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1、细胞增殖活性原位细胞增殖活性原位检测技术及应用检测技术及应用重庆医科大学病理教研室重庆医科大学病理教研室 叶秀峰叶秀峰2021/7/27 星期二1细胞周期（细胞周期（Cell Cycle)一、细胞周期概述一、细胞周期概述概念：概念：细胞周期是指连续分裂的细胞从细胞周期是指连续分裂的细胞从上一次有丝分裂结束到下一次有丝分裂上一次有丝分裂结束到下一次有丝分裂完成所经历的整个过程完成所经历的整个过程。主要事件：遗传信息载体主要事件：遗传信息载体DNADNA复制，通过复制，通过有丝分裂将两份拷贝有丝分裂将两份拷贝DNADNA平均分配到两个平均分配到两个子代细胞中子代细胞中2021/7/27 星期二2分
2、期：分期：分为分为4 4个时期个时期.即G1 S G2 M期期2021/7/27 星期二3(一一)G)Gl l期期(Gap phase)(Gap phase)是指从有丝分裂完成到是指从有丝分裂完成到DNADNA复制之前这一阶段，复制之前这一阶段，包括包括RNAsRNAs及蛋白的合成，所以又称复制前期或及蛋白的合成，所以又称复制前期或合成前期。这一时期细胞主要活动是为合成前期。这一时期细胞主要活动是为DNADNA的复的复制和蛋白质合成作准备，主要特点为：制和蛋白质合成作准备，主要特点为：(1)(1)各种细胞的各种细胞的G G1 1期持续时间变化很大。这期持续时间变化很大。这可能与细胞在此期增加质
3、量有关。因此，可能与细胞在此期增加质量有关。因此，连续增殖细胞的增殖率是受连续增殖细胞的增殖率是受G G1 1期细胞的平期细胞的平均时间长度控制的，各种细胞群体之间细均时间长度控制的，各种细胞群体之间细胞周期的差异取决于胞周期的差异取决于G G1 1期的长短。期的长短。2021/7/27 星期二4(2)(2)此期发生了与此期发生了与DNADNA合成有关的事件，主要是合成有关的事件，主要是RNARNA和蛋白质的合成。和蛋白质的合成。(3)RNA(3)RNA合成发生于合成发生于G G1 1早期，同时早期，同时RNARNA聚合酶水平聚合酶水平也迅速增高。也迅速增高。(4)G(4)G1 1早期合成结构
4、蛋白和酶蛋白等，早期合成结构蛋白和酶蛋白等，G G1 1后期合后期合成与成与DNADNA复制有关的酶类，如胸苷激酶、脱氧核复制有关的酶类，如胸苷激酶、脱氧核苷酸激酶等，其中苷酸激酶等，其中DNADNA聚合酶活性在聚合酶活性在G G1 1末期至末期至S S初期增高最快。初期增高最快。(5)(5)蛋白质磷酸化增加。组蛋白磷酸化增加使染色蛋白质磷酸化增加。组蛋白磷酸化增加使染色体解旋，以利于体解旋，以利于DNADNA复制；非组蛋白磷酸化增加复制；非组蛋白磷酸化增加可能与基因的活化有关。可能与基因的活化有关。(6)(6)染色体状态由凝集转变为解凝集，为染色体状态由凝集转变为解凝集，为DNADNA合合成
5、创造条件。成创造条件。(7)(7)细胞膜转运功能增强。细胞膜转运功能增强。2021/7/27 星期二5(二二)S)S期期(synthesis phase)(synthesis phase)即即DNADNA合成期或复制期，合成期或复制期，S S期主要是期主要是DNADNA合合成成(自我复制自我复制)、遗传物质从二倍体、遗传物质从二倍体(2n)(2n)到四倍体到四倍体(4n)(4n)的整个过程。其中主要的生物化学改变是的整个过程。其中主要的生物化学改变是遗传物质的复制，即遗传物质的复制，即DNADNA的复制及组蛋白、的复制及组蛋白、非组蛋白等染色体蛋白的合成。非组蛋白等染色体蛋白的合成。由于每一条
6、染色体复制成两条染色单体，在由于每一条染色体复制成两条染色单体，在S S期末，期末，DNADNA含量增加一倍。含量增加一倍。DNADNA的准确复制的准确复制保证了分裂后子细胞遗传物质的平均分配。保证了分裂后子细胞遗传物质的平均分配。DNADNA合成的同时，形成新的染色质的另一重要合成的同时，形成新的染色质的另一重要成分组蛋白的合成也同时进行。成分组蛋白的合成也同时进行。2021/7/27 星期二6(三三)G2)G2期期(Gap 2 phase)(Gap 2 phase)指指DNADNA复制完成到有丝分裂开始这段时复制完成到有丝分裂开始这段时间，这段时间内细胞有间，这段时间内细胞有2 2套二倍体
7、染色体，套二倍体染色体，所以又称复制后期或合成后期。所以又称复制后期或合成后期。DNADNA复复制完成后，细胞进入制完成后，细胞进入G2G2期。处于此期的期。处于此期的细胞细胞DNADNA合成已终止，但仍然进行着合成已终止，但仍然进行着RNARNA和一定的蛋白合成，为细胞有丝分和一定的蛋白合成，为细胞有丝分裂作准备。裂作准备。2021/7/27 星期二7(四四)M)M期期(mitosis phase)(mitosis phase)即有丝分裂期，细胞在即有丝分裂期，细胞在MM期进行分裂。期进行分裂。MM期又期又分为前期、前中期、中期、后期、末期。分为前期、前中期、中期、后期、末期。MM期的期的末
8、期一结束，就形成两个新的子细胞，一次细胞末期一结束，就形成两个新的子细胞，一次细胞周期即告结束，细胞就进入下一个细胞周期的周期即告结束，细胞就进入下一个细胞周期的G G1 1期。期。细胞有丝分裂是一个复杂的过程，必须在细胞有丝分裂是一个复杂的过程，必须在DNADNA复制完成后，细胞才能进行有丝分裂。此期细胞复制完成后，细胞才能进行有丝分裂。此期细胞呈球形，不很牢固地附在它生长的基质上。染色呈球形，不很牢固地附在它生长的基质上。染色体在此期凝聚后分开，移向细胞两端，解聚并再体在此期凝聚后分开，移向细胞两端，解聚并再形成两个完整的核，最后通过细胞质分裂而结束形成两个完整的核，最后通过细胞质分裂而结
9、束MM期。期。2021/7/27 星期二82021/7/27 星期二9有丝分裂是一个核改组的连续过程，根据有丝分裂是一个核改组的连续过程，根据形态学特征可分为形态学特征可分为5个阶段：个阶段：前期前期(prophase)前中期前中期(early metaphase)中期中期(metaphase)后期后期(anphase)末期末期(telophase)2021/7/27 星期二101前期前期 这一期主要发生染色体凝集、分裂极的确定、这一期主要发生染色体凝集、分裂极的确定、核仁解体及核膜消失。核仁解体及核膜消失。2.前中期前中期 主要变化是纺锤体的形成和染色体排列在赤道主要变化是纺锤体的形成和染色
10、体排列在赤道面上形成赤道板。面上形成赤道板。3中期中期 从染色体排列到赤道面上到两条染色单体从染色体排列到赤道面上到两条染色单体(子染子染色体色体)开始趋向两极，这段时期称为中期。开始趋向两极，这段时期称为中期。中期的染色体浓缩成典型形态，在赤道面上形成中期的染色体浓缩成典型形态，在赤道面上形成赤道板。赤道板。2021/7/27 星期二114后期后期 后期是姐妹染色单体分开并移向两极的时后期是姐妹染色单体分开并移向两极的时期，当子染色体到达两极时，此期结束。期，当子染色体到达两极时，此期结束。染色单体的分开通常由着丝点开始，即两个染色单体的分开通常由着丝点开始，即两个着丝点先分开，然后两个染色
11、单体的臂逐渐分着丝点先分开，然后两个染色单体的臂逐渐分开，完全分开后就向两极移动。开，完全分开后就向两极移动。5末期末期 从子染色体到达两极后开始到形成两个子细从子染色体到达两极后开始到形成两个子细胞这段时期称为末期，包括子核的形成与胞质胞这段时期称为末期，包括子核的形成与胞质分裂两个过程。分裂两个过程。2021/7/27 星期二12二、细胞周期的控制点二、细胞周期的控制点 细胞周期能够顺利地发生、发展和完成，取决于细胞周期能够顺利地发生、发展和完成，取决于三个重要的控制点三个重要的控制点(control point)，即决定，即决定G1期期发生的发生的G1控制点，决定控制点，决定S期发生的期
12、发生的S控制点和决定控制点和决定M期发生的期发生的M控制点。每一个控制点控制着细胞控制点。每一个控制点控制着细胞周期一定阶段的开始，但只有在细胞周期前一个周期一定阶段的开始，但只有在细胞周期前一个阶段彻底完成以后才能发生。阶段彻底完成以后才能发生。(一一)G1控制点控制点:在在G1期，哺乳动物细胞的趋向有期，哺乳动物细胞的趋向有3种可能性：一种可能性：一些细胞进入些细胞进入S期，通过期，通过G2期及有丝分裂期，即进期及有丝分裂期，即进入增殖周期；一些细胞离开细胞周期，处于静止入增殖周期；一些细胞离开细胞周期，处于静止期，又称期，又称G0期，它们在一定的条件刺激下可重新期，它们在一定的条件刺激下
13、可重新进入增殖周期；进入增殖周期；2021/7/27 星期二13 还有一些细胞向分化方向发展，使细胞的功还有一些细胞向分化方向发展，使细胞的功 能向专一化，而分裂能力趋向减弱。能向专一化，而分裂能力趋向减弱。在正常情况下多细胞的哺乳动物体内的部分在正常情况下多细胞的哺乳动物体内的部分细胞处于非增殖状态的休止期细胞处于非增殖状态的休止期(Go期期)，只在一定，只在一定条件下才进人条件下才进人G1期。在期。在G1期的后期中存在一个期的后期中存在一个类似于酵母周期中起始点的限制点类似于酵母周期中起始点的限制点(restriction point，简称，简称R点点)，它在细胞的每，它在细胞的每一次分裂
14、中具有控制作用，故称为一次分裂中具有控制作用，故称为G1控制点，控制点，只有通过只有通过R点的细胞才能进入点的细胞才能进入S-G2-M期。期。2021/7/27 星期二14 在通过在通过R点前必须合成一种不稳定的蛋白质点前必须合成一种不稳定的蛋白质(p105 RB)，当它积累到一定量时才能通过，当它积累到一定量时才能通过R点点而启动而启动DNA合成。因为一旦启动合成。因为一旦启动DNA合成后就合成后就可通过可通过G2期而进入期而进入M期，所以期，所以R点是控制细胞点是控制细胞增殖的关键，由此出发，细胞可能有增殖的关键，由此出发，细胞可能有3种不同的种不同的命运：命运：(1)继续增殖细胞。这些细
15、胞在分裂完成之后，继续增殖细胞。这些细胞在分裂完成之后，可以超过可以超过R点继续向前发展，它们不断离开点继续向前发展，它们不断离开G1期，并通过细胞增殖周期中的各个不同时期完期，并通过细胞增殖周期中的各个不同时期完成细胞分裂。如骨髓干细胞，胃、肠上皮中的成细胞分裂。如骨髓干细胞，胃、肠上皮中的基底细胞等。基底细胞等。2021/7/27 星期二15 (2)暂时不增殖细胞。这类细胞在分裂完成后，暂时不增殖细胞。这类细胞在分裂完成后，暂时处于暂时处于G。期，并在。期，并在R点被阻留很长时间。点被阻留很长时间。在正常情况下，这类细胞不合成在正常情况下，这类细胞不合成DNA也不分裂，也不分裂，但在一定条
16、件下可再进入细胞周期而进行增殖。但在一定条件下可再进入细胞周期而进行增殖。属于这种类型的有肝细胞、哺乳动物的初级卵属于这种类型的有肝细胞、哺乳动物的初级卵母细胞等。母细胞等。(3)不增殖细胞。这类细胞可以由不增殖细胞。这类细胞可以由R点走向分化点走向分化细胞，并成为执行专门功能的终末分化细胞。细胞，并成为执行专门功能的终末分化细胞。如神经细胞、哺乳动物的成熟红细胞、皮肤上如神经细胞、哺乳动物的成熟红细胞、皮肤上皮的角质细胞等。皮的角质细胞等。2021/7/27 星期二16(二二)S控制点控制点 细胞在细胞在G1期完成后，细胞质中含有期完成后，细胞质中含有DNA复制复制的激活因子，叫的激活因子，
17、叫S期激活因子期激活因子(S phase activator)。S期激活因子的量决定期激活因子的量决定Gl期完成和细胞进入期完成和细胞进入S期期的速度。的速度。DNA复制完成后，细胞结束复制完成后，细胞结束S期进入期进入G2期，期，某些细胞可停在某些细胞可停在G2期，在适当的条件下进入期，在适当的条件下进入M期重新分裂。期重新分裂。(三三)M期控制点期控制点 细胞开始有丝分裂时需要细胞开始有丝分裂时需要M期激酶期激酶(M phase kinase)激活。激活。M期激酶是由期激酶是由2个亚单位个亚单位2021/7/27 星期二17 组成，一个是催化亚单位组成，一个是催化亚单位p34；另一个是调节
18、；另一个是调节亚单位，它是一种细胞周期蛋白亚单位，它是一种细胞周期蛋白(cyclin)，可，可以是周期蛋白以是周期蛋白A或周期蛋白或周期蛋白B，它们是在有丝分，它们是在有丝分裂间期不断合成并积累的。裂间期不断合成并积累的。p34本身没有活性，当它与调节亚单位结本身没有活性，当它与调节亚单位结合时，通过调节亚单位变构形成合时，通过调节亚单位变构形成p34-cyclinA或或 p34-cyclinB二聚体。二聚体中的二聚体。二聚体中的p34蛋白丝氨蛋白丝氨酸与苏氨酸残基去磷酸化，产生激酶活性位点，酸与苏氨酸残基去磷酸化，产生激酶活性位点，使细胞进入使细胞进入M期。在期。在M期中，调节亚单位被破期中
19、，调节亚单位被破坏，使坏，使M期激酶失活，从而使分裂的两个子细期激酶失活，从而使分裂的两个子细胞分开，结束胞分开，结束M期。期。2021/7/27 星期二18 第二节细胞周期的调控第二节细胞周期的调控 目前，人们已揭示了细胞周期的主要生物化目前，人们已揭示了细胞周期的主要生物化学过程，并获得了自酵母至人类普遍适用的模学过程，并获得了自酵母至人类普遍适用的模式。式。一细胞因子与相应的受体一细胞因子与相应的受体 细胞因子是一类能与特异的、高亲和性的细细胞因子是一类能与特异的、高亲和性的细胞外基质、可溶性受体及细胞膜上的受体结合，胞外基质、可溶性受体及细胞膜上的受体结合，向细胞内传递信号，刺激细胞增
20、殖的多肽类物向细胞内传递信号，刺激细胞增殖的多肽类物质。生长因子为一类促进细胞生长的细胞因子。质。生长因子为一类促进细胞生长的细胞因子。根据生长因子的靶细胞的不同，可将其根据生长因子的靶细胞的不同，可将其 2021/7/27 星期二19 分为两类：一类为具有广泛作用的生长因子，分为两类：一类为具有广泛作用的生长因子，如表皮生长因子如表皮生长因子(EGF)、血小板衍化生长因子、血小板衍化生长因子(PDGF)、成纤维细胞生长因子、成纤维细胞生长因子(FGF)、类胰岛、类胰岛素生长因子素生长因子(IGF)和转化生长因子和转化生长因子(TGF-)等；等；另一类为细胞特异性生长因子，如白细胞介素另一类为
21、细胞特异性生长因子，如白细胞介素2(IL-2)、神经生长因子、神经生长因子(NGF)、粒细胞集落刺、粒细胞集落刺激因子激因子(G-CSF)等。等。正常情况下，哺乳动物体内的大部分细胞正常情况下，哺乳动物体内的大部分细胞处于非增殖状态的处于非增殖状态的G0期，此期细胞主要表达与期，此期细胞主要表达与细胞生长有关的基因，但不合成与细胞周期调细胞生长有关的基因，但不合成与细胞周期调控体系有关的蛋白控体系有关的蛋白。细胞因子作用于细胞表面细胞因子作用于细胞表面的各种相应的受体，受体多是增殖信号的跨膜的各种相应的受体，受体多是增殖信号的跨膜传递者。这些受体都是糖蛋白，和生长因子结传递者。这些受体都是糖蛋
22、白，和生长因子结2021/7/27 星期二20 合后产生变构，激活了蛋白激酶的活性，可使细胞内靶蛋白的酪氨酸发生磷酸化，进一步触发由细胞质到细胞核的一系列信号传递反应。核内调控蛋白接受从细胞质经一系列反应传来的增殖信号后，才能变构而被激活，与基因组中特定的调控序列发生相互作用，开动一组与细胞增殖调控有关的特定基因的转录，首先刺激fos、jun、myc等早期反应基因的表达，并在这些转录因子的作用下，激激活周期蛋白与周期蛋白依赖性激酶活周期蛋白与周期蛋白依赖性激酶 2021/7/27 星期二21 的基因表达，合成与细胞周期调控体系有关的的基因表达，合成与细胞周期调控体系有关的蛋白，调控细胞周期的进
23、行。蛋白，调控细胞周期的进行。下面介绍几种主要的生长因子及受体下面介绍几种主要的生长因子及受体:(一一)表皮生长因子表皮生长因子 EGF是一种含有是一种含有53个氨基酸残基的多肽。个氨基酸残基的多肽。EGF分子内有对维持其生物活性必需的分子内有对维持其生物活性必需的3个二个二硫键，当用巯基乙醇或尿素还原二硫键后，硫键，当用巯基乙醇或尿素还原二硫键后，EGF活性就会丧失。活性就会丧失。EGF主要分布于人的尿液、主要分布于人的尿液、乳汁和血浆中。作为一种作用很强的促细乳汁和血浆中。作为一种作用很强的促细 胞分裂因子，胞分裂因子，EGF能刺激多种组织细胞在体内能刺激多种组织细胞在体内和体外的分裂和增
24、殖。和体外的分裂和增殖。EGF是通过位于细胞膜是通过位于细胞膜上的受体而发挥其生物学效应的。上的受体而发挥其生物学效应的。EGF受体受体 2021/7/27 星期二22 (EGFR)是具有内在的酪氨酸激酶活性的跨膜糖是具有内在的酪氨酸激酶活性的跨膜糖蛋白，蛋白，EGFR的分布较广泛，来源于内、中、外三的分布较广泛，来源于内、中、外三个胚层的细胞均有个胚层的细胞均有EGFR表达。表达。EGF与与EGFR结合结合后形成复合物，通过细胞内吞进入细胞，在细胞内后形成复合物，通过细胞内吞进入细胞，在细胞内EGF最终被溶酶体降解，最终被溶酶体降解，EGFR在与在与EGF解离后被解离后被送回质膜表面重新利用
25、送回质膜表面重新利用。(二二)血小板衍化生长因子血小板衍化生长因子 血小板衍化生长因子血小板衍化生长因子(plateletderived growth factor，PDGF)来源于血小板，由含二硫键的二聚来源于血小板，由含二硫键的二聚体组成，体组成，PDGF也是一种较强的促有丝分裂因子。也是一种较强的促有丝分裂因子。2021/7/27 星期二23 PDGF以启动性生长因子的身份，刺激静以启动性生长因子的身份，刺激静止细胞进入对推进因子敏感的状态，离开止细胞进入对推进因子敏感的状态，离开G0期期进入生长周期。反转录病毒的转化基因进入生长周期。反转录病毒的转化基因v-sis的的产物产物P28V-
26、sis蛋白质氨基酸的顺序与蛋白质氨基酸的顺序与PDGF的的链同源，这说明癌基因可能通过编码生长因子链同源，这说明癌基因可能通过编码生长因子参与细胞增殖调控。参与细胞增殖调控。PDGF也是通过与细胞表面的特异性受体结合也是通过与细胞表面的特异性受体结合发挥作用的。发挥作用的。PDGF受体受体(PDGFR)是具有酪氨酸是具有酪氨酸激酶活性的跨膜糖蛋白，通过与激酶活性的跨膜糖蛋白，通过与PDGF结合被结合被活化，发挥多种生理活性。活化，发挥多种生理活性。2021/7/27 星期二24(三三)转化生长因子转化生长因子转化生长因子转化生长因子(transforming growth factor，FGF
27、)是一组诱导非瘤细胞表达转化表型的多肽是一组诱导非瘤细胞表达转化表型的多肽类物质。类物质。FGF中最主要的有中最主要的有TGF-和和TGF-两两大类。大类。TGF-在结构上与在结构上与EGF相关，生物学特相关，生物学特性非常相似。性非常相似。TGF-和和EGF都能与都能与EGFR结合，结合，结合后均可活化结合后均可活化EGFR的蛋白激酶活性并诱导的蛋白激酶活性并诱导受体对信号传导链下游的调节作用。受体对信号传导链下游的调节作用。TGF-不与不与EGFR结合，其受体是含二硫键的结合，其受体是含二硫键的糖基化复合物。糖基化复合物。TGF-的转化活性需的转化活性需EGF或或TGF-的协同。的协同。T
28、GF-对于各种肿瘤细胞。对于各种肿瘤细胞。2021/7/27 星期二25 如上皮细胞、胚胎成纤维细胞及大鼠的原代培如上皮细胞、胚胎成纤维细胞及大鼠的原代培养均为一种抑制增殖作用。因此，养均为一种抑制增殖作用。因此，TGF-可能可能主要是参与抑制细胞增殖。对细胞生长起负调主要是参与抑制细胞增殖。对细胞生长起负调节作用。节作用。(四四)抑抑 素素 抑素抑素(chalone)是与生长因子作用相反的、是与生长因子作用相反的、具有组织特异性的内源性、生理性生长抑制因具有组织特异性的内源性、生理性生长抑制因子，其作用有组织或细胞特异性，而无种属特子，其作用有组织或细胞特异性，而无种属特异性。对细胞无毒性，
29、仅使细胞增殖阻滞于细异性。对细胞无毒性，仅使细胞增殖阻滞于细胞周期某一时相，作用消失后，细胞增殖可被胞周期某一时相，作用消失后，细胞增殖可被逆转。逆转。2021/7/27 星期二26 抑素是肽类、蛋白质或与糖结合的复合体，水抑素是肽类、蛋白质或与糖结合的复合体，水溶性，存在于组织细胞和血清内。溶性，存在于组织细胞和血清内。目前确定的抑素有表皮细胞抑素、肝细胞抑素、目前确定的抑素有表皮细胞抑素、肝细胞抑素、红细胞抑素、中性粒细胞抑素、淋巴细红细胞抑素、中性粒细胞抑素、淋巴细 胞抑素等。各种抑素的分子量和理化性质不同，胞抑素等。各种抑素的分子量和理化性质不同，其分子水平的作用尚不清楚。目前认为其分
30、子水平的作用尚不清楚。目前认为 抑素主要作用于抑素主要作用于G1S期，阻止细胞进入期，阻止细胞进入S期的期的称为称为G1抑素或抑素或S因子，阻止细胞进入因子，阻止细胞进入M期的称期的称为为G2抑素或抑素或M因子。因子。2021/7/27 星期二27二、周期蛋白与周期蛋白依赖性激酶二、周期蛋白与周期蛋白依赖性激酶对细胞周期的调控对细胞周期的调控(一一)周期蛋白与周期蛋白依赖性激酶周期蛋白与周期蛋白依赖性激酶 过去人们一直认为细胞周期受核的控制，过去人们一直认为细胞周期受核的控制，细胞质的活动是被动的。但研究发现，细胞质细胞质的活动是被动的。但研究发现，细胞质中存在有调节细胞周期的因子，其活动不完
31、全中存在有调节细胞周期的因子，其活动不完全受细胞核的控制，这种因子被称为有丝分裂促受细胞核的控制，这种因子被称为有丝分裂促进因子进因子(mitosis promoting factor，MPF)。MPF由两种蛋白分子组成，一种是由两种蛋白分子组成，一种是“周期周期蛋白蛋白”(cyclin)，另一组分是具有蛋白激酶活，另一组分是具有蛋白激酶活性的性的 催化亚单位，催化亚单位，由于此激酶的活性依赖于和周期由于此激酶的活性依赖于和周期 2021/7/27 星期二28 蛋白结合，又称为周期蛋白依赖性蛋白激酶蛋白结合，又称为周期蛋白依赖性蛋白激酶(cyclindependent kinase，CDK)。
32、已发现的周期蛋白有已发现的周期蛋白有10多种，如酵母细胞多种，如酵母细胞中的中的Clnl、Cln2、Cln3及哺乳动物细胞中的及哺乳动物细胞中的Cyclin A、B、C、D、E、F、H等。依据它等。依据它们在细胞周期中调控阶段的不同分别归人们在细胞周期中调控阶段的不同分别归人G1期周期素和期周期素和M期周期蛋白。期周期蛋白。在周期蛋白分子在周期蛋白分子中都含有一段高度保守的氨基酸序列，它是中都含有一段高度保守的氨基酸序列，它是与与CDK互相结合的关键区，称互相结合的关键区，称“周期蛋白盒周期蛋白盒”(cyclin box)。周期蛋白周期性地合成、与。周期蛋白周期性地合成、与CDK结合、降解，起
33、到了对细胞周期的调节结合、降解，起到了对细胞周期的调节作用。作用。2021/7/27 星期二29CDK是具有蛋白激酶活性的催化亚单位。目前已发现6种CDK。CDK与细胞分裂周期(cell division cycle，cdc)基因cdc2编码产物p34cdc具有同源性。与周期蛋白结合的p34cdc的活性还受其他某些特异性的激酶和磷酸酶的调控。包括Cdc2(CDKl)、CDK2、CDK3、CDK4、CDK5和CDK6，它们分别对细胞G1-S期和G2-M期的过渡进行调控。2021/7/27 星期二30 当细胞进入当细胞进入G2期后，期后，M期期cyclin逐渐增加，逐渐增加，并与并与CDK形成无活
34、性形成无活性MPF复合物，在其他复合物，在其他激酶和磷酸酶的磷酸化和去磷酸化作用下，激酶和磷酸酶的磷酸化和去磷酸化作用下，转变为转变为MPF。通过。通过MPF对这两类酶的正反馈对这两类酶的正反馈调节作用，不断加速调节作用，不断加速MPF的产生。当的产生。当MPF增增加到相当高的浓度时就引发一系列变化。加到相当高的浓度时就引发一系列变化。(二二)细胞周期蛋白对细胞周期的调控细胞周期蛋白对细胞周期的调控1.G1期周期蛋白期周期蛋白 正常情况下，哺乳动物体内细胞的正常情况下，哺乳动物体内细胞的G1期期后期具有一个控制样的限制点，称为后期具有一个控制样的限制点，称为G1控制控制点。点。人类细胞在人类细
35、胞在G-期表达期表达3种周期蛋白：种周期蛋白：2021/7/27 星期二31 Cyclin C、D和和E。处于。处于Go期的细胞受生长因期的细胞受生长因子刺激后，首先表达子刺激后，首先表达C、D型周期蛋白，再表型周期蛋白，再表达达E型周期蛋白，然后进入型周期蛋白，然后进入DNA合成期。合成期。Cyclin C的水平在的水平在G0期稍有增加，在细胞周期稍有增加，在细胞周期的其他时期内波动很小。期的其他时期内波动很小。Cyclin D在不断增殖的细胞中的水平波动不在不断增殖的细胞中的水平波动不明显。明显。Cyclin D的表达对生长因子有明显的依的表达对生长因子有明显的依赖性。在赖性。在G0早期，
36、早期，D型周期素开始表达，并与型周期素开始表达，并与CDK4为主的数种激酶结合，在细胞由为主的数种激酶结合，在细胞由Go期进期进入入Gl的过程中起重要作用。如果抑制的过程中起重要作用。如果抑制Cyclin D在在G0期的表达，细胞将不能进入期的表达，细胞将不能进入s期。期。2021/7/27 星期二32 Cyclin E的表达时间比的表达时间比Cyclin D晚，在细胞内晚，在细胞内呈周期性表达，峰值在呈周期性表达，峰值在G1-S过渡点，在控制细过渡点，在控制细胞由胞由G1期进人期进人S期起限速作用。当人类期起限速作用。当人类Cyclin E在人包皮成纤维细胞中稳定地过渡表达时，可以在人包皮成
37、纤维细胞中稳定地过渡表达时，可以缩短被转染细胞的缩短被转染细胞的G1间期，细胞在较小的状态间期，细胞在较小的状态通过通过G1-S期过渡点，并可减少由期过渡点，并可减少由G1向向S期过渡时期过渡时血清的需要量，而血清的需要量，而Cyclin E在周期中产生的时间在周期中产生的时间并未改变；但是，由于细胞提前进入并未改变；但是，由于细胞提前进入S期，影响期，影响了为复制了为复制DNA所需要的因子的积累，缩短的所需要的因子的积累，缩短的G1期的时间由延长期的时间由延长s期和期和G2期得以补差平衡。由此期得以补差平衡。由此可见，可见，Cyclin E的合成程度是细胞的合成程度是细胞G1-S过渡的限过渡
38、的限制因素。制因素。2021/7/27 星期二332S期和期和M期的周期蛋白期的周期蛋白(1)Cyclin A和和Cyclin B。Cyclin A的合成早于的合成早于Cyclin B，它的合成起始接近于，它的合成起始接近于Gl-S期过渡点，期过渡点，并在间期就进入细胞核内。破坏并在间期就进入细胞核内。破坏Cyclin A的功的功能将抑制染色体的复制。能将抑制染色体的复制。CyclinB的合成起始的合成起始于于S期，在期，在G2-M期过渡中逐渐增加，直至有丝期过渡中逐渐增加，直至有丝分裂中期和后期之间发生骤然降解。分裂中期和后期之间发生骤然降解。而且，而且，Cyclin B在核膜破裂前才进入细
39、胞核内。在核膜破裂前才进入细胞核内。Cyclin A和和Cyclin B分别与分别与CDK2和和CDKl相结相结合，使细胞从合，使细胞从G2期进入期进入M期。期。2021/7/27 星期二34(2)Cyclin H。Cyclin H与一种与与一种与CDK相关的相关的激酶激酶M01 5相结合，相结合，M015-Cyclin H复合物能增复合物能增强强CDK2-Cyclin A的激酶活性。因此，与其他的激酶活性。因此，与其他已知的已知的CDKCyclin复合物不同，复合物不同，MOl5一一Cyclin H复合物不是细胞周期次级反应中的有复合物不是细胞周期次级反应中的有关成分，而是中心调控体系本身，
40、提示细胞周关成分，而是中心调控体系本身，提示细胞周期中心调控机制中存在期中心调控机制中存在CyclinCDK的级联反的级联反应。应。2021/7/27 星期二352021/7/27 星期二362021/7/27 星期二372021/7/27 星期二38 第三节第三节 细胞增殖与肿瘤细胞增殖与肿瘤 人类肿瘤的发生与癌基因激活和抑癌基人类肿瘤的发生与癌基因激活和抑癌基因失活有关。目前发现，癌基因和抑癌基因因失活有关。目前发现，癌基因和抑癌基因作用的归结点在于对细胞周期的调控。作用的归结点在于对细胞周期的调控。肿瘤细胞周期的调控多表现为起正调肿瘤细胞周期的调控多表现为起正调控作用的控作用的Cycli
41、nCyclin过度表达，而发挥负调控作过度表达，而发挥负调控作用的抑制因子用的抑制因子CKICKI却常常失活。如在多数恶却常常失活。如在多数恶性肿瘤中都有性肿瘤中都有Cyclin D Cyclin D 的过度表达或的过度表达或/和和P21P21、P27P27低表达。低表达。细胞周期的监测点异常也可能导致细胞周期细胞周期的监测点异常也可能导致细胞周期紊乱而癌变。特别是约半数以上恶性肿瘤中紊乱而癌变。特别是约半数以上恶性肿瘤中有分子警察有分子警察P53P53的突变。的突变。2021/7/27 星期二39 第四节第四节 细胞增殖常用的检查方法细胞增殖常用的检查方法 1.1.细胞核分裂计数细胞核分裂计
42、数核分裂象是细胞周期中惟一可以用形态学方法识核分裂象是细胞周期中惟一可以用形态学方法识别的时期，在普通光学显微镜下即能够进行。别的时期，在普通光学显微镜下即能够进行。Baak提出核分裂的识别标准的为：核膜消失；提出核分裂的识别标准的为：核膜消失；在核分裂中央缺乏透明区；核分裂象两侧或外周在核分裂中央缺乏透明区；核分裂象两侧或外周可见毛发样突起；胞浆嗜碱性。可见毛发样突起；胞浆嗜碱性。核分裂计数有高倍视野法核分裂计数有高倍视野法(high power fields，HPF)和核分裂指数法和核分裂指数法(mitotic index，MI)。2021/7/27 星期二40 高倍视野法高倍视野法 在高
43、倍在高倍(400)下，随机下，随机选择多个视野选择多个视野(10)，分别观察并计数，分别观察并计数其中的核分裂象，然后计算出每个其中的核分裂象，然后计算出每个HPF中核分裂象的平均值。由于不同型号的中核分裂象的平均值。由于不同型号的显微镜显微镜HPF的面积太小可能存在一定差的面积太小可能存在一定差异，且所测细胞的大小不同，单位面积异，且所测细胞的大小不同，单位面积内的细胞数亦不相同，该方法存在结果内的细胞数亦不相同，该方法存在结果可比性和重复性较差的问题。可比性和重复性较差的问题。2021/7/27 星期二41核分裂指数法核分裂指数法:在目镜上加一单线状标尺，在目镜上加一单线状标尺，计数高倍计
44、数高倍(400)视野下与标尺相交的细胞视野下与标尺相交的细胞数数(n)，该视野内细胞总数，该视野内细胞总数A=(n2)2。计。计数数10个高倍视野，其中第个高倍视野，其中第1、5、10视野按上视野按上述公式计算，述公式计算，3个视野细胞数之和除以个视野细胞数之和除以3，乘，乘以以10，则为，则为10个视野的细胞总数。以个视野的细胞总数。以10个高个高倍视野的核分裂象数除以细胞总数，求得倍视野的核分裂象数除以细胞总数，求得MI值。值。2021/7/27 星期二422021/7/27 星期二432021/7/27 星期二442021/7/27 星期二45在不同肿瘤中，核分裂数多少的意义是不一样的。
45、如：在不同肿瘤中，核分裂数多少的意义是不一样的。如：胃肠道平滑肌肿瘤：胃肠道平滑肌肿瘤：5/10HPF5/10HPF；良性或潜在恶性；良性或潜在恶性5/10HPF5/10HPF：恶性：恶性子宫平滑肌肿瘤：子宫平滑肌肿瘤：10/10HPF+10/10HPF+异型性异型性+肿瘤性坏死：恶性肿瘤性坏死：恶性10/10HPF10/10HPF、无异型性、无坏死：潜在恶性、无异型性、无坏死：潜在恶性胃肠道间质瘤：胃肠道间质瘤：5/50HPF+5/50HPF+肿瘤肿瘤5cm5cm：恶性：恶性2021/7/27 星期二462.DNA2.DNA合成情况的检测合成情况的检测直接反映处于直接反映处于S S期细胞的多
46、少。期细胞的多少。可通过测定标记的可通过测定标记的DNADNA前体物质，如前体物质，如3 3H-H-去去氧胸腺嘧啶核苷，或核苷酸类似物质氧胸腺嘧啶核苷，或核苷酸类似物质5-5-溴溴-2-2脱氧尿苷脱氧尿苷（Bromodeoxyoridine,BrdU),Bromodeoxyoridine,BrdU),应用放射应用放射自显影、免疫组化或闪烁测定仪、流式自显影、免疫组化或闪烁测定仪、流式细胞仪定性或定量测定标记的细胞术。细胞仪定性或定量测定标记的细胞术。2021/7/27 星期二473H标记胸腺嘧啶脱氧核苷掺人标记技术标记胸腺嘧啶脱氧核苷掺人标记技术 3H标记胸腺嘧啶脱氧核苷掺人标记技术标记胸腺嘧
47、啶脱氧核苷掺人标记技术(thymidine labeling,3H-TdR)由由Johnson等于等于1961年首次建立，是显示年首次建立，是显示s期细胞的经典方法。期细胞的经典方法。用活细胞或新鲜组织与用活细胞或新鲜组织与3H标记胸腺嘧啶脱氧核标记胸腺嘧啶脱氧核苷孵育苷孵育12h，有，有DNA合成能力的合成能力的s期细胞将摄期细胞将摄人人3HTdR合成新的合成新的DNA，通过放射自显影显，通过放射自显影显示，可在显微镜下直接辨认示，可在显微镜下直接辨认s期细胞，计数全部期细胞，计数全部细胞中细胞中s期细胞的百分率作为胸腺嘧啶脱氧核苷期细胞的百分率作为胸腺嘧啶脱氧核苷标记指数标记指数(thym
48、idine labeling index，TLI)表示表示增殖活性。增殖活性。2021/7/27 星期二48操作步骤操作步骤 a.剪碎的无菌新鲜组织或体外培养细胞加入培剪碎的无菌新鲜组织或体外培养细胞加入培养基和养基和3H标记胸腺嘧啶脱氧核苷，在标记胸腺嘧啶脱氧核苷，在37的的CO2培养箱中培养培养箱中培养2h；b集组织和细胞，集组织和细胞，PBS清洗后，清洗后，10福尔马福尔马林固定，常规石蜡包埋切片；林固定，常规石蜡包埋切片；c.室内将脱蜡水化后的切片浸人感光乳胶，然室内将脱蜡水化后的切片浸人感光乳胶，然后在后在4的暗盒内曝光的暗盒内曝光3天；天；d.在暗室内放射自显影的切片在显影液中显影
49、，在暗室内放射自显影的切片在显影液中显影，然后在定影液中定影；然后在定影液中定影；e.切片经苏木素伊红染色；切片经苏木素伊红染色；f.计数计数20005000个细胞，计算阳性细胞的百个细胞，计算阳性细胞的百分率，求得分率，求得TLI。2021/7/27 星期二49应用应用:3H-TdR标记技术自建立以来，已得到标记技术自建立以来，已得到广泛应用。广泛应用。Iinden研究证实高研究证实高TLI与乳腺与乳腺癌术后早期复发、病理分型及临床亚型癌术后早期复发、病理分型及临床亚型有关，与其他预后指标相比，有关，与其他预后指标相比，TLI是最有是最有价值的。价值的。存在的问题存在的问题:TLI只显示只显
50、示s期细胞数量，而未显示期细胞数量，而未显示s期期长短，因而可能出现细胞增殖速度慢而长短，因而可能出现细胞增殖速度慢而TLI增高的情况增高的情况 2021/7/27 星期二50由于肿瘤生长的异质性，对肿瘤组织取由于肿瘤生长的异质性，对肿瘤组织取材的代表性不够亦会造成结果偏差；观材的代表性不够亦会造成结果偏差；观察者的经验、计数细胞的多少、组织的察者的经验、计数细胞的多少、组织的新鲜程度以及放射性同位素的活性均可新鲜程度以及放射性同位素的活性均可影响结果的可靠性；需要新鲜组织及放影响结果的可靠性；需要新鲜组织及放射性同位素是射性同位素是TLI应用受限的主要原因。应用受限的主要原因。2021/7/