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1、 ICS 65.020 CCS B 15 DB22 吉林省地方标准 DB 22/T 33162021 滞育松毛虫赤眼蜂生产技术规程 Code of practice for production of diapause Trichogramma dendrolimi 2021-11-26 发布 2021-12-15 实施吉林省市场监督管理厅 发 布 DB22/T 33162021 I 前 言 本文件按照 GB/T 1.12020 标准化工作导则 第 1 部分：标准化文件的结构和起草规则的规定起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由吉林省农业农村厅
2、提出并归口。本文件起草单位：吉林农业大学。本文件主要起草人：张俊杰、杜文梅、阮长春、张雪。DB22/T 33162021 1 滞育松毛虫赤眼蜂生产技术规程 1 范围 本文件确立了滞育松毛虫赤眼蜂（Trichogramma dendrolimi Ishii）生产的程序，规定了前期准备、赤眼蜂繁育、精选与储存等阶段的操作指示，描述了记录档案等追溯方法。本文件适用于利用柞蚕卵繁育的滞育松毛虫赤眼蜂工厂化生产。2 规范性引用文件 本文件没有规范性引用文件。3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。3.1 滞育诱导 diapause induction 利用持续低温诱导松毛虫赤眼蜂稳定进入滞育状态的一
3、个过程。3.2 滞育持续期 diapause maintenance 赤眼蜂进入稳定滞育到解除滞育前的阶段。3.3 滞育解除 diapause termination 通过条件控制，使赤眼蜂结束滞育期，继续发育至羽化出蜂的过程。4 滞育赤眼蜂生产程序 滞育松毛虫赤眼蜂生产分为 3 个阶段。程序流程图如图 1 所示：图1 滞育松毛虫赤眼蜂工厂化生产流程 5 生产前准备 DB22/T 33162021 2 5.1 厂房及规模 按照 150 亿头滞育松毛虫赤眼蜂生产规模应包括：a)蜂种繁育室不低于 20 m2；b)暖茧车间不低于 300 m2；c)采卵室不低于 50 m2；d)洗卵室不低于 20 m
4、2；e)消毒及晾干室不低于 25 m2；f)接种室不低于 10 m2；g)暗室不低于 50 m2；h)发育室不低于 50 m2；i)保鲜冷藏室不低于 100 m2；j)物品保存库不低于 20 m2。5.2 设备 低温生化培养箱、药品保存箱、搅拌器、脱水机、烘干机、柞蚕卵色选机、空调、排风机、电暖气、加湿器、温湿度自控仪、电脑及打印机、发育盘架、手推运输车。5.3 常用药品及材料 5.3.1 25 g/L 30 g/L 苯扎溴铵溶液（新洁尔灭消毒液）。5.3.2 孔径为 0.15 mm 的纱网。5.3.3 孔径为 2.00 mm 的纱网。5.4 蜂种 5.4.1 蜂种采集 生产前 1 年的 7
5、月下旬至 8 月初，在自然条件下未放蜂玉米田采集玉米螟卵块，以半山区近水边为宜。5.4.2 蜂种纯化 采集的玉米螟卵块带回室内发育培养，将寄生变黑的卵块单独装入试管，羽化出蜂后引单头雌蜂，放入装有 100 粒米蛾卵的试管（10 mm 70 mm）转接寄生。发育条件为（251）、RH（755）%、光照 16 h、黑暗 8 h。5.4.3 松毛虫赤眼蜂鉴定 根据雄性赤眼蜂外生殖器的形态特征进行种类鉴定，参照附录 A 执行。5.4.4 蜂种滞育保存 鉴定纯化的松毛虫赤眼蜂，经 3 代 5 代筛选繁殖，建立实验种群后保存使用：a)将纯化的松毛虫赤眼蜂蜂种在(251)、RH(755)%条件下，按蜂卵（柞
6、蚕卵）比 2:1 接种 24 h 后去除种蜂；b)接蜂后发育 36 h 46 h 到幼虫中期，置入 12、RH(755)%的条件下，滞育诱导 30 d，赤眼蜂滞育；DB22/T 33162021 3 c)将滞育持续期的赤眼蜂置入(31)、RH(755)%的条件下，进行滞育解除 60 d 90 d；d)经 10 48 h、15 24 h 过渡后，按光照 16 h，(251)、RH(755)%；黑暗 8 h，(201)、RH(755)%，变温发育至出蜂。5.5 柞蚕茧 5.5.1 备茧 5.5.1.1 备茧时期 在生产前一年的 11 月 12 月份开始按预定计划备茧。5.5.1.2 茧质要求 5.
7、5.1.2.1 健康雌茧率 90%；5.5.1.2.2 雄茧率 7%；5.5.1.2.3 死伤茧率 3%；5.5.1.2.4 割口茧率 8%；5.5.1.2.5 发育蛹和嫩蛹 5%；5.5.1.2.6 茧层率 10%，无薄皮茧、瘪茧；5.5.1.2.7 茧干燥，未在-3 以下低温储存。5.5.1.3 备茧数量 按每繁 150 亿头松毛虫赤眼蜂用茧 15000 kg计算。5.5.2 蚕茧保存 5.5.2.1 保存温度(31)、RH(605)%。5.5.2.2 适当通风换气，保持空气含氧量。5.5.2.3 防止接触有毒有害物质。5.5.2.4 储存时间不低于 45 d。6 工厂化生产 6.1 灭菌
8、消毒 在生产前 1 周，将所有繁蜂车间及繁蜂工具，进行集中消毒。消毒方法为如下：a)首先对消毒对象进行清水或 0.5%1%氢氧化钠、1%的漂白粉水冲洗；b)用生石灰或石灰水对繁蜂车间喷刷覆盖；c)将繁蜂工具等置于繁蜂车间内，用毒消散或硫磺等熏蒸消毒。保持室温 24 以上，RH 75%以上，时间 24 h。6.2 蜂种复壮与扩繁 6.2.1 复壮 根据生产计划，定期对松毛虫赤眼蜂蜂种，以米蛾卵和柞蚕卵交替繁育复壮：a)接蜂比例：米蛾卵蜂卵比 1：200，柞蚕卵蜂卵比 1:1；DB22/T 33162021 4 b)接蜂时间：24 h；c)发育条件：(251)、RH(755)%、光照 16 h、黑
9、暗 8 h；d)复壮周期：30 d。6.2.2 扩繁 以柞蚕卵为寄主，将蜂种扩繁 2 代 3 代：a)接蜂比例：1：30（蜂种寄生柞蚕卵：新鲜卵）；b)接蜂时间：24 h；c)接蜂条件：全黑暗，(251)、RH(755)%；d)发育条件:同 6.2.1 c)；e)将末 1 代蜂种发育至幼虫中后期置于(31)、RH(755)%条件下冷藏，冷藏时间 15 d。6.3 寄主卵 6.3.1 暖茧发蛾 暖茧室保持 18 22，RH(705)%，20 d 25 d 后柞蚕茧羽化出蛾。6.3.2 收蛾 在柞蚕蛾羽化期内，随时采收刚羽化（展翅前）雄蛾，避免交尾，次日清晨人工收雌蛾，用于当天繁蜂或储存在(31)
10、的冷库中备用。6.3.3 剖腹取卵 用人工方法将柞蚕雌蛾腹部与头胸部分离，剖腹取卵。6.3.4 洗卵 用搅拌器将卵与蛾腹内杂物搅拌分离，漂净杂物，然后反复用清水冲洗至卵粒无杂质。6.3.5 卵面消毒 将清洗干净的新鲜卵用 0.1%的苯扎溴铵溶液浸泡 10 min。6.3.6 脱水晾卵 消毒后的新鲜卵用纱网袋装好，用脱水机进行初步脱水，然后用烘干机烘干，温度不超过 25 28。6.3.7 清除绿卵 烘干的新鲜卵用色选机等专用设备清除绿卵后，再用于接蜂，绿卵率 4%。6.4 接蜂 蜂种卵与新鲜柞蚕卵按 1:25 1:30 比例进行接蜂。当蜂种羽化 25%30%时，将种蜂卵均匀撒在接蜂盘中，铺上孔径
11、为 2 mm 的纱网，再将新鲜卵平铺到纱网上，送入(251)、RH(755)%的暗室内产卵寄生，36 h 48 h 后，去除蜂种，标明日期送入发育室发育。6.5 培养发育 DB22/T 33162021 5 接蜂后的寄生卵分批次送入(251)、RH(755)%，自然光照条件下的发育室，继续发育 12 h 24 h，镜检至幼虫中后期。6.6 滞育诱导 将发育到幼虫中后期的松毛虫赤眼蜂，在 10 12、RH(755)%的全暗条件下，平铺在卵盘内，卵厚 3 cm 4 cm，每天翻动两次，诱导 25 d 30 d后，赤眼蜂滞育。6.7 滞育解除 诱导滞育结束后即进入到滞育持续期，将滞育的赤眼蜂转入(3
12、1)、RH(755)%的黑暗条件下滞育解除，时间 70 d 90 d。6.8 变温发育 滞育解除后的赤眼蜂采用分步渐变加温的方式进行发育：a)在(101)、RH(755)%全暗条件下加温 48 h；b)在（151）、RH(755)%全暗条件下加温 24 h；c)在日间 25 下 16 h、夜间 20 下 8 h，RH(755)%室内条件下发育至蛹后期。7 精选与储存 7.1 精选 将发育至蛹后期的赤眼蜂寄生卵，用绿卵色选机去除未寄生卵、劣质卵、绿卵及其它杂质。7.2 储存 将精选后的赤眼蜂转入(31)、RH(755)%的保鲜冷藏室储存备用，储存时间 7 d。8 记录档案 建立滞育松毛虫赤眼蜂工
13、厂化生产档案，对整个生产过程进行详实记录，保存 2 年以上，做到可追溯：a)每天的温湿度记录；b)每批次滞育赤眼蜂的生产日期；c)每批次滞育赤眼蜂的滞育率和解除滞育率；d)每批次滞育赤眼蜂的加温日期。DB22/T 33162021 6 A A 附 录 A（资料性）松毛虫赤眼蜂形态学鉴定方法 A.1 制作鉴定玻片 将用浓度 75%95%酒精浸泡的雄性赤眼蜂标本按下列方法制作为玻片：a)在 5%的 KOH 溶液中浸泡 8 h 15 h，并用水清洗干净，置于载玻片上；b)在解剖镜下，用昆虫针挑取雄蜂的外生殖器，清除其他组织，盖好盖玻片；c)在显微镜下观察并测量阳基背突、腹中突及 D 值。A.2 观察测量并鉴定 在显微镜下观察赤眼蜂雄性外生殖器并测量其阳基背突、腹中突及 D 值，符合下列特征的属于雄性松毛虫赤眼蜂：a)阳基背突有明显宽圆形的侧叶，末端达 D 值的 3/4；b)腹中突的长度约等于 D 值的 3/5 3/4；c)钩爪末端伸达 D 值的 3/4。图A.1 松毛虫赤眼蜂雄性外生殖器-阳基 _