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1、ICS 11.020CCS C 61WS中 华 人 民 共 和 国 卫 生 行 业 标 准WS/T 7912021钩虫检测及虫种鉴定标准 钩蚴培养法Detection and identification standard of hookwormHookworm larvae coproculture techniques20211123 发布20220501 实施中华人民共和国国家卫生健康委员会发 布WS/T 7912021I前言本标准由国家卫生健康标准委员会寄生虫病标准专业委员会负责技术审查和技术咨询，由中国疾病预防控制中心负责协调性和格式审查，由国家卫生健康委疾病预防控制局负责业务管理、
2、法规司负责统筹管理。本标准起草单位：河南省疾病预防控制中心、中国疾病预防控制中心寄生虫病预防控制所、浙江省疾病预防控制中心。本标准主要起草人：许汴利、邓艳、郑彬、陈伟奇、张雅兰、陈颖丹、阮卫、张红卫。WS/T 79120211钩虫检测及虫种鉴定标准 钩蚴培养法1范围本标准规定了钩蚴培养法对十二指肠钩口线虫和美洲板口线虫进行检测的方法。本标准适用于各级疾病预防控制机构和医疗机构对钩虫的检测和虫种鉴定。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本标准必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本标准；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本标准
3、。WS 233 病原微生物实验室生物安全通用准则WS/T 439 钩虫病的诊断3术语和定义WS/T439 界定的以及下列术语和定义适用于本标准。3.1十二指肠钩口线虫 Ancylostoma duodenale十二指肠钩虫属于钩口科、钩口线虫属，我国主要分布于北方地区。3.2美洲板口线虫 Necator americanus美洲钩虫属于钩口科、板口线虫属，我国主要分布于南方地区。3.3钩蚴 hookworm larvae钩虫的幼虫。注：分为杆状蚴和丝状蚴两个阶段，丝状蚴为感染阶段幼虫，其形态特征有助于虫种鉴定。WS/T 791202124仪器设备4.1生物显微镜（物镜 10 倍、40 倍，目镜
4、 10 倍）。4.2培养箱（隔水式恒温）。4.3目镜测微尺（5mm/50/0.1mm）和物镜测微尺（1mm/100/0.01mm）。5试剂或材料5.1试管（12.0cm1.5cm）或 15mL 离心管。5.2滤纸条（12 cm2 cm），边缘整齐、无毛边，对孔径、流速无要求。5.3蒸馏水。5.4试管架。5.5载玻片（76 mm26 mm）。5.6盖玻片（20 mm20 mm)。5.7吸管（2mL、10mL）。5.8镊子。5.9刮棒（加藤板配套刮棒适用）。5.10 温度计。6检测步骤6.1样本采集取 5g10g 新鲜粪便置于粪便采样盒或采样袋内，标记待检样本编号、采集日期，样本应及时送检。如未能
5、及时检测，在 48条件下冷藏保存，时间应不超过 24h。6.2样本检测6.2.1在试管上标注待检样本编号和日期。6.2.2试管内加入室温蒸馏水约 2mL。6.2.3将滤纸条沿长轴对折，以保持挺直。6.2.4用刮棒取 0.3g0.5g 粪便，均匀涂抹于滤纸中段偏上部，左右各留约 0.5cm，上端留约 1cm，下端留约 2.5cm 空白（见附录 A）。6.2.5将涂有粪便的滤纸插入试管，滤纸插入水中的深度以粪膜下缘距水面上 1cm 为宜（见附录 A）。WS/T 791202136.2.6将试管置于培养箱内，31培养 4 d，或室温 2630培养 6 d8 d。培养期间每日观察管底水量，必要时沿管壁
6、加蒸馏水以保持原始液面高度，防止干燥。6.2.7分离幼虫：取出试管，沿管壁加入 45 蒸馏水，淹没滤纸上的粪膜，1 h 后用镊子取出滤纸条，弃去。将培养管置于试管架上静置 1 h，吸去上清液，留取约 0.5 mL 沉淀液。6.3镜下观察将试管底部浸于 50 60 的热水内制动 2min3min。吸取管内沉淀物 1 滴3 滴于载玻片上，加盖玻片，将载玻片置于低倍镜下（1010）弱光检查，发现疑似虫体后置于高倍镜下（4010）观察形态结构，用测微尺测量幼虫大小。6.4结果判定若一份样本所有沉淀物中均未检出钩蚴，判为阴性；若检出钩蚴，判为阳性。根据丝状蚴形态特征进行十二指肠钩虫和美洲钩虫的鉴定（见附
7、录 B），并与其他土源性线虫丝状蚴进行鉴别（见附录 C）。6.5废弃物处置实验中所有材料应按照 WS 233 进行处理。WS/T 79120214AA附录A（资料性）钩蚴培养法操作示意图钩蚴培养法操作可参照图A.1和图A.2。图A.1 粪样涂抹示意图图A.2 滤纸条及离心管位置示意图WS/T 79120215附录B（资料性）十二指肠钩虫与美洲钩虫丝状蚴的鉴别十二指肠钩虫与美洲钩虫丝状蚴的鉴别钩蚴分为杆状蚴和丝状蚴两个阶段，自卵内刚孵出的幼虫为杆状蚴，杆状蚴经过两期发育成为丝状蚴，长约0.5mm0.7mm，体表覆有鞘膜，口腔封闭，在与食管连接处有2个角质状的矛状结构，称口矛。此期幼虫形态特征明显
8、，两种钩虫丝状蚴的鉴别要点见表B.1、图B.1。表B.1十二指肠钩虫与美洲钩虫丝状蚴的鉴别要点鉴别要点十二指肠钩虫丝状蚴美洲钩虫丝状蚴外形细长，自头至肛门宽度相近粗短，自食管基部起渐次缩小口矛难见到或细、短较易见到，呈暗色杆状头端形态扁平，中间微有凹陷圆形，无凹陷鞘膜横纹不显著显著食管与肠连接处呈微细颗粒状横带透明状横带肠管管腔较窄，肠细胞颗粒丰富管腔较宽，肠细胞颗粒少生殖原基肠管中部稍后肠管中部稍前WS/T 79120216图B.1 十二指肠钩虫及美洲钩虫丝状蚴形态示意图（仿WHO）十二指肠钩虫丝状蝴美洲钩虫丝状蝴头端口矛食管与肠连接处生殖原基黯膜横纹肠管鞠WS/T 79120217附录C（
9、资料性）钩虫与其他土源性线虫丝状蚴的鉴别钩虫与类圆线虫属（Strongyloides）、毛圆线虫属（Trichostrongylus）、结节线虫属（Oesophagostomum）等丝状蚴可通过鞘的有无、食管占体长比例、肠管腔直或弯曲、虫体尾端形态等特征进行虫种鉴别，主要鉴别要点见表C.1，图C.1。表 C.1钩虫、粪类圆线虫和东方毛圆线虫丝状蚴的形态鉴别鉴别点钩虫粪类圆线虫东方毛圆线虫体长（mm）0.50.70.50.75咽管为体长的 1/5为体长的 1/2，咽管球不明显为体长的 1/4生殖原基在虫体的中部在虫体后部-尾端尖细分叉有小球状物WS/T 79120218图 C.1土源性线虫丝状蚴
10、检索图（仿余森海,1992.）WS/T 79120219参考文献1吴观陵.人体寄生虫学.4 版.北京:人民卫生出版社，2013.2许隆祺.图说寄生虫学与寄生虫病.北京:北京科学技术出版社，2016.3薛纯良,许隆祺.寄生虫病诊断与治疗.长沙:湖南科技出版社，2002.4余森海,许隆祺.人体寄生虫学彩色图谱.北京:中国科学技术出版社，1992.5诸欣平,苏川人体寄生虫学.9 版.北京:人民卫生出版社，2018.6Harada Y,Mori O.Anew method for culturing hookworm.Yonago Acta Med.1955,1:177179.7Kitvatanach
11、ai S,Taylor A,Rhongbutsri P,et al.Modified Harada-Mori and simple wet mount todetermine hookworm infections in Yo Island urban area,Songkhla,Southern Thailand.Trop Med Health.2019,47(27):1-5.8 Martn-Rabadn P,Muoz P,Palomo J,et al.Strongyloidiasis:the Harada-Mori test revisited.ClinMicrobiol Infect.1999,5(6):374-376.9 Report of a WHO Scientific Group.World Health Organization Technical Report Series 666:Infestinalprofozoan and helminthic infections.World Organisation for Animal Health and World HealthOrganization.1981.