《NY∕T 1949-2010 隐孢子虫卵囊检测技术 改良抗酸染色法(农业).pdf》由会员分享，可在线阅读，更多相关《NY∕T 1949-2010 隐孢子虫卵囊检测技术 改良抗酸染色法(农业).pdf（9页珍藏版）》请在taowenge.com淘文阁网|工程机械CAD图纸|机械工程制图|CAD装配图下载|SolidWorks_CaTia_CAD_UG_PROE_设计图分享下载上搜索。
1、ICS 11.220 B 41 中华人民共和国农业行业标准NY/T 1949-2010 隐于包子虫卵囊检测技术改良抗酸染色法Moditied acid-fast staining technique for detection of CPtosporidium spp oocysts 2010-09-21发布2010-12-01实施中华人民共和国农业部发布NY!T 1949-2010 前-E 本标准遵照GB/T1.1-2009给出的规则起草。本标准由中华人民共和国农业部提出。本标准由全国动物防疫标准化技术委员会CSAC/TC181)归口。本标准起草单位南京农业大学、中国农业科学院上海兽医研究所
2、。本标准起草人:黄克和、陈甫、陈兆国。I NY/T 1949-2010 隐抱子虫卵囊检测技术改良抗酸染色法1 范围本标准规定了改良抗酸染色法(MAFS)检测l隐抱子虫卵囊的操作技术和结果判定要求。本标准适用于猪、牛、羊、兔、犬、鸡和鸭等动物(新鲜粪便样品或直肠采样隐抱子虫感染的诊断与流行病学调查。2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB 19489 实验室生物安全通用要求中华人民共和国国务院令2004年第424号病原微生物实验室生物安全管理条例农业部公告20
3、03年第302号兽医实验室生物安全管理规范3 试剂和器械3.1 试剂3.1.1 牛血清，一20C保存。3.1.2 隐抱子虫卵囊，2.5%重铭酸饵溶液中4C保存。3.1.3 饱和联糖漂浮液或饱和盐水(见附录A)。3.1.4 改良抗酸染色液(见附录A)。3.1.5 o.1 mol/L PBS(见附录A)。3.1.6 5%重络酸饵溶液(见附录A)。3.1.7 10%硫酸(见附录川。3.1.8 香柏油、二甲苯。3.2 器械3.2 1 普通生物显微镜。3.2.2 挂在涡混匀器。3.2.3 微量移液器5L、200L、1000L，3.2 4 微量移液器头若干。3.2.5 载玻片及盖玻片若干。3 2 6 离心
4、机(最高转速5000r/min，最大相对离心力3000g)与离心管(20mL、50mL，带盖)4 卵囊浓集与涂片4.1 样晶的保存和运送(见附录B)4 2 卵囊浓集法4.21 饱和t.!糖溶液漂浮法4.2.1.1 穿上防护服，戴上一次性手套。取1g-2 g待检样品(如成形的粪便，包括粪便表面的和内部的部分;如粪便是液体，可以混匀后取1mL-2mL加入试管)加40mL PBS，研磨后经80目铜筛过滤NY!T 1949-2010 后，放入50mL试管中混匀，1500 g离心10mino沉淀再用PBS洗涤一次，弃上消.4.2.1.2 向沉淀中加入10mL饱和煎糖溶液，加入20mL试笆中，混匀，平衡后
5、静置10min，置于离心管，放入离心机中.1500 g离心10mino 4.2.13 离心机停下后，缓慢拿出离心管，小心取出上清液，加人带盖的50mL试管中，再加入10mL PBS，混匀，1500 g离心10mino沉淀再用PBS洗涤一次，沉淀加入20LPBS昆匀，待涂片用(室温)。422 饱和盐水漂浮法4 2.2.1 粪便的过滤、离心同4.2.1.104.2.2.2 向沉淀中加入15mL饱和盐水，混匀，加入到20mL试管中，平衡后静置10min，置于离心管放人离心机中，500 g离心10mino 4.2.2.3 离心机停下后，缓慢拿出离心管，小心取出上清液，加入100mL试管中与80mL蒸馆
6、水混匀，1500 g离心10mino沉淀加80mL蒸馆水混匀，放入100mL试管中混匀，1500 g离心10min。沉淀加入20LPBS混匀，待涂片用。4.3 涂片制备4.3.1 每个载玻片均用铅笔进行标记，每个样品涂2个载玻片。在载玻片中心滴加约3L-5L牛血清.4.3.2取经上述方法获得的浓集液10L滴于载玻片上与牛血清混匀，涂成直径大小为1cm的圆，晾干。涂片过程中确保涂片是厚度均一、透明度一致。也可不进行卵囊浓集，用新鲜粪便样品直接涂片。4.3.3 在室温下晾干干燥，火焰固定，置入乙隧中3min去脂，晾干，宣入甲醇中固定3min(甲醇固定的涂片在室温下晾干后可存放6个月)。注，采用密度
7、较大的液体，将卵囊漂浮在液体的上层而将卵囊集中起来，进而将卵囊从液体表面分离出来的方法称为卵囊浓集。因为卵囊的形态对于珍断具有重要意义，所以漂浮液不能仅仅具有密度大的特点，还必须保证卵囊在其中不会变形(涨大或皱缩)。饱和j1f.糖溶液和饱和盐水都适合浓集隐袍子虫卵囊。5染色5.1 用改良抗酸染色甲液染2min-5 min，蒸馆水或自来水冲洗后甩干。5.2 在10%硫酸中脱色30s-60 s.蒸惚水或自来水冲洗，再脱色，反复至涂片不再返色。5.3 用改良抗酸染色乙液染5min，蒸馆水或自来水冲洗，自然干燥。6 结果判定用高倍显微镜(400X)观察涂片，隐抱子虫卵囊在黄绿至蓝绿色背景下为粉红色至紫
8、红色的球形或卵圆形虫体。发现疑似卵囊后，应该在汹镜(1OOOX)下确诊。油镜下，卵囊呈鲜艳玫瑰红色，外周有一层发亮的卵囊壁，内有4个月牙形或逗点状结构即子袍子，还有一团暗黑色颗粒状的残体，有的着色深，内部结构明显;有的着色谈，内部结构不够明显。检测效果(见附录C中图C.1-阁C.5)。每张涂片连续观察20个视野，发现卵囊即为阳性。每个样品观察2张涂片。感染以每张涂片20个视野中(400X)的卵囊数表示。未发现卵囊者为阴性。在涂片上常见到与隐抱子虫卵囊大小相似的酵母，应注意区别。酵母通常呈长椭圆形，没有一层发亮的外壁，无结构，在较大的母细胞上生长着较小的子细胞，两者间呈藕节状连接。7 注意事项7
9、.1 实验室应该易于清洁，表面要防渗水和耐化学药品。7.2 实验室的生物安全管理应符合病原微生物实验室生物安全管理条例、兽医实验室生物安全管理规范、GB19489的相关要求。A.1 确酸盐缓冲液(PBS)配方以下所用试剂均为分析纯A.1.1液(A液)附录A(规范性附录试剂的配制NY/T 1949-2010。.2mol/L磷酸二氢锅(NaH，PO，H，O)溶液:称取NaH，PO，H,O 27.6 g.溶于蒸馆水中，最后稀蒋至1000mL.A.1.2液(B液)0.2 mol/L磷酸氢二销溶液，Na，HPO,7H,O 53.6 g.或N电HPO，12H,O 71.6 g或Na，HPO-2H,O 35
10、.6 g)加蒸饱水溶解，最后稀释至1000mL.A.1 3液0.01 mol/L、pH7.2磷酸盐缓冲液的配制口.2mol/L A液14mL.O.2 mol/L B液36mL.NaCl 8.5 g.用蒸馆水稀释至1000mL。A.2 5%重错酸钢溶液(w/v)的配和l重错酸饵5.0g.加蒸馆水定容至100mL。A.3 饱和穰糖漂浮液500 g);f.糖加入320mL蒸馆水，慢慢加热6OC).不断搅拌，直到庶糖完全溶解.加入苯盼6.7 mL混合均匀，放在冰块或冰箱内直至其温度降到4C.冷E在糖溶液转移到-个玻璃瓶中，盖上盖子，贴好标签，标签上注明日期，并贮存于4C直至使用。A.4 饱和盐水漂浮液
11、在烧杯中加入20g氯化锅、200mL水，慢慢加热60C).不断搅拌.待溶解后再加入少量的氯化纳(约10g).10 min加一次，直到溶液变饱和.冷却后转入500mL玻璃瓶中，盖上盖子，贴好标签，注明日期，并在10C以上保存直至使用。A.5 脱色液一一10%硫酸溶液的配制浓硫酸JOmL缓慢加入蒸馆水90mL中，混匀，冷却。A.6 改良抗隘染色液配制甲液:石炭酸复红4g.95%乙醇20mL.苯M8 g.双蒸7j(100 mL.乙液:孔雀绿0.2 g.蒸馆水100mL.3 NY!T 1949-2010 B.1 取样工具附录B(规范性附录)样本的保存和运送能要下列取样工具棉拭子、封口袋和一次性手套-8
12、.2 采样方法粪便样品直拨从动物直肠用棉拭子采集;或采集新鲜粪便，装人封口袋.采样过程中样本间不得交叉污染，采样及样品前处理过程中须戴一次性手套.每件样品必须标记清楚编号、样品名称、动物来源、采样时间、单位名称.标签纸要防水，字迹不易褪色。B.3 样晶保存采集的样本在2 C-8C条件下保存应不超过24 h.民期保存须加入等体权5%重锵商量饵溶液或10%福尔马林溶液，装入消毒容内(可用铝饭盒l4C保存。阳性样品，发出报告后15d方可无害化处理。B.4 样本运送样品运送应放在-个合适的防漏样品容器内，采用保温壶或泡沫箱加冰密封，应选择便利的交通途径，确保标本于24h内到达实验室。所有样本应附有一份
13、说明，其中包括样品提交人、样本来源地、动物种类、与动物有关的病史、测试要求以及联系方式等.4 NY/T 1949-2010 附录C(资料性附录)对照图片和结果说明C.l 特异性一一阳性对照图片样品经染色后，卵囊为粉红色至玫瑰红色的球形、卵圆形，颜色鲜艳，外周有一层发亮的卵囊壁，界限对比明显，少数卵囊内部有一白色小点,.一-一 图C.I-图C.3 因C.2:，.;但VLE二i二，飞,?w./,1/.!.、.，1.t .图C.4,因C.5图C.I为抗酸接色.隐抱子虫阳囊经甲植接色脱色后，在黯红色图C.4:经MAFS(亮绿蓝色后的隐袍子虫囊在绿色背景下呈背景下呈攻瑰红色(40X);玫瑰红色(4QX)
14、图巳2，醋片脱色后米冲洗完全加乙幢直染后.隐抱子虫卵囊在图C.5:未柴色的隐抱于虫卵囊箭头所示40X).谈结色背景下呈棕红色(lOQX):图C.3，璋片经MAFS(孔雀石蜡蜂色后的隐抱于虫阳囊在蓝埠色背景下呈玫瑰红色(40X);5 NY!T 1949-2010 C.2 灵敏度一一检测域值对20份鼠粪样品和33份奶牛粪样品分别用MAFS、免疫荧光单克隆抗体(lFA-McAb)和PCR检测法进行检测，前两种方法均能检测到每克鼠粪中2.0XIO个卵囊，而PCR法能检测到每克鼠粪中20个卵囊。但所获得的鼠粪样品、奶牛粪样品的检测阳性率在三种方法之间无显著性差异(见表c.u。表C.l不同方法检测鼠粪与奶
15、牛粪样品中隐抱子虫卵囊的检测域值和阳性率方法检测域值，个/g鼠粪鼠粪样品的阳性率.%牛粪样品的阳性率，%MAFS 2.0X I03 65.003/20)21.2(7/33)IFA-McAb 2.0XI03 70.004/20)18.18(6/33)PCR 20 85.0(17/20)27.27(9/33)C.3 血清对MAFS检测效果的影响卵囊浓集样品经MAFS染色表明，涂片时加血清法较不加血清法的检测域值高一个数量积，达到每克粪便中含有2.0XIO个卵囊，而不加血清法的检测域值为每克粪便中含有2.0Xl0个卵囊。通过检测模型小鼠鼠粪样品表明，卵囊浓集后加血清涂片与不加血清涂片检测鼠粪样品的阳
16、性率差异显著(PO.05).C.4 脱色剂对MAFS的影晌无论用10%硫酸还是3%盐酸酒精进行涂片脱色，均能达到理想的脱色效果。但在脱色的过程中，10%硫酸脱色速度更快，一次只需要0.5min，涂片颜色变化快，由紫红色变为淡黄色至臼色;盐酸酒精脱色时，速度较慢，第一次需要1.0 mn-2.0 min，但是可以明显地看到紫红色顺着玻片的脱落过程。两者一般经2次-3次反复脱色后均能达到很好的脱色效果。C.5 固定剂对MAFS检测效果的影晌无论应用火焰、甲醇还是甲隆固定，鼠粪和奶牛粪样染色后的检测效率之间差异不显著(P0.05).见表C.3.表C.3不同固定扣l对MAFS检测效果的影晌固定方法鼠粪样
17、品的阳性率.%奶牛样品的阳性率，%火焰固定750 5/20)21.21(7/33)甲回事固定7004/20)21.21(7/33)甲腔固定7505/20)18.18(6/33)C.6 冲洗时间对MAFS染色效果的影晌涂片经甲液染色后冲洗，冲洗时间对脱色效果影响不大，脱包后冲洗时间较短会使涂片背景颜色变淡见图C.2).冲洗时间多于5min染色效果较好;而复染后冲洗时间较长也会使涂片的染色较淡，冲洗时间少于5min染色效果较好。NY/T 1949-2010 C.7 诊断试验验证对已经确认的249份隐于包子虫卵囊阳性样品和42份隐袍子虫卵囊阴性样品用MAFS进行了检测，结果见表C.4.表C.4粪便样
18、晶中隐袍子虫卵囊检测试验验证隐抱于虫卵囊检测技术结果统计+真阳性TP)假阳性(FP)检测阳性阳性预测值十238 11 TP+FP PV+=TP/TP+FP)249-238/(238+1D=95.6%MAFS 假阴性(FN)真阴性(TN)检测阴性阴性预测值18 24 FN+TN PV-=TN/(FN+TN)42=24/08+24)=57.1%阳性阴性所有样品256 35 TP+FP+FN+TN=291 告计敏感性特异性预测流行率=88.0%DSe=93.0%O5p=68.6%TP+FN)/TP+FP+FN+TN)TP/(TP+FN)TN/(FP+TN)256/291 238/(238+18)24/01+24)7