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1、伊马替尼伊马替尼伊马替尼伊马替尼(imatinibimatinib)对醛固酮诱导大鼠心肌纤维化的干预作用及机制对醛固酮诱导大鼠心肌纤维化的干预作用及机制对醛固酮诱导大鼠心肌纤维化的干预作用及机制对醛固酮诱导大鼠心肌纤维化的干预作用及机制导导 师：马礼坤师：马礼坤 教授教授 学学 生：生：李李 谦谦一一 立论依据立论依据n n醛固酮（醛固酮（ALDALD）可以导致心肌纤维化（）可以导致心肌纤维化（MFMF）的观点已被）的观点已被大量实验得到验证。但目前醛固酮导致心肌纤维化的机制大量实验得到验证。但目前醛固酮导致心肌纤维化的机制尚不十分清楚，传统认为醛固酮通过激活心肌细胞膜表面尚不十分清楚，传统认
2、为醛固酮通过激活心肌细胞膜表面的盐皮质激素受体增加转化生长因子（的盐皮质激素受体增加转化生长因子（TGF-BTGF-B）,内皮素内皮素-1 1（ET-1ET-1）及血浆纤溶酶原激活物抑制剂）及血浆纤溶酶原激活物抑制剂-1-1（PAI-1PAI-1）m m RNA RNA 的表达，的表达，TGF-BTGF-B，ET-1ET-1及及PAI-1PAI-1可通过不同信号途径可通过不同信号途径导致心肌纤维化的发生。导致心肌纤维化的发生。n n国内外对国内外对ALDALD诱导诱导MFMF的研究中均发现：的研究中均发现：MFMF明显的模型组明显的模型组大鼠心肌中血小板衍生因子（大鼠心肌中血小板衍生因子（PD
3、GFsPDGFs）明显增多，而使用）明显增多，而使用ALDALD受体抑制剂受体抑制剂-螺内酯（螺内酯（SPISPI）干预组）干预组MFMF程度减低程度减低PDGFsPDGFs表达减少，提示表达减少，提示PDGFsPDGFs信号途径可能参与信号途径可能参与ALDALD诱导的诱导的MFMF过程。过程。n nPDGFsPDGFs是一种促成纤维细胞是一种促成纤维细胞(fibroblasts)(fibroblasts)及血管平滑肌细及血管平滑肌细胞有丝分裂并具有趋化作用的因子，胞有丝分裂并具有趋化作用的因子，PDGFsPDGFs 的高表达导致的高表达导致MFMF已被大量文献报道，均提示已被大量文献报道，
4、均提示PDGFsPDGFs信号途径可能为信号途径可能为ALDALD诱导诱导MFMF重要后续机制。重要后续机制。二二 PDGFs信号途径在信号途径在ALD诱导心肌纤维化诱导心肌纤维化中的可能机制中的可能机制醛固酮与其受体结合后，通过醛固酮与其受体结合后，通过下游复杂分子信号途径下游复杂分子信号途径导致导致活化巨噬细胞的炎症细胞释放PDGFs，并且释放炎症细胞活性因子上调心肌间质细胞（如：成纤维细胞）血小板源性生长因子受体（PDGFRs）表达。PDGFRs是一种酪氨酸激酶受体，PDGFsPDGFs与心肌间质成纤维细胞表面与心肌间质成纤维细胞表面PDGFRsPDGFRs结合后，一方面对成纤维细胞产生
5、趋化作用并促结合后，一方面对成纤维细胞产生趋化作用并促进其有丝分裂，另一方面成纤维细胞内进其有丝分裂，另一方面成纤维细胞内开始复杂的第二信使级联放大作用，并且以自分泌和旁分泌的形式与其它可导致纤维化的生长因子协同（如TGF-B1），导致心肌成纤维细胞大量合成胶原纤维，单位质量心肌中胶原的含量、浓度或容积分数明显高于正常，最终导致心肌纤维化、心室重塑的发生。三三 目前现状目前现状n目前国外相关研究显示血小板衍生因子受体拮抗剂（伊马替尼）可以显著抑制心脏组织内与心肌炎相关联的PDGF-活性以及纤维化的发生，进一步证实PDGFs及其受体（主要是PDGFR-）的激活在MF的发生发展过程中的起重要作用；
6、n国内尚缺乏相关动物实验研究的报告。四四 本动物实验造模方法本动物实验造模方法n n4040只雄性只雄性SDSD大鼠首先经大鼠首先经10%10%水合氯醛腹腔麻醉行右肾切除水合氯醛腹腔麻醉行右肾切除术，术后一周给予术，术后一周给予1%1%氯化钠饮水，随机分为氯化钠饮水，随机分为4 4组，每组组，每组1010只：只：n n（1 1）对照组（）对照组（CONCON组）：等体积油剂皮下注射组）：等体积油剂皮下注射+等体积等体积蒸馏水灌胃；蒸馏水灌胃；n n（2 2）模型组（去氧皮质酮组）去氧皮质酮）模型组（去氧皮质酮组）去氧皮质酮15mg/15mg/只只.4d-1.4d-1皮皮下注射下注射+等体积蒸馏
7、水灌胃；等体积蒸馏水灌胃；n n（3 3）螺内酯干预组（螺内酯）螺内酯干预组（螺内酯+去氧皮质酮组）：去氧皮质去氧皮质酮组）：去氧皮质酮酮 15mg/15mg/只只.4d-1.4d-1皮下注射皮下注射+螺内酯螺内酯20mg.kg-1.d-120mg.kg-1.d-1灌胃；灌胃；n n（4 4）伊马替尼干预组（伊马替尼）伊马替尼干预组（伊马替尼+去氧皮质酮组）：去氧去氧皮质酮组）：去氧皮质酮皮质酮15mg/15mg/只只.4d-1.4d-1皮下注射皮下注射+伊马替尼伊马替尼60mg.kg.d-160mg.kg.d-1灌胃；灌胃；五五 研究目的研究目的n n初步了解在单肾切除初步了解在单肾切除SD
8、SD大鼠经去氧皮质酮诱导致高血压模大鼠经去氧皮质酮诱导致高血压模型中，比较螺内酯单独，伊马替尼单独对心肌纤维化的影型中，比较螺内酯单独，伊马替尼单独对心肌纤维化的影响。响。n n比较观察各分组比较观察各分组PDGFsPDGFs及及PDGFRsPDGFRs表达和功能变化；表达和功能变化；n n以纤维母细胞的增值与表型转变和心肌胶原代谢的以纤维母细胞的增值与表型转变和心肌胶原代谢的MMPs/TIMPsMMPs/TIMPs系统的表达及活性变化为主要指标，比较观系统的表达及活性变化为主要指标，比较观察螺内酯，伊马替尼对心肌纤维化的干预作用；察螺内酯，伊马替尼对心肌纤维化的干预作用；n n观察伊马替尼对
9、单核巨噬细胞浸润及其他促纤维化因子观察伊马替尼对单核巨噬细胞浸润及其他促纤维化因子TGF-1TGF-1、osteopontinosteopontin、PAI-1PAI-1、ET-1ET-1、u-PAu-PA及及tenascintenascin-C-C等影等影响，以论证响，以论证PDGFsPDGFs信号途径是醛固酮诱导心肌纤维化重要信号途径是醛固酮诱导心肌纤维化重要机制之一。机制之一。n n确定确定PDGFsPDGFs信号途径在醛固酮诱导心肌纤维化过程中的重信号途径在醛固酮诱导心肌纤维化过程中的重要作用，筛选其作用的靶分子，探讨其导致心肌纤维化的要作用，筛选其作用的靶分子，探讨其导致心肌纤维化的
10、细胞分子机制，以期探寻心肌纤维化发病的新机制和防治细胞分子机制，以期探寻心肌纤维化发病的新机制和防治的新策略。的新策略。六六 研究内容（根据待测指标修研究内容（根据待测指标修改）改）n n比较观察各分组心脏内源性比较观察各分组心脏内源性PDGFsPDGFs的的mRNAmRNA表达表达和放免活性、和放免活性、PDGFRsPDGFRs的的mRNAmRNA和蛋白表达及受体和蛋白表达及受体亲和力的变化；亲和力的变化；n n比较观察各分组心肌羟脯氨酸含量、心肌比较观察各分组心肌羟脯氨酸含量、心肌型和型和型胶原蛋白的型胶原蛋白的mRNAmRNA及蛋白表达、心肌及蛋白表达、心肌MMP-1MMP-1、2 2、
11、9 9、1313、TIMPs-1TIMPs-1的的mRNAmRNA及蛋白表达及活性的及蛋白表达及活性的变化，以及单核巨噬细胞浸润、变化，以及单核巨噬细胞浸润、TGF-1TGF-1、osteopontinosteopontin、PAI-1PAI-1、ET-1ET-1、u-PAu-PA及及tenascintenascin-C-C等表等表达情况，以论证达情况，以论证PDGFsPDGFs信号途径是醛固酮诱导心信号途径是醛固酮诱导心肌纤维化重要机制肌纤维化重要机制 待测指标及方法待测指标及方法1.1.通过组织切片、天狼星红胶原染色观察心肌间质胶原容积分数通过组织切片、天狼星红胶原染色观察心肌间质胶原容积
12、分数（CVFCVF）和心肌血管周围胶原面积比（）和心肌血管周围胶原面积比（PVCAPVCA），生化方法测定心生化方法测定心肌羟脯氨酸（肌羟脯氨酸（胶原中约胶原中约50%50%的脯氨酸被羟基化的脯氨酸被羟基化）含量）含量；2.2.免疫组化法观察免疫组化法观察PDGF-c PDGF-c、PDGFR-PDGFR-、osteopontin及tenascin-c表表达情况；达情况；3.3.采用采用RT-PCRRT-PCR测定心肌测定心肌PDGFsPDGFs的的mRNAmRNA（只测（只测C C，A(A(待定待定)）。4.Western-blotting4.Western-blotting的方法测心肌的方
13、法测心肌磷酸化磷酸化PDGFR-PDGFR-表达；表达；5.5.osteopontinosteopontin and tenascin-c expression was analysed by RTPCR(最后做).九九 统计分析统计分析n n根据试验数据的特点选择统计方法；n n采用 spss 分析数据。nn1.幻灯的文字太多，这样容易挨骂的，前几张片子每张字数最好减少到原字数的五分之一；n2.开题中千万不要提及标书的事情千万不要提及标书的事情，原因是没有中标大家都没面子，呵呵，所以你可以参考以前的标书，但不要提它，还有，你以后要从其他角度另写标书，早做准备！n3.脱氧皮质醇是两周左右才注射的吧，你怎么写每天都注射呢，是笔误吗？我觉得用脱氧皮质醇的油剂是非常好的，但是，你的对照不能用生理盐水吧，用什么什么油啊，这类的都行吧，可以直接用你溶解脱氧皮质醇的油剂嘛。n4.你对WESTERN BLOT很熟悉的话，你最好都用这个实验吧，至于PCI的东西等你WESTERN BLOT做完以后再考虑，所以你在你的PPT的片子上就不要提及了。n5.你要多看文献，看摘要也好啊，我感觉你的片子里面没有什么新东西啊，是你没写吗，还是看得少了，要把眼光放远点，所以要多看文献。n6.片子的数目再加一点，有点少。谢谢 谢谢！