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1、分解纤维素的微生物的分离纤维素与纤维素酶1.1.纤维素纤维素 纤维素纤维素是一种由是一种由葡萄糖葡萄糖首尾相连而成的首尾相连而成的高高分子分子化合物，是含量最丰富的化合物，是含量最丰富的多糖多糖类物质。类物质。植物植物的根、茎、叶等器官都含有大量的纤的根、茎、叶等器官都含有大量的纤维素。其中棉花是自然界中纤维素含量最高维素。其中棉花是自然界中纤维素含量最高的天然产物的天然产物。一、基础知识一、基础知识 土壤中某些微生物能够产生纤维素酶土壤中某些微生物能够产生纤维素酶,把把纤维素分解为葡萄糖，后再利用。纤维素分解为葡萄糖，后再利用。2.2.纤维素纤维素酶酶 纤维素酶是一种纤维素酶是一种复合酶复合
2、酶，一般认为它，一般认为它至少至少包括三种组分包括三种组分，即，即C C1 1酶酶(外切酶外切酶)、C CX X酶酶(内切酶内切酶)和葡萄糖苷酶和葡萄糖苷酶，前两种酶使纤维素分解成纤维，前两种酶使纤维素分解成纤维二糖，第三种酶将纤维二糖分解成葡萄糖。二糖，第三种酶将纤维二糖分解成葡萄糖。纤维二糖纤维二糖C C1 1酶、酶、CxCx酶酶葡萄糖苷酶葡萄糖苷酶葡萄糖葡萄糖纤维素纤维素刚果红染色法:刚果红能与纤维素形成红色复合物刚果红能与纤维素形成红色复合物，而不与，而不与水解后的纤维二糖和葡萄糖发生这种反应。水解后的纤维二糖和葡萄糖发生这种反应。（二）纤维素分解菌的筛选 当我们在含有纤维素的培养基中
3、加入刚果红当我们在含有纤维素的培养基中加入刚果红时，刚果红能与培养基中的纤维素形成时，刚果红能与培养基中的纤维素形成红色复红色复合物合物。当纤维素被纤维素酶分解后，刚果红。当纤维素被纤维素酶分解后，刚果红-纤纤维素的复合物就无法形成，培养基中就会出现维素的复合物就无法形成，培养基中就会出现以纤维素分解菌为中心的透明圈以纤维素分解菌为中心的透明圈，这样我们就，这样我们就可以通过是否产生透明圈来筛选纤维素分解菌。可以通过是否产生透明圈来筛选纤维素分解菌。请你根据实验流程图和提供的三个资料以及请你根据实验流程图和提供的三个资料以及“操作提操作提示示”，在思考有关问题的基础上，设计出一个详细的实，在思
4、考有关问题的基础上，设计出一个详细的实验方案。验方案。土壤取样选择培养梯度稀释 将样品涂布在鉴别纤 维素分解菌的培养基上 筛选产生透 明圈的菌落二、实验设计二、实验设计分布环境分布环境富含纤维素的环境中富含纤维素的环境中 生物与环境的互相依存关系，在富含纤维素生物与环境的互相依存关系，在富含纤维素的环境中纤维素分解菌的含量相对提高，因此从的环境中纤维素分解菌的含量相对提高，因此从这种土壤中获得目的微生物的几率要高于普通环这种土壤中获得目的微生物的几率要高于普通环境。境。原因原因1、土壤取样实例：树林中多年落叶形成的腐殖土，多年积实例：树林中多年落叶形成的腐殖土，多年积累的枯枝败叶等。累的枯枝败
5、叶等。讨论讨论:如果找不到合适的环境，可以将滤纸埋如果找不到合适的环境，可以将滤纸埋在土壤中，将滤纸埋在土壤中有什么作用？你认在土壤中，将滤纸埋在土壤中有什么作用？你认为滤纸应该埋在土壤中多深？为滤纸应该埋在土壤中多深？将滤纸埋在土壤中能使纤维素分解菌相对将滤纸埋在土壤中能使纤维素分解菌相对集中，实际上是人工设置纤维素分解菌生存的集中，实际上是人工设置纤维素分解菌生存的适宜环境。一般应将滤纸埋于深约适宜环境。一般应将滤纸埋于深约10cm10cm左右的左右的土壤中。土壤中。增加纤维素分解菌的浓度增加纤维素分解菌的浓度，以确保能够从，以确保能够从样品中分离所需要的微生物。样品中分离所需要的微生物。
6、目的：目的：制备选择培养基：制备选择培养基：2、选择培养培养基成分分析培养基成分分析培养基组成培养基组成提供主要的营养物质提供主要的营养物质纤维素粉纤维素粉 5g碳源（能源）碳源（能源）NaNO3 1g氮源、无机盐氮源、无机盐KCl 0.5g Na2HPO47H2O 1.2gKH2PO4 0.9g MgSO4 7H2O 0.5g无机盐无机盐酵母膏酵母膏 0.5g生长因子、碳源、氮源生长因子、碳源、氮源水解酵素水解酵素 0.5g氮素、生长因子氮素、生长因子溶解后，蒸馏水定容至溶解后，蒸馏水定容至1000mL水水提示：自变量为培养基的种类，即普通培养基和选择提示：自变量为培养基的种类，即普通培养基
7、和选择培养基。可用牛肉膏蛋白胨培养基与之对照培养基。可用牛肉膏蛋白胨培养基与之对照,或者将纤或者将纤维素改为葡萄糖。维素改为葡萄糖。A A A A、旁栏中的配方是液体培养基还是固体培养基？为什么？、旁栏中的配方是液体培养基还是固体培养基？为什么？、旁栏中的配方是液体培养基还是固体培养基？为什么？、旁栏中的配方是液体培养基还是固体培养基？为什么？是液体培养基，原因是配方中无凝固剂（琼脂）是液体培养基，原因是配方中无凝固剂（琼脂）是液体培养基，原因是配方中无凝固剂（琼脂）是液体培养基，原因是配方中无凝固剂（琼脂）B B B B、这个培养基对微生物是否具有选择作用？如果具有，、这个培养基对微生物是否
8、具有选择作用？如果具有，、这个培养基对微生物是否具有选择作用？如果具有，、这个培养基对微生物是否具有选择作用？如果具有，是如何进行选择的？是如何进行选择的？是如何进行选择的？是如何进行选择的？有选择作用，本配方中纤维素作为主要碳源，只有能有选择作用，本配方中纤维素作为主要碳源，只有能分解纤维素的微生物可以大量繁殖。分解纤维素的微生物可以大量繁殖。C C C C、你能否设计一个对照实验，说明选择培养基的作用、你能否设计一个对照实验，说明选择培养基的作用、你能否设计一个对照实验，说明选择培养基的作用、你能否设计一个对照实验，说明选择培养基的作用 说明：说明：分析分析“纤维素分解菌的选择培养基纤维素
9、分解菌的选择培养基配方配方”可知，该配方中的酵母膏也能够提供少可知，该配方中的酵母膏也能够提供少量的碳源，因此其他微生物也能在该培养基中量的碳源，因此其他微生物也能在该培养基中生长繁殖。只不过，由于酵母膏的含量极少，生长繁殖。只不过，由于酵母膏的含量极少，因此，只有以纤维素为碳源的微生物才能大量因此，只有以纤维素为碳源的微生物才能大量繁殖。繁殖。操作：操作：将土样加入装有将土样加入装有30ml选择培养基的锥形瓶选择培养基的锥形瓶中，将锥形瓶固定在摇床上，在一定温度下震中，将锥形瓶固定在摇床上，在一定温度下震荡培养荡培养12天，直至培养液变浑浊。也可重复天，直至培养液变浑浊。也可重复选择培养。选
10、择培养。在选择培养的条件下，可以使那些能够在选择培养的条件下，可以使那些能够适适应应这种营养条件的微生物得到这种营养条件的微生物得到迅速繁殖迅速繁殖，而那，而那些些不适应不适应这种营养条件的微生物的繁殖被这种营养条件的微生物的繁殖被抑制抑制，因此可以起到因此可以起到“浓缩浓缩”的作用。的作用。为什么选择培养能够为什么选择培养能够“浓缩浓缩”所需的微生物？所需的微生物？比较项目比较项目分解尿素的细菌分解尿素的细菌纤维素分解菌纤维素分解菌选选择择培培养养基基原理原理培养基培养基类型类型目的目的鉴鉴定定培培养养基基原理原理现象现象方法方法将细菌涂布在以尿素为唯一氮源的选择培养基上将细菌涂布在以纤维素
11、粉为主要碳源的选择培养基上固体培养基液体培养基筛选菌株选择培养按照课题按照课题1 1的稀释操作方法，将选择培养后的稀释操作方法，将选择培养后的培养基进行等比稀释的培养基进行等比稀释10101 110106 6倍。倍。1011021031041051063、梯度稀释4.将样品涂布到鉴别纤维素分解菌的培养基上（1 1）制备鉴别培养基）制备鉴别培养基:（2 2）涂布平板：）涂布平板：将稀释后的菌悬液各取将稀释后的菌悬液各取0.1ml0.1ml涂布到平板涂布到平板培养基上，倒置培养。培养基上，倒置培养。培养基组成培养基组成提供的主要营养物质提供的主要营养物质CMC-Na 510g碳源碳源酵母膏酵母膏
12、1g碳源、氮源、生长因子碳源、氮源、生长因子KH2PO4 0.25g无机盐无机盐土豆汁土豆汁 100mL碳源、生长因子碳源、生长因子琼脂琼脂 15g凝固剂凝固剂上述物质溶解后，加蒸馏上述物质溶解后，加蒸馏水定容至水定容至1000mL水水鉴别鉴别纤维素分解菌的培养基纤维素分解菌的培养基(水溶性羧甲基纤维素钠水溶性羧甲基纤维素钠)方法一：先方法一：先 ，再加入刚果红进，再加入刚果红进行颜色反应。行颜色反应。方法二：在方法二：在 时就加入刚果红。时就加入刚果红。培养微生物培养微生物倒平板倒平板5.刚果红染色法 挑选产生透明圈的菌落，一般即为分解挑选产生透明圈的菌落，一般即为分解纤维素的菌落。纤维素的
13、菌落。这两种方法各有哪些优点与不足？这两种方法各有哪些优点与不足？染色法染色法染色法染色法优点优点优点优点缺点缺点缺点缺点方法一方法一方法一方法一方法二方法二方法二方法二颜色反应基本颜色反应基本上是纤维素分上是纤维素分解菌的作用解菌的作用操作繁琐操作繁琐刚果红会使菌落之间发生刚果红会使菌落之间发生混杂混杂操作简便不操作简便不存在菌落混存在菌落混杂问题杂问题1.1.产生淀粉酶的微生物也产生淀粉酶的微生物也产生模糊透明圈产生模糊透明圈2.2.有些微生物能降解色素，有些微生物能降解色素，形成明显的透明圈。形成明显的透明圈。方法一中方法一中NaCl溶液的作用？溶液的作用？思考：思考：漂洗作用，洗去与纤
14、维素结合不牢的刚洗去与纤维素结合不牢的刚果红，以免出现的透明圈不够清晰果红，以免出现的透明圈不够清晰。实际上刚。实际上刚果红是结合到培养基的多糖底物，但分解纤维素的果红是结合到培养基的多糖底物，但分解纤维素的细菌可以产生纤维素酶，能分解这个多糖底物成为细菌可以产生纤维素酶，能分解这个多糖底物成为单糖，这样刚果红就不能结合上去了，氯化钠溶液单糖，这样刚果红就不能结合上去了，氯化钠溶液就可以使结合不牢的刚果红洗去，这样就留下大大就可以使结合不牢的刚果红洗去，这样就留下大大小小的透明圈，大的透明圈当然分解纤维素的能就小小的透明圈，大的透明圈当然分解纤维素的能就强！强！在在产生明显的透明圈产生明显的透
15、明圈的菌落，挑取的菌落，挑取并接种到纤维素分解菌的选择培养基上，并接种到纤维素分解菌的选择培养基上，在在30300 0C C 37370 0C C培养，可获得培养，可获得纯化培养纯化培养。6、纯化培养 1.培养基的制作是否合格以及选择培养基是否筛选出菌落 对照的培养基在培养过程中没有菌落生长则说明培养基制作合格。如果观察到产生透明圈的菌落，则说明可能获得了分解纤维素的微生物。2.分离的结果是否一致 由于在土壤中细菌的数量远远高于真菌和放线菌的数量，因此最容易分离得到的是细菌。但由于所取土样的环境不同，不同同学也可能得到真菌和放线菌等不同的分离结果。三、结果分析与评价三、结果分析与评价 为了确定
16、分离得到的是纤维素分解菌，还需要进行为了确定分离得到的是纤维素分解菌，还需要进行_ _ _ _ 实验，纤维素酶的发酵方法有实验，纤维素酶的发酵方法有_ _ 发发酵和酵和_ _ 发酵。纤维素酶测定方法是对纤维素酶分解滤纸发酵。纤维素酶测定方法是对纤维素酶分解滤纸等纤维素所产生的等纤维素所产生的_ _ 含量进行定量测定。含量进行定量测定。发酵产纤维素酶发酵产纤维素酶 液体液体 固体固体 葡萄糖葡萄糖 四、课题延伸四、课题延伸分解分解纤维纤维素的素的微生微生物的物的分离分离纤维素酶纤维素酶种类、作用、催化活力种类、作用、催化活力刚果红染色刚果红染色筛选原理筛选原理实实验验设设计计土壤取样土壤取样选择
17、培养选择培养纯化培养纯化培养梯度稀释涂布平板梯度稀释涂布平板前置染色法前置染色法后置染色法后置染色法富含纤维素土壤富含纤维素土壤增大分解菌含量增大分解菌含量染色鉴别染色鉴别分离出分解菌分离出分解菌课堂总结课堂总结 1 1、在富含纤维素的环境中寻找纤维素分解菌，符合下列、在富含纤维素的环境中寻找纤维素分解菌，符合下列哪一生物学观点？（哪一生物学观点？（）A A、生物结构与功能相适应的观点、生物结构与功能相适应的观点 B B、生物结构与功能整体性观点、生物结构与功能整体性观点 C C、生物与环境相适应的观点、生物与环境相适应的观点 D D、生物发展进化的观点、生物发展进化的观点2 2、从土壤中分离获得纤维素分解菌的步骤是（从土壤中分离获得纤维素分解菌的步骤是（）土壤取样土壤取样 梯度稀释梯度稀释 选择培养选择培养 菌悬菌悬液涂布平板液涂布平板 挑选出单个菌落挑选出单个菌落 A A、B B、C C、D D、CB练一练练一练