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1、临床生物化学检验常用技术临床生物化学检验常用技术第第3章章1 本本 章章 主主 要要 内内 容容光谱光谱检验技术检验技术电化学分析技术电化学分析技术电泳技术电泳技术干化学技术干化学技术PCR技术技术 2教学目教学目标标和要求和要求 掌掌握握光光谱谱分分析析中中的的对对比比法法、摩摩尔尔吸吸收收系系数数法法、比比浊浊法法测测定定的的方方法法原原理理，在在生生化化检检验验中中的的应应用用及及注注意意事事项项；区区带带电电泳泳的的原原理理、应应用用及及影影响响因因素素；离离子子选选择择性性电电极极法法测测定定的的原原理理和和注注意意事事项项。熟熟悉悉离离心心技技术术，其其它它电电泳泳技技术术和和层层
2、析析技技术术中中的的HPLCHPLC及及亲亲和和层层析析的的原原理理和和应应用用；免免疫疫分分析析技技术术、生物、生物传传感技感技术术的概念和的概念和应应用原理。用原理。了了解解色色谱谱、层层析析等等常常用用生生化化技技术术的的应应用用原原理和方法，生物芯片技理和方法，生物芯片技术术的概念和的概念和应应用原理。用原理。3第一节第一节 光谱分析技术光谱分析技术n分光光度技术的基本原理分光光度技术的基本原理n分光光度计的基本结构分光光度计的基本结构n分光光度计的操作方法分光光度计的操作方法 n分光光度技术的定性和定量方法分光光度技术的定性和定量方法 4v光的本性光的描述：波长和能量可见光：400n
3、m760nm紫外光:200 nm400nm红外光:760nm1000nm5n光谱分析技术原理：光谱分析技术原理：利用各种化学物质都具有发射、吸收或散射光谱谱系的特利用各种化学物质都具有发射、吸收或散射光谱谱系的特征，以此来确定物质性质、结构或含量。征，以此来确定物质性质、结构或含量。n光谱分析技术分类光谱分析技术分类：发射光谱分析技术：发射光谱分析技术：火焰光度法、原子发射光谱法和荧光光谱法火焰光度法、原子发射光谱法和荧光光谱法 吸收光谱分析技术：吸收光谱分析技术：紫外、可见光分光光度法，原子吸收分光光紫外、可见光分光光度法，原子吸收分光光 度法和红外光谱法度法和红外光谱法 散射光谱分析技术：
4、散射光谱分析技术：比浊法比浊法 6一、分光光度技术的基本原理一、分光光度技术的基本原理（一）吸光度与透光度（一）吸光度与透光度 A=-A=-lgTlgT=-lgI/I=-lgI/I0 0=lgI=lgI0 0/I/I 当光线通过均匀、透明的溶液时可出现三种情况：一部分当光线通过均匀、透明的溶液时可出现三种情况：一部分光被散射，一部份光被吸收，另有一部分光透过溶液。设入射光被散射，一部份光被吸收，另有一部分光透过溶液。设入射光强度为光强度为I0I0，透射光强度为，透射光强度为I I，I I和和I I0 0之比称为透光度之比称为透光度，即：即：T=I/IT=I/I0 0 T100T100为为T%T
5、%称为百分透光度。透光度的负对数称为吸光度称为百分透光度。透光度的负对数称为吸光度即：即：7（二）（二）Lambert-BeerLambert-Beer定律定律 Lambert-BeerLambert-Beer定律是讨论溶液吸光度同溶液浓度和溶液层定律是讨论溶液吸光度同溶液浓度和溶液层厚度之间关系的基本定律，该定律是分光分析的理论基础。其厚度之间关系的基本定律，该定律是分光分析的理论基础。其表达式为：表达式为：A=KLC 式中式中A A为吸光度；为吸光度；K K为比例常数，称为吸光系数；为比例常数，称为吸光系数；L L为溶液为溶液层厚度，称为光径；层厚度，称为光径；C C为溶液浓度为溶液浓度
6、（Lambert-BeerLambert-Beer定律适用于可见光、紫外光、红外光和均匀非散射的液体。）定律适用于可见光、紫外光、红外光和均匀非散射的液体。）8吸收曲线（曲线）1.0 0.8 0.6 0.4 0.2Y=ax+b9吸光系数的应用v、定性、定性v、判断方法的灵敏度、判断方法的灵敏度v、定量测定物质浓度、定量测定物质浓度10偏离朗伯比耳定律的因素偏离朗伯比耳定律的因素?v1 1、光学因素、光学因素v2 2、化学因素、化学因素v3 3、为什么有的分光光度计使用双波长或双、为什么有的分光光度计使用双波长或双光束？光束？11分光光度法的结构分光光度法的结构光源及光源要求光源及光源要求v波长
7、的选择原则波长的选择原则:可按可按“吸收最大，吸收最大，干扰最小干扰最小”的原则进行。的原则进行。v2、单色器、单色器v3、比色杯及要求、比色杯及要求v4、检测器与显示器、检测器与显示器12分光光度计的使用1、开启电源，将比色池盖打开，通电、开启电源，将比色池盖打开，通电20分钟预分钟预热热2、调节波长、调节波长3、将空白液、标准液及样品液置于光路、将空白液、标准液及样品液置于光路4、空白调节、空白调节T为为0、100%5、调、调A为为06、重复、重复4和和57、测量标准和样品吸光度。、测量标准和样品吸光度。13（二）吸光度的校正（二）吸光度的校正 铬酸钾的标准液可用于校正分光光度计的吸铬酸钾
8、的标准液可用于校正分光光度计的吸光度。在光度。在25，将，将4mg铬酸钾溶于铬酸钾溶于100ml的的0.05mol/L KOH中，放入比色池中，在不同波长中，放入比色池中，在不同波长下测定吸光度值，与己知的标准吸光度校正表进下测定吸光度值，与己知的标准吸光度校正表进行比较，可检测仪器吸光度的准确度行比较，可检测仪器吸光度的准确度。14四、分光光度技术的定性和定量方法四、分光光度技术的定性和定量方法（一）分光光度技术的定性方法（一）分光光度技术的定性方法u定性依据定性依据：最大吸收波长最大吸收波长maxmax和摩尔吸光系数和摩尔吸光系数 2.2.摩尔消光系数摩尔消光系数方法方法1.1.最大吸收波
9、长最大吸收波长maxmax方法方法15（二）分光光度技术的定量方法（二）分光光度技术的定量方法v1、对比法1、将已知浓度的标准品和待测溶液有同一方法、在相同条件下同时进行测定。2、当标准液与标本用量可能不同时的测定。标准液的要求：其浓度尽量接近于样品浓度。（双标准）16（二）分光光度技术的定量方法（二）分光光度技术的定量方法v2.标准曲线法标准曲线法 用途：用途：1、确定分析范围、确定分析范围2、减少系统误差、减少系统误差3、比较方法的灵敏度、比较方法的灵敏度17 根据根据Lambert-BeerLambert-Beer定律，液体的浓度在一定范定律，液体的浓度在一定范围内与吸光度成正比关系。配
10、制一系列浓度的标准围内与吸光度成正比关系。配制一系列浓度的标准品溶液（浓度应包含高、中、低浓度范围），按标品溶液（浓度应包含高、中、低浓度范围），按标本处理方法作相同处理，在特定波长下测定吸光度，本处理方法作相同处理，在特定波长下测定吸光度，以标准液浓度为横座标，以吸光度为纵座标以标准液浓度为横座标，以吸光度为纵座标，将对，将对应各点连成一条通过原点的直线，这条直线称为标应各点连成一条通过原点的直线，这条直线称为标准曲线。待测溶液测定吸光度后，从标准曲线上可准曲线。待测溶液测定吸光度后，从标准曲线上可查出其相应的浓度。查出其相应的浓度。u方法方法：18作图法的步骤v1、制备标准液v2、显色反应
11、v3、比色v4、作图v5、制作检量表。19将一系列浓度不同的标准溶液按照、将一系列浓度不同的标准溶液按照、一定操作过程显色后，一定操作过程显色后，分别测吸光度，以吸光度为纵坐标，分别测吸光度，以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标绘制标准曲线。浓度为横坐标绘制标准曲线。从标准曲线找出相对应的待测样品的浓度，从标准曲线找出相对应的待测样品的浓度，即标准曲线法。即标准曲线法。标准曲标准曲线法线法20u制作和应用标准曲线时应注意下面几点：制作和应用标准曲线时应注意下面几点：（1 1）浓度范围足够大）浓度范围足够大（2 2）减少偶然误差）减少偶然误差（3 3）当待测液吸光度超过线性范围时，应将标本稀释后再测定
12、。）当待测液吸光度超过线性范围时，应将标本稀释后再测定。（4 4）标本测定的条件应和标准曲线制作时的条件完全一致。）标本测定的条件应和标准曲线制作时的条件完全一致。（5 5）测定条件发生变化时（如更换标准品和试剂等），应重新绘测定条件发生变化时（如更换标准品和试剂等），应重新绘制。制。（6）标准品应有高的纯度，标准液的配制应准确）标准品应有高的纯度，标准液的配制应准确。21第二节电化学分析技术第二节电化学分析技术 电化学法概述电化学法概述电化学分析电化学分析：利用物质的电化学性质，测定化学电池的电位、电流或电量的变化进行分析的方法。主要有：电位法、电导法、电容法。22电位分析法基本原理电位分析
13、法基本原理v电位分析法是利用电极电位和浓度之间关系来确定物质含量的分析方法。电极电位由能斯特方程式确立。电极电位测定是通过构建原电池电动势，其中一个电极的电位随待测离子尝浓度改变而改变（指示电极）；另一电极电位不受试液影响（参比电极），通过测定原电池的电动势便可求得待测离子浓度。23vNernst方程。其方程式为：R为气体常数、T为绝对温度、n为离子电荷数、F为法拉第常数a为被测离子活度24一、离子选择电极法的原理一、离子选择电极法的原理v离子选择电极分析法（离子选择电极分析法（ion selective electrode，ISE）是利用电极电位和离子活度的关系来测是利用电极电位和离子活度的
14、关系来测定被测离子活度的一种电化学分析法。定被测离子活度的一种电化学分析法。ISE法的法的核心是指示电极上带有对被测离子选择性响应的核心是指示电极上带有对被测离子选择性响应的敏感膜，膜的一面与被测离子的溶液相接触、另敏感膜，膜的一面与被测离子的溶液相接触、另一面则与电极内所充的一定活度的被测离子溶液一面则与电极内所充的一定活度的被测离子溶液和内参比电极接触，膜内外的离子活度的差异引和内参比电极接触，膜内外的离子活度的差异引起离子从高浓度向低浓度迁移，从而产生电位改起离子从高浓度向低浓度迁移，从而产生电位改变，其数值可在等电流的条件下测定。变，其数值可在等电流的条件下测定。25离子选择性电极结构
15、离子选择性电极结构2627ISE的特点的特点v选择性好选择性好:多数情况下共存离子的干扰小，多数情况下共存离子的干扰小，组成复杂的试样往往不需分离处理即可直组成复杂的试样往往不需分离处理即可直接测定；接测定；v灵敏度高：灵敏度高：可达可达10-510-8mmol/L,v 线性范围宽线性范围宽，Na+为为10-610-1mmol/L，K+为为3 10-51mol/L，氯为，氯为5 10-51mol/L，Ca+为为3 10-51mol/L；v溶血、脂血及黄疸不影响测定，对有色、溶血、脂血及黄疸不影响测定，对有色、浑浊溶液都可进行分析；浑浊溶液都可进行分析；v设备简单，分析速度快，易于自动化，设备简
16、单，分析速度快，易于自动化，标本用量少，应用范围广。标本用量少，应用范围广。28v离子选择电极分析方法离子选择电极分析方法1、标准曲线法、标准曲线法2、标准比较法、标准比较法3、标准加入法（消除基质效应）、标准加入法（消除基质效应）样品测定方式：样品测定方式：直接法与间接法直接法与间接法29三、离子选择性电极法测定的影响因素三、离子选择性电极法测定的影响因素v1 1离子强度离子强度v2 2、温度、温度v3 3、PHPH值值v4 4、共存离子的干扰、共存离子的干扰30Attention!v电解质分析仪一般要求电解质分析仪一般要求24小时开机小时开机，目的是为了保持电极膜很好的水化，增加电极的稳定
17、性。经常关仪器，使得电极膜干燥，会加速电极膜的失效和产生测定中的漂移。v仪器正常启动后，清洗管道，进行两点校进行两点校准，每隔准，每隔2小时自动单点校准。小时自动单点校准。v每天用后进行电极保养，去除附在电极膜上的蛋白质。31第三节第三节 干化学分析技术干化学分析技术 一、干化学分析原理一、干化学分析原理 1、反射光度法Kubelka-Munk理论：光反射率与固相层的厚度、单位厚度的光吸收系数以及固相反应层的散射系数有关系，当固相层的厚度和固相反应层的散射系数固定时，光吸收系数与待测物的浓度成正比。32干化学的原理（1）试剂结构SampleSample反射层清除剂层支持层 样本扩散层试剂层试剂
18、层33二、分析原理二、分析原理（一）分析过程（一）分析过程 1 1样本扩散层样本扩散层待测样品定量加到干片待测样品定量加到干片试剂，由展开层把样品均匀展开，并且试剂，由展开层把样品均匀展开，并且阻挡固体物质如红细胞和大分子物质进阻挡固体物质如红细胞和大分子物质进入试剂层。入试剂层。2 2、反射层反射层 光漫射层，为光检测提供一光漫射层，为光检测提供一个具有反射的背景。个具有反射的背景。3 3、清除剂层：清除血清中内源性干扰物、清除剂层：清除血清中内源性干扰物344 4试剂层试剂层样品中的水分成为干式试剂样品中的水分成为干式试剂的溶剂，试剂与待测物质进行化学反应。的溶剂，试剂与待测物质进行化学反
19、应。试剂层的结构还能控制多步化学反应的反试剂层的结构还能控制多步化学反应的反应次序。应次序。支持层支持层为一透明胶片，仅起支撑试剂干片为一透明胶片，仅起支撑试剂干片的作用。的作用。35干化学的原理（3）比色样本扩散层样本扩散层反射层反射层清除剂层清除剂层支持层支持层 接收器接收器36干化学分析技术的影响因素干化学分析技术的影响因素v仪器监测仪器监测：标准灰色试剂条：标准灰色试剂条/校准条校准条v校准频度校准频度：每：每6个月校准一次，质控经常做个月校准一次，质控经常做v质控物质控物：用干化学分析仪生产厂家提供：用干化学分析仪生产厂家提供v干片试剂的储存与使用：干片试剂的储存与使用：0保存，平衡
20、后用保存，平衡后用v工作环境与温度：工作环境与温度：1530，湿度，湿度85%37第四节第四节 电泳分析技术电泳分析技术38一、电泳技术的原理及其影响因素一、电泳技术的原理及其影响因素v1 原理原理：带电粒子在电场中的移动现象：带电粒子在电场中的移动现象称为称为电泳电泳(Electrophoresis)。带负电荷的。带负电荷的粒子向电场的正极移动；带正电荷的粒子粒子向电场的正极移动；带正电荷的粒子则向负极移动。各种物质由于所带净电荷则向负极移动。各种物质由于所带净电荷的种类和数量不同，因而在电场中的迁移的种类和数量不同，因而在电场中的迁移方向和速度不同。利用物质的这种性质可方向和速度不同。利用
21、物质的这种性质可以对物质进行以对物质进行分离和鉴定分离和鉴定。392 影响颗粒电泳迁移率的因素影响颗粒电泳迁移率的因素电泳迁移率？电泳迁移率？1、分子形状、分子形状 体积大者慢，小者快体积大者慢，小者快2、EvQEV扩散明显、区带模糊、分辨率下降40v3、缓冲液缓冲液（1）缓冲溶质）缓冲溶质 性质稳定，缓冲容量大、电导低、离子移性质稳定，缓冲容量大、电导低、离子移动好动好（2）pH 影响分子电荷性质和电量影响分子电荷性质和电量 (3)离子强度（离子强度（I）影响缓冲容量、速度和产热效应影响缓冲容量、速度和产热效应 I、pH稳定、速度慢、产热多、时间延长、扩散稳定、速度慢、产热多、时间延长、扩散
22、 I、pH不稳定、速度快、产热少；区带不整齐、分辨率不稳定、速度快、产热少；区带不整齐、分辨率 下降下降 414、支持介质、支持介质 吸附作用：吸附作用：支持介质对标本的吸附作用支持介质对标本的吸附作用 吸附吸附作用使电泳速度减慢，出现拖尾现象。作用使电泳速度减慢，出现拖尾现象。电渗：电渗：电场中液对固相的相对移动电场中液对固相的相对移动 电渗只影响电泳速度，不影响分辨率电渗只影响电泳速度，不影响分辨率42v蒸发：蒸发：支持介质水份的蒸发导致缓冲支持介质水份的蒸发导致缓冲液浓缩，离子强度增加，标本分电流液浓缩，离子强度增加，标本分电流减少，电泳速度减慢；虹吸作用，使减少，电泳速度减慢；虹吸作用
23、，使标本区带向中间集中并弯曲，导致分标本区带向中间集中并弯曲，导致分辨率下降。辨率下降。（所以，电泳时电泳槽要（所以，电泳时电泳槽要密闭）密闭）43二、电泳类型及应用二、电泳类型及应用v电泳的分类方法很多，在这里电电泳的分类方法很多，在这里电泳原理将泳原理将电泳分离系统电泳分离系统分为分为v1、移动界面电泳、移动界面电泳v2、区带电泳、区带电泳v3、稳态电泳、稳态电泳44（一）（一）.醋酸纤维素薄膜电泳醋酸纤维素薄膜电泳（cellulose acetate electrophoresis）v醋酸纤维素是将纤维素的羟基乙酰化而形成的纤醋酸纤维素是将纤维素的羟基乙酰化而形成的纤维素醋酸酯，由它制成
24、的薄膜称为醋酸纤维素薄维素醋酸酯，由它制成的薄膜称为醋酸纤维素薄膜。膜。v它具有分辨力好，它具有分辨力好，对蛋白质对蛋白质吸附极少，吸附极少，拖尾现象拖尾现象轻微；轻微；不吸附染料，不吸附染料，对区带周围的染料能完全洗对区带周围的染料能完全洗去，不干扰测定；样品需要量少、介质又可以透去，不干扰测定；样品需要量少、介质又可以透明后定量扫描等优点。明后定量扫描等优点。v临床生物化学上分离血清蛋白、糖蛋白、脂蛋白、临床生物化学上分离血清蛋白、糖蛋白、脂蛋白、血红蛋白、甲胎蛋白及同工酶等大分子物质。血红蛋白、甲胎蛋白及同工酶等大分子物质。45v缺点和注意事项：缺点和注意事项：吸水性差，水份易蒸发。吸水
25、性差，水份易蒸发。电泳槽要求密闭，维持水蒸气饱和电泳槽要求密闭，维持水蒸气饱和 电流强度不宜过大，电流强度不宜过大，0.40.6mA/cm宽。宽。46（三）（三）琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳v概述：概述：琼脂糖琼脂糖凝胶凝胶电泳是以琼脂糖凝电泳是以琼脂糖凝胶作为支持介质的一项电流技术。常胶作为支持介质的一项电流技术。常用于血浆脂蛋白、免疫球蛋白、同工用于血浆脂蛋白、免疫球蛋白、同工酶和酶和DNA酶切片断的电泳分离。酶切片断的电泳分离。47v琼脂糖凝胶电泳优点琼脂糖凝胶电泳优点 电渗作用小电渗作用小 吸附极微吸附极微 分辨率和重现性均较好分辨率和重现性均较好 适合分离大分子物质（分子筛效应）适合
26、分离大分子物质（分子筛效应）电泳图谱清晰便于扫描并可长期保存电泳图谱清晰便于扫描并可长期保存4849（二）（二）.聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳（polyacrylamide gel electrophoresis,PAGE）v聚丙烯酰胺凝胶是一种人工合成的凝聚丙烯酰胺凝胶是一种人工合成的凝胶，由胶，由丙烯酰胺单体丙烯酰胺单体和和交联剂交联剂甲叉双甲叉双丙烯酰胺在丙烯酰胺在催化剂催化剂和和加速剂加速剂的作用下的作用下聚合而成三维网状结构的凝胶。聚合而成三维网状结构的凝胶。50v常用的催化剂有过硫酸胺和核黄素，常用的催化剂有过硫酸胺和核黄素，加速剂一般用四甲基乙二胺。加速剂一般用四甲基乙二
27、胺。v凝胶网状结构凝胶网状结构孔径的大小孔径的大小，决定于，决定于丙丙烯酰胺单体的浓度烯酰胺单体的浓度和甲叉双丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺的浓度及的浓度及两者的比例。两者的比例。51PAGE的三种效应的三种效应v1、标本浓缩效应、标本浓缩效应v2、电荷效应、电荷效应v3、分子筛效应、分子筛效应52电泳区带的测定电泳区带的测定v方法分类：方法分类：v直接法：紫外光扫描区带，适用于直接法：紫外光扫描区带，适用于透明介质透明介质v染色法：染料染色后，洗脱背景可染色法：染料染色后，洗脱背景可见光扫描见光扫描53区带染色法区带染色法v蛋白质染料：蛋白质染料：丽春红、氨基黑丽春红、氨基黑10B、考马、考马斯亮
28、兰、溴酚兰、硝酸银。斯亮兰、溴酚兰、硝酸银。v同工酶的染料：同工酶的染料：常使用乳酸脱氢酶常使用乳酸脱氢酶（LDH）-辅酶（辅酶（NAD+）-酚嗪甲酯硫酸酚嗪甲酯硫酸盐（盐（PMS）-NBTv脂蛋白染料：脂蛋白染料：苏丹红、苏丹黑，油红苏丹红、苏丹黑，油红Ov核酸染料：核酸染料：溴乙啶溴乙啶54区带定量分析区带定量分析v1、光密度扫描法、光密度扫描法v2、洗脱比色法、洗脱比色法 特殊电泳技术特殊电泳技术自动电泳分析自动电泳分析55电泳的临床应用一、蛋白质电泳一、蛋白质电泳v血清蛋白电泳血清蛋白电泳v免疫固定电泳免疫固定电泳v脂蛋白电泳脂蛋白电泳v尿蛋白电泳尿蛋白电泳二、同工酶电泳分析二、同工酶
29、电泳分析565758第六节自动化分析技术59教学目标和要求教学目标和要求掌握掌握自动生化分析仪的分析方法类型及其自动生化分析仪的分析方法类型及其 特点，连续监测法的理论特点，连续监测法的理论K值，必选的分析参值，必选的分析参数，双波长测定的作用，双试剂的优点，分析数，双波长测定的作用，双试剂的优点，分析仪与手工法比较的优点和缺点。仪与手工法比较的优点和缺点。熟悉熟悉分立式自动生化分析仪的基本结构，备分立式自动生化分析仪的基本结构，备选的分析参数，测定过程的自动监测，校准方选的分析参数，测定过程的自动监测，校准方式和校准要求，影响分析仪分析速度的因素和式和校准要求，影响分析仪分析速度的因素和分析
30、仪性能指标。分析仪性能指标。了解了解某些分析参数的特殊意义，分析仪的工某些分析参数的特殊意义，分析仪的工作过程和操作方法，干片式分析仪的结构和分作过程和操作方法，干片式分析仪的结构和分析原理，常用分析仪的分析性能。析原理，常用分析仪的分析性能。60三、自动化分析与手工操作的比较三、自动化分析与手工操作的比较（一）（一）优点优点 1.1.检测速度快检测速度快 2.2.检测灵敏度高检测灵敏度高 3.3.检测准确度高检测准确度高 4.4.检测精密度高检测精密度高 5.5.样品和试剂用量减少样品和试剂用量减少 6.6.其他其他 :能精确地控制反应时间能精确地控制反应时间 ;能精确能精确 地控制反应温度
31、地控制反应温度 ;能进行复杂的结果计算。能进行复杂的结果计算。61（二）缺点（二）缺点 1.1.选择次波长较困难选择次波长较困难 2.2.操作时间受限操作时间受限 3.3.操作复杂性受限操作复杂性受限 :加试剂的次数受限制加试剂的次数受限制;无无法做复杂的操作法做复杂的操作;选择和改变反应温度困难选择和改变反应温度困难 4.4.样品量样品量/试剂量的比例受限制试剂量的比例受限制 5.5.不适宜做参考方法不适宜做参考方法 6.6.仪器维护和保养较复杂仪器维护和保养较复杂 62 自动生化分析仪自动生化分析仪由电脑控制，将生化由电脑控制，将生化分析中的取样分析中的取样(sampling)(sampl
32、ing)、加试剂、混匀、加试剂、混匀、保温反应、检测保温反应、检测(detect)(detect)、结果计算、可结果计算、可靠性判断、显示和打印、以及清洗靠性判断、显示和打印、以及清洗(cleaning)(cleaning)等步骤组合在一起自动进行操等步骤组合在一起自动进行操作的分析仪器。作的分析仪器。63第二节第二节 生化自动化分析方法生化自动化分析方法一、分析方法分类一、分析方法分类（一）（一）终点法终点法（end assay）被测物质在反应过程中完全被转变为产物，被测物质在反应过程中完全被转变为产物，到达反应终点，根据终点吸光度的大小求出被到达反应终点，根据终点吸光度的大小求出被测物浓度
33、，称为终点法测物浓度，称为终点法。该法称为平衡法更为该法称为平衡法更为恰当。从恰当。从时间时间-吸光度曲线吸光度曲线来看，到达反应终点来看，到达反应终点或平衡点时，吸光度将不再变化。终点法参数或平衡点时，吸光度将不再变化。终点法参数设置简单，反应时间一般较长，精密度较好。设置简单，反应时间一般较长，精密度较好。64终点时间的确定终点时间的确定根据时间根据时间-吸光度曲线来确定，吸光度曲线来确定，根据被测物反应终点，结合干扰物的反根据被测物反应终点，结合干扰物的反应情况来确定。应情况来确定。651一点法（终点法）一点法（终点法）在反应到达终点，即在时间在反应到达终点，即在时间-吸光度曲线上吸光度
34、曲线上吸光度不再改变时选择一个终点吸光度值，吸光度不再改变时选择一个终点吸光度值，用于计算结果。用于计算结果。结果计算公式：待测物浓度结果计算公式：待测物浓度C CU U=（待测吸光度待测吸光度A AU U试剂空白吸光度试剂空白吸光度A AB B）KKK K为校准系数为校准系数 适合蛋白、糖、胆固醇测定适合蛋白、糖、胆固醇测定66图4-3一点终点法反应曲线一点终点法反应曲线 A单试剂一点终点法 B双试剂一点终点法672两点法两点法（two point end assay）在反应过程中测定两个时间点的吸光度，在反应过程中测定两个时间点的吸光度，此两点吸光度之差用于计算结果。此两点吸光度之差用于计
35、算结果。计算公式为：计算公式为：C CU U=（待测吸光度待测吸光度A A2 2待测吸光度待测吸光度A A1 1）KK。68图图4-4两点终点法反应曲线两点终点法反应曲线 A单试剂两点终点法 B双试剂两点终点法 69 该法能有效地消除该法能有效地消除溶血溶血(hemolysishemolysis)、黄疸（黄疸（icterusicterus）和和脂浊（脂浊（lipolipo-turbidturbid）等样品本身等样品本身光吸收造成的干扰。光吸收造成的干扰。图图4-5 4-5 血红蛋白、胆红素和脂浊的血红蛋白、胆红素和脂浊的光吸收曲线光吸收曲线 70（二）二点速率法（二）二点速率法（fixed-t
36、ime assayfixed-time assay）指在反应过程中选择适当两点（此两点既指在反应过程中选择适当两点（此两点既非反应初始吸光度亦非终点吸光度）测定吸非反应初始吸光度亦非终点吸光度）测定吸光度，这两点的吸光度差值用于结果计算。光度，这两点的吸光度差值用于结果计算。计算公式计算公式 C CU U=(A=(A2 2-A-A1 1)K)K。71图图4-6两点速率法反应曲线两点速率法反应曲线 该分析方法有助于解决某些反应的非特异性问题。该分析方法有助于解决某些反应的非特异性问题。72（三）（三）速率速率A A法法（continuous monitoring assaycontinuous
37、monitoring assay）又称又称连续监测法连续监测法（rate assayrate assay），），是在测是在测定酶活性或用酶法测定代谢产物时，连续选定酶活性或用酶法测定代谢产物时，连续选取时间取时间-吸光度曲线中线性期（各两点间吸吸光度曲线中线性期（各两点间吸光度差值相等）的吸光度值，并以此线性期光度差值相等）的吸光度值，并以此线性期的单位吸光度变化值（的单位吸光度变化值（A/minA/min）计算结果。计算结果。73图图4-7连续监测法反应曲线连续监测法反应曲线 A单试剂连续监测法 B双试剂连续监测法 74酶促反应的线性段酶促反应的线性段 1 1及及5 5值偏小，而值偏小，而2
38、 23 34 4，故故A A1 1点至点至A A4 4点属线性段点属线性段 75连续监测法的优点连续监测法的优点 可以确定线性期并计算可以确定线性期并计算A/minA/min，根据此根据此值再准确地计算酶活性，因而使自动生化分值再准确地计算酶活性，因而使自动生化分析仪在酶活性测定方面显著地优于手工法。析仪在酶活性测定方面显著地优于手工法。连续监测法也可用于测定呈线性反应的代谢连续监测法也可用于测定呈线性反应的代谢物浓度，一般是某些基于酶法测定的代谢物。物浓度，一般是某些基于酶法测定的代谢物。酶活性（酶活性（U/LU/L）A/minA/min理论（或校准）理论（或校准）K K值。值。代谢物浓度代
39、谢物浓度C CU U=A/min=A/min校准校准K K值。值。761 1理论理论K K值值 多用于酶活性测定中，因酶活性尚无公多用于酶活性测定中，因酶活性尚无公认的校准品可用。根据酶活性的国际单位定认的校准品可用。根据酶活性的国际单位定义得出酶活性的计算公式为：义得出酶活性的计算公式为：酶活性酶活性 (U/L)=A/min(U/L)=A/min将此式中将此式中 以以K K来表示，即为来表示，即为理论理论K K值值 可作为分析参数输入到分析仪中。可作为分析参数输入到分析仪中。77采用理论采用理论K K值的前提值的前提 应当是样品和试剂的加量准确、比色杯应当是样品和试剂的加量准确、比色杯光径准
40、确、温度控制精确以及波长准确等。光径准确、温度控制精确以及波长准确等。但事实上由于各型分析仪在注射器容积步进但事实上由于各型分析仪在注射器容积步进电机精度、滤光片带宽等方面的差异，可造电机精度、滤光片带宽等方面的差异，可造成样品和试剂加量以及吸光度检测的偏差，成样品和试剂加量以及吸光度检测的偏差，温度的影响有时也非常大。温度的影响有时也非常大。78 由于由于摩尔吸光系数摩尔吸光系数受比色杯光径、波长受比色杯光径、波长等的影响，书本上或试剂厂家提供的理论摩等的影响，书本上或试剂厂家提供的理论摩尔吸光系数可能与实际所用分析仪所测的不尔吸光系数可能与实际所用分析仪所测的不同，因而有必要获得实际的摩尔
41、吸光系数，同，因而有必要获得实际的摩尔吸光系数，然后来计算理论然后来计算理论K K值。值。79（1）NADH（NADPH）摩尔吸光系数的测定摩尔吸光系数的测定 NADHNADH（NADPHNADPH）没有标准纯制品，而没有标准纯制品，而且配成溶液后稳定性又较差，不能直接用且配成溶液后稳定性又较差，不能直接用NADH NADH 或或NADPHNADPH标准液来校正仪器，须通过标准液来校正仪器，须通过有有NADNAD+(NADP(NADP+)参与的反应途径。参与的反应途径。80v用已糖激酶用已糖激酶 (HK)(HK)或葡萄糖脱氢酶或葡萄糖脱氢酶(GD)(GD)方法方法测定葡萄糖时，葡萄糖的消耗与测
42、定葡萄糖时，葡萄糖的消耗与NADHNADH的生成的生成呈呈等摩尔关系等摩尔关系。葡萄糖有标准纯制品。葡萄糖有标准纯制品。v根据公式根据公式A=A=bCbC，已知比色杯光径已知比色杯光径b b和葡萄和葡萄糖标准液浓度，测得葡萄糖标准管的吸光度糖标准液浓度，测得葡萄糖标准管的吸光度A A后便可计算出后便可计算出NADHNADH（NADPHNADPH）的摩尔吸光系的摩尔吸光系数数为为 A/A/bCbC。81测定方法 葡萄糖标准液浓度为葡萄糖标准液浓度为1Ommo1/L(0.01mol/L)1Ommo1/L(0.01mol/L)，标准液加标准液加入量为入量为3.5L3.5L，酶试剂加入量为酶试剂加入量
43、为335L335L，比色杯光径为比色杯光径为0.7cm0.7cm，在在340nm340nm测得吸光度为测得吸光度为0.4650.465，则实测，则实测NADHNADH摩尔吸摩尔吸光系数光系数 =64246424，即在此台分析仪上，即在此台分析仪上340nm340nm波长处测得波长处测得NADHNADH（NADPHNADPH）的摩尔吸光系数为的摩尔吸光系数为64246424，而理论上而理论上NADHNADH（NADPHNADPH）的的为为62206220。82（2 2）“色素原色素原”酶促产物酶促产物在在405nm405nm波长摩尔吸光系数的测定波长摩尔吸光系数的测定 有许多酶底物为人工合成的有
44、许多酶底物为人工合成的“色素原色素原”底物，其本身无色，经底物，其本身无色，经酶作用后释放出有色的反应产物，在酶作用后释放出有色的反应产物，在405nm405nm波长具有吸收峰。波长具有吸收峰。ALPALP底物底物磷酸对硝基苯酚磷酸对硝基苯酚 (4-Nitrophenyl phosphate(4-Nitrophenyl phosphate，4-NPP)4-NPP)经酶作用后释放出黄色的对硝基苯酚经酶作用后释放出黄色的对硝基苯酚(4-Nitrophenol(4-Nitrophenol，4-NP)4-NP)GGTGGT底物底物-L-L-谷氨酰对硝基苯胺谷氨酰对硝基苯胺(-L-Glutamyl-p-
45、nitroanilide-L-Glutamyl-p-nitroanilide)或或-L-L-谷氨酰谷氨酰-3-3-羟基羟基-对硝基苯胺对硝基苯胺(-L-Glutamyl-3-carboxyl-p-nitroan)(-L-Glutamyl-3-carboxyl-p-nitroan)经酶作用后释放出黄色的对硝基苯胺经酶作用后释放出黄色的对硝基苯胺(p-Nitroaniline(p-Nitroaniline，4-NA)4-NA)或对硝基或对硝基-5-5-氨基苯甲酸氨基苯甲酸(2-amino-nitrobenzoicacid(2-amino-nitrobenzoicacid，ANBA)ANBA)。83
46、以对硝基苯酚的摩尔吸光系数测定为例以对硝基苯酚的摩尔吸光系数测定为例试剂：试剂：4-NP4-NP标准储存液标准储存液(1Ommo1/L)(1Ommo1/L)4-NP 4-NP标准应用液标准应用液(2.5mmo1/L(2.5mmo1/L，以以0.84mol/L 0.84mol/L AMPAMP缓冲液稀释而成缓冲液稀释而成)底物缓冲液底物缓冲液(l5mmol/L 4-NPP(l5mmol/L 4-NPP配于配于0.84mol/L 0.84mol/L AMP-HCLAMP-HCL缓冲液中，缓冲液中，37,pH l0.0937,pH l0.09土土0.02)0.02)。84测定测定方法方法 4-NP4
47、-NP标准液加入量为标准液加入量为5L5L，底物缓冲液加底物缓冲液加入量为入量为350L350L，波长波长405nm405nm，光径光径0.7cm0.7cm，温温度度3737，测定得吸光度为，测定得吸光度为A A1 1；另用蒸馏水代另用蒸馏水代替替4-NP4-NP标准液，按上述方法测定其吸光度为标准液，按上述方法测定其吸光度为A A2 2，4-NP4-NP标准液吸光度标准液吸光度A=AA=A1 1-A-A2 2，若测得若测得AA为为0.4600.460，则实测，则实测4-NP4-NP摩尔吸光系数摩尔吸光系数18662 18662 85自动生化分析仪的校准方法自动生化分析仪的校准方法v1、K因素
48、法：又称标准化法或线性法，因素法：又称标准化法或线性法，当物质的浓度与吸光度成正比时选用该当物质的浓度与吸光度成正比时选用该法。原理：浓度法。原理：浓度=因素因素吸光度吸光度v2、非、非线性法：又称曲性法：又称曲线拟合法，或称合法，或称为多点定多点定标。86校准校准K K值注意事项值注意事项 酶活性校准品经校准操作后由分析仪自动酶活性校准品经校准操作后由分析仪自动计算得出。计算得出。在进行酶学测定时，如果分析条件在进行酶学测定时，如果分析条件的变化如温度、样品试剂加量和吸光度检测偏的变化如温度、样品试剂加量和吸光度检测偏差可同等程度地影响校准物和待测样品，则使差可同等程度地影响校准物和待测样品
49、，则使用校准品能进行补偿。一般来说以使用用校准品能进行补偿。一般来说以使用校准校准K K值值为好，为好，但必须有两个先决条件：但必须有两个先决条件：必须使用必须使用配套的试剂；配套的试剂；必须使用配套的高质量的校准必须使用配套的高质量的校准品，该校准品应具有品，该校准品应具有溯源性溯源性。87（四）透射比浊法（四）透射比浊法(多点校准多点校准)抗原与相应的抗体结合形成的抗原与相应的抗体结合形成的免疫复合物免疫复合物，在反应液中具有一定的浊度，可由一般分光光在反应液中具有一定的浊度，可由一般分光光度法进行度法进行透射比浊透射比浊（transmission transmission turbidi
50、metryturbidimetry）测定，可用于某些蛋白质和药测定，可用于某些蛋白质和药物浓度等的测定。该法须做物浓度等的测定。该法须做多点校准多点校准，再经，再经非非线性回归线性回归，求出抗原或抗体的含量。，求出抗原或抗体的含量。88二、常用生化检测项目分析方法举例二、常用生化检测项目分析方法举例 1 1终点法检测终点法检测 常用的有总胆红素（氧化法或重氮法）、常用的有总胆红素（氧化法或重氮法）、结合胆红素（氧化法或重氮法）、血清总蛋白结合胆红素（氧化法或重氮法）、血清总蛋白（双缩脲法）、血清白蛋白（溴甲酚氯法）、（双缩脲法）、血清白蛋白（溴甲酚氯法）、总胆汁酸（酶法）、葡萄糖（葡萄糖氧化酶