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1、基于片断的药物设计基于片断的药物设计Fragment-based drug discovery郭宗儒郭宗儒2009-10-16From Leach AR,Hann MM,Burrows JN et al.Fragment screening:an introduction.Mol.BioSyst.,2006,2:429-446对靶标认识水平不同的药物分子设计对靶标认识水平不同的药物分子设计苗头和先导物的发现途径苗头和先导物的发现途径 天然活性物质天然活性物质 基于结构的分子设计基于结构的分子设计 随机筛选随机筛选 虚拟筛选虚拟筛选问题的出现问题的出现 以靶标为核心的新药研发，切入点是用体外方法
2、以靶标为核心的新药研发，切入点是用体外方法评价活性活性。评价活性活性。苗头化合物苗头化合物(hit)多以活性强度为衡量标准。多以活性强度为衡量标准。hit-to-lead和先导物优化，大都加入或变换基团，以和先导物优化，大都加入或变换基团，以增加与靶标结合的机会和强度。增加与靶标结合的机会和强度。一般一般“不敢不敢”去除基团或片断，以免丢失参与结去除基团或片断，以免丢失参与结合的原子或基团合的原子或基团(即药效团即药效团)。高通量筛选的化合物过于高通量筛选的化合物过于“成熟成熟”，留给后续的，留给后续的结构变换的余地小，导致投入结构变换的余地小，导致投入-产出比低。产出比低。高通量筛选的不足高
3、通量筛选的不足发现苗头的概率很低。理论计算，含有发现苗头的概率很低。理论计算，含有30个个C、N、O、S原子的化合物有原子的化合物有1060种，而高通量筛选的化种，而高通量筛选的化合物数即使以百万计合物数即使以百万计(106)，筛选也只占很少部分。，筛选也只占很少部分。化合物分子量比较大，亲脂性强，优化成药的难化合物分子量比较大，亲脂性强，优化成药的难度大。组合化学库尤甚。度大。组合化学库尤甚。分子量分子量160的含上述院子化合物数为的含上述院子化合物数为107，筛选，筛选的分子为的分子为103104 个。发现苗头的几率高。个。发现苗头的几率高。公司之间的化合物的结构类型相似，筛选靶标相公司之
4、间的化合物的结构类型相似，筛选靶标相同，易有知识产权之纠葛。同，易有知识产权之纠葛。片片 断断 及及 其其 特特 征征片断是比类药分子小的化合物，分子量或非片断是比类药分子小的化合物，分子量或非氢原子数低于类药性化合物。氢原子数低于类药性化合物。化学结构比类药分子简单。化学结构比类药分子简单。片断应易溶于水，因需要高浓度试液方呈现片断应易溶于水，因需要高浓度试液方呈现与靶标的结合信号。与靶标的结合信号。结构上有可以延伸的位置、原子或基团。结构上有可以延伸的位置、原子或基团。没有化学活泼的反应基团。没有化学活泼的反应基团。Congreve M et al.Drug Discov Today.20
5、03,8:876。由苗头物发展成先导物的性质变化由苗头物发展成先导物的性质变化参数参数 苗头物均值苗头物均值 先导物均值先导物均值 增量增量分子量分子量 174.1 382.8 207.7氢键给体氢键给体 1.7 1.7 0氢键接受体氢键接受体 2.9 5.6 2.7非氢原子数非氢原子数 12.8 28.5 15.7增量大增量大由先导物发展成药物的性质变化由先导物发展成药物的性质变化参数参数 先导物均值先导物均值 成药后均值成药后均值 增量增量分子量分子量 272.0 314.0 42.0氢键给体氢键给体 0.8 0.8 0氢键接受体氢键接受体 2.2 2.5 0.3Clog P 1.9 2.
6、4 0.5非氢原子数非氢原子数 19 22 3增量小增量小FBDD的背景的背景1Andrews分析了分析了200个药物和抑制剂的结合常数与个药物和抑制剂的结合常数与结构的关系，得出了结构的关系，得出了10 个常见功能基和原子对结合个常见功能基和原子对结合能的贡献均值能的贡献均值。带电带电荷基荷基团团极性基极性基团团非极性基非极性基团团功能基功能基N+PO2-4CO2COOH卤卤素素NO,S醚醚C(sp3)C(sp2)结结合能合能*11.510.08.23.42.51.31.21.10.80.7带电荷的基团与受体结合的贡献强于极性基团，极性带电荷的基团与受体结合的贡献强于极性基团，极性基团又强于
7、非极性基团。基团又强于非极性基团。Andrews P et al.Med.Chem.1984,27,1648*kcal/molFBDD的背景的背景2Kuntz等分析了等分析了150个含有个含有167个原子构成的离子或化个原子构成的离子或化合物与受体的结合常数，按照下式计算了结合常数与系合物与受体的结合常数，按照下式计算了结合常数与系统自由能变化的关系，进而推定出每个原子对结合的贡统自由能变化的关系，进而推定出每个原子对结合的贡献献。G结合结合=G复合物复合物 G参比态参比态=RTlnK 当非氢原子数在当非氢原子数在15个以内，结合能随原子数的增加而线个以内，结合能随原子数的增加而线性增高，平均
8、每个原子的贡献为性增高，平均每个原子的贡献为1.5 kcal/mol；超过；超过15个原子后结合能的变化趋于不变，成为非线性变化，这个原子后结合能的变化趋于不变，成为非线性变化，这种现象归因为非热力学因素。种现象归因为非热力学因素。Andrews和和Kuntz的研究为配体效率概念奠定了基础的研究为配体效率概念奠定了基础。配体效率配体效率(ligand efficiency,LE)分子大小影响物化和药代性质。分子大小影响物化和药代性质。减少苗头、先导物中冗余原子的必要性。减少苗头、先导物中冗余原子的必要性。配体效率是衡量苗头物或先导物以及优化的化合物的配体效率是衡量苗头物或先导物以及优化的化合物
9、的质量的参数，表征化合物的活性效率。质量的参数，表征化合物的活性效率。系指配体系指配体(苗头、先导物、优化物等苗头、先导物、优化物等)中每个原子对结中每个原子对结合能的贡献，在选取先导物和优化过程中是个有用的合能的贡献，在选取先导物和优化过程中是个有用的指标。指标。计算方法：首先是将复合物结合常数计算方法：首先是将复合物结合常数Kd转换为在温度转换为在温度300K的结合的自由能的结合的自由能(G)。G-RT.lnKd=1.37 pKd G除以非氢原子数，得出每个原子的自由能贡献即配除以非氢原子数，得出每个原子的自由能贡献即配体效率，用下式表示：体效率，用下式表示：LE=G/N非氢原子非氢原子配
10、体亲脂性效率配体亲脂性效率配体效率是将化合物的活性在分子大小的尺度配体效率是将化合物的活性在分子大小的尺度上加以表征，是优化过程中监测化合物的活性、上加以表征，是优化过程中监测化合物的活性、物化性质和成药性程度的一个指标。物化性质和成药性程度的一个指标。还可用配体还可用配体-亲脂性效率指数亲脂性效率指数(ligand-lipophilicity efficiency,LLE)表征先导物和优表征先导物和优化的质量。化的质量。LLE 的定义是的定义是 pIC50(或或pKi)-cLogP(或或 LogD)Congreve M et al.J Med Chem,2008,51:3661契契 合合 质
11、质 量量在结构优化中，当分子量的加大，即使活性增大，配体效率却在结构优化中，当分子量的加大，即使活性增大，配体效率却变化不大，甚至减小。以致不能反映和揭示优化过程的实际状变化不大，甚至减小。以致不能反映和揭示优化过程的实际状态。态。Reynolds等提出了配体的契合质量的概念等提出了配体的契合质量的概念(fit quality,FQ)，以消除因分子量加大，以消除因分子量加大，LE的变化被掩饰和拉平的效应。的变化被掩饰和拉平的效应。计算方法是将化合物的非氢原子数归一和标度化，得到相应的计算方法是将化合物的非氢原子数归一和标度化，得到相应的LE-Scale，分子中不同原子数，分子中不同原子数，LE
12、-Scale值不同，按如下定义：值不同，按如下定义：LE-Scale 0.064+0.873e(-0.026HA)或将幂式展开：或将幂式展开：LE-Scale 0.0715+(7.5382/HA)+(25.7079/HA2)+(361.4722/HA3)配体的契合质量配体的契合质量FQ按照如下计算：按照如下计算：FQ=LE/LE-Scale FQ将上述的非线性标准化，使配体之间的结合效率有可比性。将上述的非线性标准化，使配体之间的结合效率有可比性。Bembenek SD et al.Drug Discov Today.2009,14:278当非氢原子低于当非氢原子低于20时，最大时，最大亲和力
13、与原子数成线性关系；亲和力与原子数成线性关系；超过超过20后活性趋于不变或下后活性趋于不变或下降。降。若以非氢原子数与配体效率若以非氢原子数与配体效率作图，原子数在作图，原子数在1025的的化合物配体效率呈线性变化。化合物配体效率呈线性变化。契契 合合 质质 量量Reynolds CH,BMCL.2007,17:4258非氢原子数非氢原子数 LE scale 相邻差值相邻差值 10 0.7204 11 0.6972 0.0232 12 0.6685 0.0287 13 0.6367 0.0318 14 0.6091 0.0276 15 0.5809 0.0282 16 0.5545 0.026
14、4 17 0.5300 0.0245 18 0.5072 0.0228 19 0.4877 0.0195 20 0.4672 0.0205 21 0.4494 0.0178 22 0.4331 0.0167 23 0.4179 0.0152 24 0.4039 0.0149 25 0.3908 0.0131 26 0.3787 0.0121 27 0.3674 0.0113 28 0.3568 0.0106 29 0.3471 0.0097 30 0.3378 0.0093 片断化合物库片断化合物库体外筛选评价体外筛选评价达到规定活性达到规定活性复合物单晶结构复合物单晶结构是是否否计算机辅助设
15、计计算机辅助设计药物化学合成药物化学合成确定先导物确定先导物达到规定活性达到规定活性是是否否片断化合物库片断化合物库(约约1000-2000个个化合物化合物)体外活性筛选体外活性筛选 结构生物学：复合物结构生物学：复合物X-线晶体线晶体学或学或 NMR或或MS 计算机分子设计辅助计算机分子设计辅助 药物设计和化学合成药物设计和化学合成 活性评价活性评价 结构生物学或分子对接结构生物学或分子对接 构效分析构效分析 确定先导物确定先导物 基于片断的药物设计：基于片断的药物设计：方法的整合性方法的整合性片断化合物举例片断化合物举例片断分子片断分子受体结合部位受体结合部位片断连接片断连接片断分子分别筛
16、选与组合库比较片断分子分别筛选与组合库比较6 X 6片断组合库片断组合库FBDD需要有灵敏的检测手段需要有灵敏的检测手段 NMR方法：方法：Skinner AL,and Laurence JS.J Pharm Sci.2008,97:4670 X-ray方法：方法：Jhoti H et al.Curr Opin Chem Biol.2007,11:48 SPR方法：方法：Neumann T et al.Curr Top Med Chem.2007,7:1630 MS方法方法：Annis DA et al.Curr.Opin.Chem.Biol.2007,11:51 01002003004005
17、006007001 mM100 M 1M 10 nM 1 nM药物HTS苗头物药物候选物片断化合物药效强度相对分子质量Rees et al.,Nature Rev.Drug Disc.2004上市的口服药物平均分子量为上市的口服药物平均分子量为340。处于处于 I 期临床试验的候选药物，分子期临床试验的候选药物，分子 量小于量小于400的成功率为的成功率为50%，分子量加，分子量加大，成功率降低。大，成功率降低。Wenlock et al,J Med Chem 2003配配 体体 效效 率率(LE)Fragment Rule of 3 MW 300#H-Bond Donor=3#H-Bond
18、Acceptors=3cLogP=3#Rotatable bonds=3片断只结合于受体的部分结合位点片断只结合于受体的部分结合位点 片断演化成先导物的三种模式片断演化成先导物的三种模式l 片断的生长片断的生长l片断的连接片断的连接l片断的融合片断的融合与受体结合的相邻的两个片断经连接基连接成活性强的较大分子与受体结合的相邻的两个片断经连接基连接成活性强的较大分子与受体结合的相互交盖或甚近的两个片断合并成活性强的较大分子与受体结合的相互交盖或甚近的两个片断合并成活性强的较大分子以受体结合的第一个片断为核心，经理性设计，在邻近处逐渐生长以受体结合的第一个片断为核心，经理性设计，在邻近处逐渐生长成
19、活性强的较大分子成活性强的较大分子IC50(M)80 12 3.0 0.51 0.20 0.031 0.018 No HA 10 15 15 20 23 21 24 LE(kcal/mol)0.47 0.48 0.61 0.43 0.40 0.49 0.44 FQ 0.70 0.83 1.05 0.92 0.96 1.09 1.09.片断生长：蛋白激酶片断生长：蛋白激酶B(PKB)抑制剂先导物抑制剂先导物优化结构要求化合物的配体效率保持在优化结构要求化合物的配体效率保持在0.30 以上。以上。基于基于PKB与苗头物的三维结合特征，发现在苯环对位的结合部位有负性基团和与苗头物的三维结合特征，发现
20、在苯环对位的结合部位有负性基团和较大的腔穴。较大的腔穴。合成了含有碱性基团的化合物，活性提高，虽分子量增大，仍保持了合成了含有碱性基团的化合物，活性提高，虽分子量增大，仍保持了LE值。值。加入新的苯环，仍维持了相同的配体效率。加入新的苯环，仍维持了相同的配体效率。最后在新的苯环上引入卤素，得到高活性最后在新的苯环上引入卤素，得到高活性。(Saxty G et al.J Med Chem 2007,50:2293)S-isomer,(0.28M)R-isomer,(31 nM)片断生长片断生长:周期蛋白依赖的激酶抑制剂周期蛋白依赖的激酶抑制剂 周期蛋白依赖的激酶周期蛋白依赖的激酶(CDK)活性取
21、决于周期蛋白活性取决于周期蛋白的存在的存在,其表达水平与细胞周期相关。抑制其表达水平与细胞周期相关。抑制CDK可可抑制肿瘤生长。抑制肿瘤生长。两个氢键和芳环疏水作用两个氢键和芳环疏水作用MW=316 IC50=0.66M LE=0.38MW=316 IC50=0.66M LE=0.38LQ=0.85Leu81羰基形成氢键羰基形成氢键,Ile10 and Leu134与苯环的疏水作用与苯环的疏水作用MW=118 IC50=185M LE=0.57LQ=0.76MW=187 IC50=97M LE=0.39FQ=0.64另一思路是去除苯并环另一思路是去除苯并环,活性减弱活性减弱,但但LE未降未降M
22、W=258 IC50=0.85M LE=0.44FQ=0.90简化后的吡唑简化后的吡唑4位可向外生长位可向外生长,氢键给体有利于结合氢键给体有利于结合.活性明显提高活性明显提高,LE大增大增2333MW=337 IC50=0.14M LE=0.39FQ=0.97MW=373 IC50=0.003M LE=0.45FQ=1.19苯甲酰胺的活性略增苯甲酰胺的活性略增,LE降低降低.苯环离开羰基苯环离开羰基明面明面51,说明不明不稳定定苯环苯环2,6位双取代稳定了构象位双取代稳定了构象,活性提升活性提升,但进入细胞能力弱但进入细胞能力弱,ClogP过大过大,分子内氢键所致分子内氢键所致.MW=395
23、 IC50=0.047M LE=0.42FQ=1.06二氯取代二氯取代,对酶和细胞活性均明显增高对酶和细胞活性均明显增高MW=362 IC50=0.14M LE=0.31FQ=0.79AT7519于于10M 对对 P450 1A2,2D6,3A4,2C9,2C19的抑制作用的抑制作用1 mM，且只有R构型与酶结合，晶体衍射表明，伯氨基与Asp189的羧基、Ser190的羰基以及Gly219形成氢键，苯基与亚乙基与S1疏水强结合。美西律虽配体效率只有0.32，但水溶性很好，且口服生物利用度F=90%，pKa=9.2，碱性不象既有的uPA抑制剂过强，故是良好的起始物。根据萘脒具有活性说明苯环的对位
24、有空间，可引入酸性基团，去掉侧链甲基以消除手性原子，将2,6-二甲基换成二氯，IC5040 M，在晶体结构的引导下，酰苯胺的 IC50=5.2 M，IC50=720 nM，最后经SAR设计化合物活性提高10倍，IC50=72 nM。对大鼠具有良好药代动力学性质，半衰期t1/2=7.5 h，F=60%IC50 1 mM 40 M 5.2 M 720 nMLE 0.32 0.40 0.29 0.29FQ 0.57 0.76 0.74 0.84 IC50=72 nMLE=0.32 FQ=0.97片断连接：片断连接：FKBP抑制剂抑制剂 用核磁共振研究用核磁共振研究FKBP抑制剂，称作抑制剂，称作SA
25、R by NMR。用。用15N 标记的标记的FKBP筛选片断库的结合作用，观察和确定酰胺键的筛选片断库的结合作用，观察和确定酰胺键的15N-和和1H化学位移的变化。化学位移的变化。筛选两种分子筛选两种分子1和和2有弱结合作用。连接成有弱结合作用。连接成3为强抑制剂。为强抑制剂。1 2 3Kd 2 M 100 M 49 nM非氢原子数 26 17 45LE(kcal/mol)0.30 0.32 0.22FQ 0.79 0.64 1.06Shuker SB et al.Science,1996,274:1531 片断连接：他克林形成挛药片断连接：他克林形成挛药 胆碱酯酶有两个结合位点：深部窄口处的
26、催化胆碱酯酶有两个结合位点：深部窄口处的催化部位和暴露于水相的外部位点。部位和暴露于水相的外部位点。将适宜长度的碳链连接他克林，提高了活性。将适宜长度的碳链连接他克林，提高了活性。Ki=0.018M(小鼠小鼠)IC50=0.59M(大鼠大鼠脑脑)HA No=15 LE=0.57 FQ=0.98IC50=0.0004M(大鼠大鼠脑脑)HA No=37 LE=0.35 FQ=1.25Pang YP,Quiram P,Jelacic T et al.Highly potent,selective,and low cost bis-tetrahydroaminacrine inhibitors of
27、acetylcholinesterase.Steps toward novel drugs for treating Alzheimers disease.J.Biol.Chem.1996,271,23646-23649.3Lewis WG,Green LG,Grynszpan,F et al.Click chemistry in situ:Acetylcholinesterase as a reaction vessel for the selective assembly of a femtomolar inhibitor from an array of building blocks.
28、Angew.Chem.,Int.Ed.2002,41,1053-10576Ki=1.1M(小鼠小鼠)HA No=31 LE=0.26 FQ=0.80Ki=0.018M(小鼠小鼠)HA No=15 LE=0.57 FQ=0.98Ki=0.00000041M(小鼠小鼠)HA No=48 LE=0.35 FQ=1.80 Sharpless等用环加成反应将两个不同的抑制剂片断等用环加成反应将两个不同的抑制剂片断经连接基生成经连接基生成fmole级的高活性胆碱酯酶抑制剂级的高活性胆碱酯酶抑制剂片断连接：他克林与另一弱作用片断形成强抑制剂片断连接：他克林与另一弱作用片断形成强抑制剂片断融合：自组装碳酸酐酶
29、抑制剂片断融合：自组装碳酸酐酶抑制剂两个片断独立结合于邻近的两个位点，化学活性两个片断独立结合于邻近的两个位点，化学活性功能基自组装成亚胺，还原生成高活性抑制剂功能基自组装成亚胺，还原生成高活性抑制剂.Swayze EE;Jefferson EA,Sannes-Lowery KA et al.SAR by MS:A ligand based technique for drug lead discovery against structured RNA targets.J Med Chem.2002,45,3816-3819.片断融合：用质谱方法研究片断融合：用质谱方法研究U1061A RNA
30、抑制剂抑制剂 U1061A RNA是抗微生物感染的靶标。是抗微生物感染的靶标。质谱法可在高浓度下进行。质谱法可在高浓度下进行。可给出结合信息：化学计量性，竞争结合性。可给出结合信息：化学计量性，竞争结合性。化合物化合物1和和2可同时结合于靶标，二者非竞争性结合，位点不同，相距邻近。可同时结合于靶标，二者非竞争性结合，位点不同，相距邻近。1和和2融合一起，提高了活性。融合一起，提高了活性。IC50 40 M 41 M 0.064M No HA 12 19 31 LE 0.32 0.50 0.31 FQ 0.48 1.02 0.97分子量分子量分布系数分布系数药代药代 过膜性过膜性 生物利用度生物利用度药代药代 半衰期半衰期代谢稳定性代谢稳定性药效药效 配体效率配体效率药效药效 配体亲脂效率配体亲脂效率分子体积分子体积杂原子数杂原子数分子表面积分子表面积氢键接受氢键接受 体体氢键给体氢键给体可旋转性键可旋转性键极性表面积极性表面积分子量和分布系数是优化物化性质、药效学、药代动力学的高度概括分子量和分布系数是优化物化性质、药效学、药代动力学的高度概括改编于Johnson et al.BMCL,2009,19:5560 请指正请指正 谢谢谢谢