状,无分隔,顶端钝圆,无明显孢痕;分生孢子单个着生,浅白色或浅褐色,光滑,直立或稍弯曲,圆筒形至倒棍棒形,顶端和基部钝圆,基部无明显孢痕,有35个横膈膜,大小为1 0m8 0m2m6m,平
11、均1 8.5m3m。形态学鉴定特征按照附录C执行。9 结果判定以形态学特征和实时荧光P C R检测结果作为判定依据,进行综合判定:若植物组织中的病原菌和分离物的形态特征与第8章鉴定特征吻合,且实时荧光P C R检测结果为阳性,判定为检出香蕉黄条叶斑病菌M y c o s p h a e r e l l am u s i c o l a;若植物组织中的病原菌和分离物的形态特征与第8章鉴定特征不吻合,且实时荧光P C R检测结果为阴性,判定为未检出香蕉黄条叶斑病菌M y c o s p h a e r e l l am u s i c o l a;若植物组织中的病原菌和分离物的形态特征与第8章鉴定
12、特征吻合,且实时荧光P C R检测结果为阴性,判定为未检出香蕉黄条叶斑病菌M y c o s p h a e r e l l am u s i c o l a。1 0 记录和样品保存1 0.1 样品保存对检出香蕉黄条叶斑病菌的样品应保存于4冰箱中,以备复核,该类样品按照实验室样品管理办法保存期满后经高压灭菌后方可处理。分离到的香蕉黄条叶斑病菌应接种于P D A培养基中妥善保存。1 0.2 结果纪录与资料保存包括:样品的来源、种类、采样时间、检测时间、地点、方法、结果等,并有实验人员的签字。荧光P C R要有荧光结果图片。3S N/T5 3 8 92 0 2 1以正式出版文本为准附 录 A(资料
13、性)香蕉黄条叶斑病危害症状、发生与分布A.1 危害症状多在上部叶片显症。初期症状是叶片出现轻微变色,形成细小、黄绿色病纹,扩展后,形成与叶脉平行的暗褐色条纹病斑,外围黄色晕环。以后病斑逐渐扩展成椭圆形,呈褐色或锈红色,外缘有黑色或深褐色细线,具黄色晕圈。发生多时,病叶局部或全叶枯死。潮湿条件下,病斑表面可见大量灰色霉状物。受害株如多数叶片染病,则不能抽穗,或抽出的果穗瘦,果肉变色;如整株失去功能叶片,抽出的果穗常腐烂、折断,整穗脱落,严重减产。香蕉黄条叶斑病菌侵染叶片的发病症状见图A.1。图A.1 香蕉黄条叶斑病菌侵染叶片的发病症状(引自B r i t o2 0 1 5)A.2 寄主范围主要危
14、害M u s a(香蕉属)的植物。A.3 地理分布香蕉黄条叶斑病是一种全球性流行病害,分布广泛,在多个大洲均有报道。具体如下:4S N/T5 3 8 92 0 2 1以正式出版文本为准亚洲:不丹,文莱,柬埔寨,印度,印度尼西亚,老挝,马来西亚,尼泊尔,菲律宾,斯里兰卡,泰国,越南,也门。非洲:安哥拉,喀麦隆,佛得角,科特迪瓦,埃塞俄比亚,加蓬,加纳,几内亚,几内亚比绍,肯尼亚,马达加斯加,马拉维,毛里求斯,莫桑比克,尼日利亚,圣多美,塞拉利昂,索马里,南非,坦桑尼亚,多哥,乌干达,刚果,赞比亚。北美洲:墨西哥,美国。中北美洲及南美洲:阿根廷,巴哈马,巴巴多斯,玻利维亚,巴西,哥伦比亚,哥斯达黎
15、加,古巴,多米尼加,厄瓜多尔,萨尔瓦多,圭亚那,格林纳达,危地马拉,海地,洪都拉斯,牙买加,尼加拉瓜,巴拿马,波多黎各,秘鲁,苏里南,特立尼达和多巴哥,委内瑞拉等。大洋洲:美属萨摩亚,澳大利亚,斐济,关岛,基里巴斯,新西兰,瓦努阿图等国家均有分布。5S N/T5 3 8 92 0 2 1以正式出版文本为准附 录 B(规范性)香蕉黄条叶斑病菌实时荧光P C R检测B.1 D N A制备称取充分混匀的待测培养物1 0 0m g(液氮处理研磨),加入至1.5m L的微量离心管中,加入6 5预热的6 0 0LC T A B裂解液,振荡混匀,置于6 5水浴中处理3 0m i n,期间每隔1 0m i n
16、混匀一次;取出冷却至室温后,加入等体积的三氯甲烷/异戊醇(2 4:1),充分混匀,室温1 50 0 0g离心1 5m i n;小心吸取上清液(约6 0 0L)至一新的1.5m L离心管,加入2.5倍体积的预冷的无水乙醇或0.8倍体积的异丙醇,再加入1/1 0体积的3m o l/L乙酸钠(p H4.8),充分混匀,-2 0(加入无水乙醇时)或4(加入异丙醇时)放置3 0m i n以上;4,1 50 0 0g离心1 5m i n,弃去上清液;加入7 0%的乙醇5 0 0L,洗涤沉淀两次,室温1 50 0 0g离心5m i n弃上清(注意不要把沉淀倒出),晾干沉淀,至乙醇挥发殆尽后,加入5 0L的去
17、离子水或T E缓冲液溶解沉淀,-2 0保存待用。也可用相应市售D NA提取试剂盒提取D NA。B.2 引物序列选择香蕉黄条叶斑病菌肌动蛋白基因(A C T)设计特异引物及探针。香蕉黄条叶斑病菌特异引物(A C T):正向引物A C T-PMF:5-GAG C C C AG C AT C C AT T G-3反向引物A C T-PMR:5-AG T C C T T C T GA C C C AT A-3探针PMMG B:5-T AT G C GA C T C C G C C C T C C-3(探针5 端含有F AM报告基因,3 端含有不发荧光的猝灭基因)。B.3 扩增条件P C R扩增反应体系
18、为:P C R混合液(含缓冲液,氯化镁,d NT P s,T a q酶)1 0L、引物A C T-PMF/A C T-PMR(工作浓度为1 0m o l/L)各1L、探针PMMG B(工作浓度为1 0m o l/L)为1L,超纯水8L。反应总体积为2 0L。将反应体系混合均匀后置于荧光P C R仪中进行反应。以香蕉黄条叶斑病菌D NA作阳性对照、不含香蕉黄条叶斑病菌D NA作阴性对照、以无菌蒸馏水作空白对照,每个样品设置3个重复。反应条件为:5 0预热2m i n;9 51 5m i n;然后9 41 5s,6 06 0s,共4 0个循环。B.4 实时荧光P C R检测结果在阴性对照、空白对照
19、正常的情况,则有如下判定:样品无C t值并且无扩增曲线,判定为阴性;样品C t值3 5.0,且出现典型的扩增曲线,判定为阳性;样品C t值在3 5.04 0.0之间时,应重新提取样品D NA进行扩增检测。C t值仍在3 5.04 0.0之间,且分离曲线明显的,判断该样品检出香蕉黄条叶斑病菌。6S N/T5 3 8 92 0 2 1以正式出版文本为准附 录 C(规范性)香蕉黄条叶斑病菌形态学特征C.1 香蕉黄条叶斑病菌形态学特征形态学特征见图C.1。图C.1 香蕉黄条叶斑病菌形态学特征(引自M e r e d i t h和L a w r e n c e1 9 7 0)C.2 与近缘种分生孢子大小
20、比较分生孢子与近缘种P s e u d o c e r c o s p o r ah a k e a e和P s e u d o c e r c o s p o r al o n g i s p o r a相比,分生孢子具有明显的差别。见表C.1。表C.1 与近缘种分生孢子大小比较M y c o s p h a e r e l l am u s i c o l a(1 0m8 0m)(2m6m)P s e u d o c e r c o s p o r ah a k e a e(5 0m8 0m)(5m9m)P s e u d o c e r c o s p o r al o n g i s
21、p o r a(8 2m1 2 0m)(2.5m4m)S N/T5 3 8 92 0 2 1以正式出版文本为准S N/T5 3 8 92 0 2 1参 考 文 献 1 王国芬,黄俊生,谢艺贤,彭军,代鹏,谢玉萍.香蕉叶斑病的研究进展.2 0 0 6.果树学报.2 3:9 6-1 0 1.2 A r z a n l o uM,G r o e n e w a l dJ Z,F u l l e r t o nR A,A b e l nE C,C a r l i e rJ,Z a p a t e rMF,B u d d e n h a g e nI W,V i l j o e n A,C r o u
22、sPW.2 0 0 8.M u l t i p l eg e n eg e n e a l o g i e sa n dp h e n o t y p i cc h a r a c t e r sd i f f e r e n t i a t es e v e r a l n o v e l s p e c i e s o fM y c o s p h a e r e l l aa n d r e l a t e da n a m o r p h s o nb a n a n a.P e r s o o n i a-M o l e c u l a rP h y l o g-e n ya n d
23、E v o l u t i o no fF u n g i.2 0:1 9-3 7.3 C h a n gT C,S a l v u c c iA,C r o u sPW,S t e r g i o p o u l o s I.2 0 1 6.C o m p a r a t i v eg e n o m i c s o f t h eS i g a t o-k ad i s e a s ec o m p l e xo nb a n a n as u g g e s t sa l i n kb e t w e e np a r a l l e l e v o l u t i o n a r yc
24、 h a n g e s i nP s e u d o c e r c o s-p o r af i j i e n s i sa n dP s e u d o c e r c o s p o r a e u m u s a ea n di n c r e a s e d v i r u l e n c e o n t h e b a n a n a h o s t.P L o SG e n e t i c s.1 2:e 1 0 0 5 9 0 4.4 C r o u sPW,B r a u nU,H u n t e rG C,W i n g f i e l dM J,V e r k l e
25、 yG J,S h i nHD,N a k a s h i m aC,G r o e-n e w a l dJ Z.P h y l o g e n e t i c l i n e a g e s i nP s e u d o c e r c o s p o r a.2 0 1 3.S t u d i e s i nM y c o l o g y.7 5:3 7-1 1 4.5 B r i t oF S D.2 0 1 5.D i v e r s i d a d eg e n t i c ad ep o p u l a e sd eM y c o s p h a e r e l l am u s
26、 i c o l ae c a r a c t e r i z a od oe f e t o r l y s me m M y c o s p h a e r e l l ag r a m i n i c o l a.P h.Dt h e s i s.U n i v e r s i d a d ed eB r a s l i a,B r a z i l.6 G o m e s L I,D o u h a n GW,B i b i a n o L B,M a f f i a L A,M i z u b u t iE S.2 0 1 3.M y c o s p h a e r e l l am
27、u s i c o l ai d e n t i f i e da st h eo n l yp a t h o g e no ft h eS i g a t o k ad i s e a s ec o m p l e xp r e s e n ti n M i n a sG e r a i sS t a t e,B r a z i l.P l a n tD i s e a s e.9 7:1 5 3 7-4 3.7 J a c o m eL,L e p o i v r eP,M a r i nD,O r t i zR,R o m e r oR,E s c a l a n tJ V.M y c
28、 o s p h a e r e l l al e a fs p o td i s e a s e so fb a n a n a s:p r e s e n t s t a t u sa n do u t l o o k.2 0 0 2.I nP r o c e e d i n g so f t h eW o r k s h o po nM y c o s p h a e-r e l l al e a f s p o td i s e a s e sh e l d i nS a nJ o s e,C o s t aR i c a.8 M e r e d i t h D S,L a w r e
29、 n c eJ S.1 9 7 0.M o r p h o l o g yo f t h ec o n i d i a l s t a t eo fM y c o s p h a e r e l l am u s i-c o l ai nt h eP a c i f i c r e g i o n.T r a n s a c t i o n so f t h eB r i t i s hM y c o l o g i c a lS o c i e t y.5 4:2 6 5-2 8 1.9 M o u r i c h o nX,C a r l i e r J,F o u r E.1 9 9 7
30、.S i g a t o k a l e a f s p o td i s e a s e s.M u s ad i s e a s e f a c t s h e e t 8.1 0 M u l d e r J L,S t o v e rRH.1 9 7 6.M y c o s p h a e r e l l as p e c i e s c a u s i n gb a n a n a l e a f s p o t.T r a n s a c t i o n so f t h eB r i t i s hM y c o l o g i c a lS o c i e t y.6 7:7 7-8 2.12029835T/NS版权专有 侵权必究*书号:1 5 5 1 7 56 8 2定价:1 2.0 0元