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1、 法医DNA分型STRSTR遗传标记遗传标记DNADNA分型技术生物学、方法学和遗传学的概况分型技术生物学、方法学和遗传学的概况 n n生物学n n方法学n n遗传学DNA提取DNA定量分析多STR遗传标记的PCR扩增 PCR产物的分离和检测（STR等位基因）样本基因型的判读样本基因型与其他样本分型结果的比对以随机匹配概率出具案件鉴定报告如果匹配，DNA纹印与群体数据库计算比较 生物学n nDNADNA的提取的提取 ：在分析：在分析DNADNA前，必须将前，必须将DNADNA同其同其他细胞物质分离，细胞中包裹、保护他细胞物质分离，细胞中包裹、保护DNADNA的细胞的细胞蛋白可抑制蛋白可抑制DN
2、ADNA分析分析。n n DNADNA定量分析：是为了确保提取的定量分析：是为了确保提取的DNADNA是来自人是来自人类而不是细菌之类的其他来源。类而不是细菌之类的其他来源。n nPCRPCR：聚合酶链式反应：是一种酶促反应，特定：聚合酶链式反应：是一种酶促反应，特定的的DNADNA区域反复复制，产出大量特定的拷贝。区域反复复制，产出大量特定的拷贝。DNA分型n n重复重复DNADNA:中等长度的核心重复单位，有时称为小卫星或可变数目的中等长度的核心重复单位，有时称为小卫星或可变数目的串联重复串联重复（VNTRVNTR）.n nSTR:STR:长度范围大约在长度范围大约在10-10010-10
3、0各碱基；包括各碱基；包括 2-62-6个碱基重复单位的个碱基重复单位的DNADNA区域称为微卫星、简单序列重复区域称为微卫星、简单序列重复（SSRSSR）或者或者（STRSTR）.n n可分为两类可分为两类：VNTRVNTR分型、分型、STRSTR分型分型n nRFLPRFLP:用限制性内切酶切割用限制性内切酶切割VNTRVNTR附近的附近的DNADNA片段片段,称为限制性片段长称为限制性片段长度多态性技术度多态性技术。n n聚合酶链式反应处理微量和低量法医样本的能力强于聚合酶链式反应处理微量和低量法医样本的能力强于RFLPRFLP技术技术 n n法医法医DNADNA分型使用的是分型使用的是
4、STRSTR分型分型n nSTRSTR分型的优势：可实现自动化并使用灵敏的荧光检测技分型的优势：可实现自动化并使用灵敏的荧光检测技术术 ，法庭科学家可快速地从这些遗传标记中收集到的数，法庭科学家可快速地从这些遗传标记中收集到的数据。同过对多个染色体上的基因座进行分析，据。同过对多个染色体上的基因座进行分析，STRSTR在无关在无关个体甚至近亲个体中都具有很高的分辨率个体甚至近亲个体中都具有很高的分辨率。方法学：方法学：STRSTR分型的流程图分型的流程图数据收集确定峰颜色分离标记峰与ladder相比较Genetype读取等位基因分析者/检验者 浏览数据由第二分析者/检验者确定结果GeneSca
5、n or FMBIOAnalysis 软件Genetyper of StaR CallGene Mapper ID软件GeneMaker HID 操作n n 一：输入数据：一：输入数据：n n选择数据对话框选择数据对话框（Open Data FilesOpen Data Files）n n 二：运行二：运行RunRunn nTemplate SelectionTemplate Selection包括：包括：panelpanel、内标、内标的颜色（默认、内标、内标的颜色（默认橙色）橙色）n npanel panel 位置是理论上给出的每个基因座下面可能出现的所位置是理论上给出的每个基因座下面可能
6、出现的所有等位基因的准确（以后提到的有等位基因的准确（以后提到的BinBin）n n内标内标（Size StandardSize Standard）:（试剂）用来转化从时间到碱基长（试剂）用来转化从时间到碱基长度的一个标准度的一个标准n n数据处理参数分为：原始数据处理（数据处理参数分为：原始数据处理（Raw Data Raw Data AnalysisAnalysis）、）、Size CallSize Call、Allele CallAllele Call三部分三部分n n原始数据处理原始数据处理：n n（1 1）确定分析范围；）确定分析范围；Auto-RangeAuto-Rangen n（
7、2 2）使峰形图更加的光滑）使峰形图更加的光滑smoothsmoothn n（3)3)起点统一到原点起点统一到原点Baseline substractionBaseline substractionn n（4 4）pull-up Correction pull-up Correction 将连带的峰删除将连带的峰删除n n (5(5）Spike RemovalSpike Removal去掉毛刺n n Matrix Matrix 文件：（文件：（ABI 3100ABI 3100中称为光谱校准）为中称为光谱校准）为电泳时不同颜色的分离标准。该文件通过包含每电泳时不同颜色的分离标准。该文件通过包含每
8、种颜色的样本的电泳而建立的。各种颜色的电泳种颜色的样本的电泳而建立的。各种颜色的电泳结果组合成一种数学矩阵，以消除与其他颜色光结果组合成一种数学矩阵，以消除与其他颜色光谱重叠的部分。谱重叠的部分。MatrixMatrix文件可为检测设备提供荧文件可为检测设备提供荧光类型识别，对于检测数据分析至关重要。光类型识别，对于检测数据分析至关重要。n nMatrixMatrix 失效称为失效称为“Pull-upPull-up”,”,是由于检测仪器无法是由于检测仪器无法正常识别标记正常识别标记STR STR 扩增产物的染料颜色。这种现扩增产物的染料颜色。这种现象是由于光谱的叠加造成的。当检测结果超过设象是
9、由于光谱的叠加造成的。当检测结果超过设备的线性范围时，峰就会出现其余颜色的备的线性范围时，峰就会出现其余颜色的“拔起拔起”或者或者“渗透渗透”。n n此时需要重新作此时需要重新作”MatrixMatrix”的标准，软件生成新的标准，软件生成新的的MatrixMatrix,即可纠正这一问题。即可纠正这一问题。n nSize callSize call ：主要是进行由时间到碱基长度的转化主要是进行由时间到碱基长度的转化n nAllele call:(1)Allele call:(1)选择分析范围选择分析范围n n (2)(2)设置峰的强度范围设置峰的强度范围(50-30000)(50-30000)
10、n n下一个对话框：下一个对话框：n n自动校正自动校正PanelPanel，自动挑选最适合的自动挑选最适合的LadderLaddern n选择阳性对照选择阳性对照 n nAllele PeakAllele Peak分数阈值分数阈值n n混合样本判断阈值混合样本判断阈值 名词解释：n n1 1：Ladder:Ladder:等位基因分型标准物等位基因分型标准物（Allelic laddersAllelic ladders）是一个人是一个人为样本为样本。某一某一STRSTR 遗传标记在人群中常见的等位基因的混遗传标记在人群中常见的等位基因的混合物。是检测每一个合物。是检测每一个STRSTR基因座的
11、标准，它是对不同实验基因座的标准，它是对不同实验室因仪器和条件不同检测到的不同片段进行校正的表要保室因仪器和条件不同检测到的不同片段进行校正的表要保证证.含有特定含有特定STRSTR遗传标记的所有等位基因。遗传标记的所有等位基因。n n2 2：阴性对照：包含全部：阴性对照：包含全部PCRPCR混合物而不含有模板混合物而不含有模板DNADNA，使用水或者缓冲液充当模板成分，用于评估使用水或者缓冲液充当模板成分，用于评估PCRPCR成分是否成分是否被被DNADNA 污染。污染。n n3 3：阳性对照：用于监控反应成分是否失效或缺失。阳性：阳性对照：用于监控反应成分是否失效或缺失。阳性对照是一个已知
12、序列的高质量的标准对照是一个已知序列的高质量的标准DNADNA。与其他参与扩。与其他参与扩增的样本使用相同引物同时扩增。目的增的样本使用相同引物同时扩增。目的 是确认反应成分是确认反应成分和温度循环参数适宜扩增特和温度循环参数适宜扩增特定定 DNADNA区域。区域。n n4 4；混合样本：混合样本：LadderLadder 当中列出了，一个样本基因座下可当中列出了，一个样本基因座下可能出现的所有等位基因，即能出现的所有等位基因，即STRSTR重复次数。但是一个样本重复次数。但是一个样本下，一个基因座下面只可能出现一到二个峰，出现三个或下，一个基因座下面只可能出现一到二个峰，出现三个或者三个以上
13、的即认为为混合样本。者三个以上的即认为为混合样本。检查与修正检查与修正Size CallSize Call：一般来说，需要检查分值一般来说，需要检查分值8080以下的样本以下的样本 ：通通过增加或者减少峰来完成，主要实现，由时间过增加或者减少峰来完成，主要实现，由时间转化成长度之间的线性关系转化成长度之间的线性关系。检查检查ladderladder，Panel EditorPanel Editor里面校正里面校正ladderladder阳性对照和阴性对照阳性对照和阴性对照 ：All Color Browser n n峰图：其中峰顶右边显示的小数表示的是杂合不平衡的比例。（两个峰图高度的比值，最
14、好采用面积的比值）（两个峰图高度的比值，最好采用面积的比值）后面还有标注的后面还有标注的3X3X是指的放大的比例。是指的放大的比例。正常的等位基因其名称为绿框灰底；对于普通样正常的等位基因其名称为绿框灰底；对于普通样本，可疑的等位基因是黄底，失败的等位基因是本，可疑的等位基因是黄底，失败的等位基因是红底红底 。编辑等位基因编辑等位基因输出CODIS 报告n nCODISCODIS：DNADNA联合索引系统联合索引系统Combined DNA Index Combined DNA Index SystemSystem是基于人类基因中是基于人类基因中1313个地点连续个地点连续DNADNA标记和标
15、记和人类基因谱。它被经常用于犯罪活动是罪恶的还人类基因谱。它被经常用于犯罪活动是罪恶的还是清白的。是清白的。n n联合检测联合检测1313个个 CODISCODIS核心基因座，无关个体的平核心基因座，无关个体的平均随机匹配率大于万亿分之一。均随机匹配率大于万亿分之一。n n Gene marker HIDGene marker HID分析了分析了1616个基因座信息，其中个基因座信息，其中包括已经规定的包括已经规定的1313个基因座，还包括一个性别基个基因座，还包括一个性别基因座，两个额外的基因座。因座，两个额外的基因座。n n将报告提交给实验室信息管理系统，即将报告提交给实验室信息管理系统，
16、即LIMSLIMS（Laboratory Laboratory InformationInformation Management Management SystemSystem）荧光定量信息：典型的单一样本与混合样本的典型的单一样本与混合样本的 STRSTR分型存在差异。分型存在差异。n n杂合子样本杂合子样本STRSTR分型图谱通常会出现分型图谱通常会出现“Stutter”Stutter”峰，其峰峰，其峰高或峰面积小于相应峰的高或峰面积小于相应峰的15%15%。另外，单一个体的分型图。另外，单一个体的分型图谱中，也就是较低峰的相对荧光单位（谱中，也就是较低峰的相对荧光单位（RFURFU）除
17、以较高峰）除以较高峰的（的（RFURFU）得到的数值，应该大于）得到的数值，应该大于70%70%。因此，如果在某一。因此，如果在某一STRSTR基因座与最高峰的峰高比值在基因座与最高峰的峰高比值在15%15%到到70%70%之间时，提示之间时，提示样本可能是来自两个或多个个体的混合样本。样本可能是来自两个或多个个体的混合样本。n n“Stutter”Stutter”峰峰:仔细观察仔细观察STRSTR电泳图谱，通常会发现一些电泳图谱，通常会发现一些比每个等位基金峰少几个碱基的小峰，这些比每个等位基金峰少几个碱基的小峰，这些StutterStutter产物产物是在用是在用DNADNA聚合酶对聚合酶
18、对STRSTR基因座进行基因座进行PCRPCR扩增的过程中产生扩增的过程中产生的。的。StutterStutter产物又被称作影子带，或者产物又被称作影子带，或者DNADNA聚合酶滑脱产聚合酶滑脱产物。物。n n混合样本的判别：混合样本的判别：n n基因座下面出现等位基因的数目为基因座下面出现等位基因的数目为3 3，4 24 2个个体的混合样本个个体的混合样本n n基因座下面出现等位基因的数目为基因座下面出现等位基因的数目为5 5，6 36 3个个体的混合样本个个体的混合样本n n基因座下面出现等位基因的数目大于基因座下面出现等位基因的数目大于6 36 3个及个及3 3个以上个体的混合样本个以
19、上个体的混合样本Gene mapper ID n nGene mapper IDGene mapper ID它拥有它拥有Gene Scan Gene Scan 与与GenetyperGenetyper分析数据分析数据 的能力。的能力。n nGeneScan GeneScan 软件根据内标分析计算软件根据内标分析计算DNADNA片段的大小片段的大小（碱基值），（碱基值），n n然后利用然后利用GenotyperGenotyper软件将样品和软件将样品和Allelic LadderAllelic Ladder比较，确定各位点分型的值。比较，确定各位点分型的值。使用 Gene mapper ID的操作步骤：将panels和bins 输入到Panel Manager中选择试剂盒模板将提供的panels.txt 和bins.txt两个文件复制到panels文件夹中;启动Tools菜单下的Panel Manager定义Size standard定义Analysis Method数据分析分型