基因表达调控2.ppt

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1、7.2 7.2 外源基因在真核外源基因在真核细胞中的表达细胞中的表达酵母菌、植物原生质体、动物培养细胞等。酵母菌、植物原生质体、动物培养细胞等。真核或病毒启动子真核或病毒启动子 MCS PolyA信号信号 终止子终止子外源基因外源基因一、真核细胞基因克隆载体一、真核细胞基因克隆载体1酵母细胞酵母细胞克隆载体克隆载体3动物细胞动物细胞克隆载体克隆载体2植物细胞植物细胞克隆载体克隆载体1.酵母细胞克隆载体酵母细胞克隆载体 Dividing Saccharomyces cerevisiae(bakers yeast)cells 酵母是研究真核生物酵母是研究真核生物DNADNA的复制、重组、基因表的复

2、制、重组、基因表达以及调控过程等的理想材达以及调控过程等的理想材料，为此，也构建了许多人料，为此，也构建了许多人工质粒载体。工质粒载体。能在能在E.coli中克隆和扩增的中克隆和扩增的Ori。有大肠杆菌的选择标记有大肠杆菌的选择标记 （Ampr、Tetr）。有酵母的选择标记有酵母的选择标记 （Leu2+(亮氨酸亮氨酸)、His+、Ura3+(尿尿嘧啶)、Trp1+）有合适的克隆位点。有合适的克隆位点。1.11.11.11.1酵母细胞基因克隆载体共同特点：酵母细胞基因克隆载体共同特点：酵母细胞基因克隆载体共同特点：酵母细胞基因克隆载体共同特点：整合型载体整合型载体 YIp复制型载体复制型载体 Y

3、Rp附加体型载体附加体型载体 YEp1.21.2根据酵母细胞根据酵母细胞根据酵母细胞根据酵母细胞基因克隆载体基因克隆载体基因克隆载体基因克隆载体的质粒和复制的质粒和复制的质粒和复制的质粒和复制方式不同分类方式不同分类方式不同分类方式不同分类 由大肠杆菌质粒和酵由大肠杆菌质粒和酵母的母的DNA片断（选择标记）片断（选择标记）构成。构成。ColE1 酵母酵母Leu 2+如如 PYeleu10:（1）整合型载体）整合型载体YIp(yeast integrating plasmid)(yeast integrating plasmid)特特 点：点：转化率低（转化率低（1-101-10转化子转化子/微

4、克微克DNADNA）。）。不能在酵母细胞中自主复制不能在酵母细胞中自主复制 载体上只有细菌的复制区，没有酵母的自主复制区。整合到酵母的染色体上整合到酵母的染色体上 可与受体细胞的染色体DNA同源重组，随染色体一起复制 不能从酵母细胞中提取载体。不能从酵母细胞中提取载体。整合型载体整合型载体 YIp复制型载体复制型载体 YRp附加体型载体附加体型载体 YEp1.21.2根据酵母细胞根据酵母细胞根据酵母细胞根据酵母细胞基因克隆载体基因克隆载体基因克隆载体基因克隆载体的质粒和复制的质粒和复制的质粒和复制的质粒和复制方式不同分类方式不同分类方式不同分类方式不同分类 由大肠杆菌质粒和酵母的由大肠杆菌质粒

5、和酵母的DNA片断片断(选择标选择标记和酵母记和酵母DNA自主复制顺序自主复制顺序ARS(auto replication sequence）构成。构成。大肠杆菌质粒大肠杆菌质粒 酵母酵母ARS酵母选择标记酵母选择标记（2）复制型载体）复制型载体YRp (yeast replicating plasmid)(yeast replicating plasmid)n可以在两种截然不可以在两种截然不同的生物同的生物细胞中复胞中复制的制的载体称体称为穿梭穿梭载体体（shuttle vector）。）。n穿梭穿梭载体在基因工体在基因工程中广泛使用。程中广泛使用。特特 点：点：转化率高（转化率高（102-

6、103转化子转化子/微克微克DNA)。不稳定，容易丢失。不稳定，容易丢失。可从大肠杆菌和酵母中提取质粒。可从大肠杆菌和酵母中提取质粒。既能在大肠杆菌中复制，又能在酵母既能在大肠杆菌中复制，又能在酵母细胞中自主复制。细胞中自主复制。穿梭载体（穿梭载体（shuttle vector）在在YRp载体中插入酵母染色体的载体中插入酵母染色体的着丝粒区着丝粒区。YRp载体载体 酵母着丝粒酵母着丝粒着着丝粒粒载体体 YCp(yeastyeast centromerecentromere plasmid plasmid)特特 点：点：行为像染色体，能稳定遗传。行为像染色体，能稳定遗传。单拷贝存在。单拷贝存在。

7、不易从细胞中提取。不易从细胞中提取。整合型载体整合型载体 YIp复制型载体复制型载体 YRp附加体型载体附加体型载体 YEp1.21.2根据酵母细胞根据酵母细胞根据酵母细胞根据酵母细胞基因克隆载体基因克隆载体基因克隆载体基因克隆载体的质粒和复制的质粒和复制的质粒和复制的质粒和复制方式不同分类方式不同分类方式不同分类方式不同分类 由大肠杆菌质粒、由大肠杆菌质粒、酵母的内源质粒酵母的内源质粒（2 m质质粒）粒）及及酵母染色体酵母染色体DNA选择标记构成。选择标记构成。大肠杆菌质粒大肠杆菌质粒酵母选择标记酵母选择标记2 m质粒质粒（3）附加体型载体）附加体型载体YEp(yeast episomal

8、plasmid)(yeast episomal plasmid)2 m质粒：质粒：酵母的内源质粒，可酵母的内源质粒，可独立复制独立复制,长度是长度是2 m。含有自主复制起始区含有自主复制起始区ARS和和STB序列（使质粒在供体序列（使质粒在供体中维持稳定）。中维持稳定）。特特 点：点：很高的转化活性（很高的转化活性（103-105转化子转化子/微克微克DNA）.拷贝数多（拷贝数多（25-100分子分子/细胞）。细胞）。比比YRp稳定。稳定。如如pYF92:pBR3222 m酵母酵母his 3+（1）优点优点对其遗传学和生理学的研究比较深入。对其遗传学和生理学的研究比较深入。小量培养和大规模反应

9、器中都能生长。小量培养和大规模反应器中都能生长。已经分离出很强的启动子。已经分离出很强的启动子。有有翻译后的加工翻译后的加工。本身蛋白自然分泌很少，便于胞外蛋白的纯化。本身蛋白自然分泌很少，便于胞外蛋白的纯化。安全性高（安全性高（FDA确认的安全生物），不确认的安全生物），不 需要宿主的安全性检验。需要宿主的安全性检验。1.3 酵母表达系酵母表达系统的特点的特点 常常发生质粒丢失。常常发生质粒丢失。重组蛋白常常重组蛋白常常超糖基化超糖基化表达量普遍低。表达量普遍低。（2）缺点）缺点每个每个N-寡糖链上含有寡糖链上含有100多个甘露糖，多个甘露糖，分泌困难。分泌困难。正常的高甘露糖寡糖链上仅有正

10、常的高甘露糖寡糖链上仅有8-138-13个甘露糖。个甘露糖。分泌型蛋白有时会留在分泌型蛋白有时会留在壁膜壁膜间隙，间隙，诊断断试剂丙肝病毒蛋白丙肝病毒蛋白HIV-1抗原抗原种种类名称名称疫苗疫苗乙肝病毒表面抗原乙肝病毒表面抗原疟原虫原虫环子子孢子蛋白子蛋白HIV-1外壳蛋白外壳蛋白 表达外源基因的宿主菌主要包括啤酒酵母、巴斯表达外源基因的宿主菌主要包括啤酒酵母、巴斯德德毕赤酵母、乳酸克努赤酵母、乳酸克努维酵母和多型酵母和多型汉森酵母森酵母1.4 在酵母在酵母（啤酒酵母）（啤酒酵母）（啤酒酵母）（啤酒酵母）中表达的重中表达的重组蛋白蛋白人人类治治疗用蛋白用蛋白药物物上皮生上皮生长因子因子胰胰岛素

11、素类胰胰岛素生素生长因子因子血小板源生血小板源生长因子因子胰胰岛素前体素前体成成纤维细胞生胞生长因子因子集落刺激因子集落刺激因子 1抗胰蛋白抗胰蛋白酶凝血因子凝血因子VIIIa（1）细胞质内表达）细胞质内表达例：人例：人Cu/Zn-SOD在酵母中表达：在酵母中表达：超氧化物超氧化物H+H2O2H2O过氧化物酶过氧化物酶表达出的表达出的SOD修饰正确：修饰正确：起始氨基酸被切掉，起始氨基酸被切掉，第二个氨基酸丙氨酸也被乙酰化。第二个氨基酸丙氨酸也被乙酰化。SOD(超氧化物歧化酶超氧化物歧化酶)1.5 在啤酒酵母中表达外源蛋白的方式在啤酒酵母中表达外源蛋白的方式 宿主：宿主：亮氨酸合亮氨酸合成缺陷

12、型成缺陷型酵母。酵母。GAPD：甘油醛磷甘油醛磷酸脱氢酶酸脱氢酶（2）表达分泌型蛋白）表达分泌型蛋白n在啤酒酵母中，只有分泌型的蛋白质才能在啤酒酵母中，只有分泌型的蛋白质才能被糖基化。被糖基化。n需要糖基化的重组蛋白必须是分泌蛋白。需要糖基化的重组蛋白必须是分泌蛋白。方方 法：法：构建载体在重组蛋白的前面加一段编码在重组蛋白的前面加一段编码酵母菌交配类型因子酵母菌交配类型因子a1的前导肽，与重组蛋白的的前导肽，与重组蛋白的N端通过端通过Lys-Arg相连。相连。前导肽（前导肽（leader peptide）：）：蛋白质分泌到壁膜间隙时，酵母菌的蛋白质分泌到壁膜间隙时，酵母菌的内内切蛋白酶切蛋白

13、酶识别这个切点信号，把重组蛋识别这个切点信号，把重组蛋白正确切下来。白正确切下来。信号肽的切割：前导肽前导肽 Lys-Arg 重组蛋白（水蛭素）重组蛋白（水蛭素）内切蛋白酶内切蛋白酶（1 1）乙肝表面抗原在嗜甲烷酵母中表达乙肝表面抗原在嗜甲烷酵母中表达在大型发酵反应器中容易生长；在大型发酵反应器中容易生长；以甲醇作唯一的碳源和能源，成本低。以甲醇作唯一的碳源和能源，成本低。有甲醇时，表达的有甲醇时，表达的乙醇氧化酶乙醇氧化酶高达胞高达胞内总蛋白的内总蛋白的40%！嗜甲烷酵母（嗜甲烷酵母（Pichia pastoris）的特点）的特点 1.6 其它酵母表达系统其它酵母表达系统HBsAg:乙肝表面

14、抗原。可以作为疫苗。乙肝表面抗原。可以作为疫苗。Aox1：乙醇氧化酶基因乙醇氧化酶基因1启动子（受甲醇激活调控）。启动子（受甲醇激活调控）。His4：组氨酸合成所需的组氨酸脱氢酶基因。组氨酸合成所需的组氨酸脱氢酶基因。3-aox1：整合整合到特定染色体的到特定染色体的位点序列位点序列。表达载体（整合型）构建：表达载体（整合型）构建：诱导物：甲醇。诱导物：甲醇。产量：产量：9106剂疫苗剂疫苗/240L发发酵罐。酵罐。整合到染色体中（2 2）牛）牛溶菌酶溶菌酶C2C2在嗜甲醇酵母中的表达在嗜甲醇酵母中的表达作为饲料添加剂促作为饲料添加剂促进反刍动物消化。进反刍动物消化。产量产量：10L，200h

15、连续发酵产出连续发酵产出50g溶菌酶。溶菌酶。一、真核细胞基因克隆载体一、真核细胞基因克隆载体1酵母细胞酵母细胞克隆载体克隆载体3动物细胞动物细胞克隆载体克隆载体2植物细胞植物细胞克隆载体克隆载体根瘤根瘤Ti质粒粒:存在于能引起植物形成冠瘿瘤的土壤存在于能引起植物形成冠瘿瘤的土壤农杆菌中，诱导冠瘿瘤形成，又称肿瘤诱导农杆菌中，诱导冠瘿瘤形成，又称肿瘤诱导质粒质粒（tumor inducing plasmid）。）。2.植物细胞克隆载体植物细胞克隆载体Ti质粒质粒 环状双链环状双链DNA，1.5105-2.0105bp（185kb）(相当于细菌染色体的相当于细菌染色体的3%-5%）。）。（1）T

16、i质粒的粒的结构构 转移转移DNA，编码冠瘿碱的合成，能随机整合到编码冠瘿碱的合成，能随机整合到植物的染色体上。长度一般为植物的染色体上。长度一般为12-24kb，是，是Ti质粒质粒最重要的部分。最重要的部分。左边界左边界左边界左边界右边界右边界右边界右边界生长素生长素生长素生长素基因基因基因基因细胞分裂细胞分裂细胞分裂细胞分裂素基因素基因素基因素基因冠瘿碱冠瘿碱冠瘿碱冠瘿碱合成合成合成合成T-DNA（transfer-DNA）毒性基因毒性基因（vir）决定土壤农杆菌对植物的感染和决定土壤农杆菌对植物的感染和T-DNA的的转移，转移，进入和整合进入和整合。vir的产物能诱导的产物能诱导Ti质粒

17、产生质粒产生T-DNA区域的单链区域的单链拷贝。拷贝。单链单链拷贝从拷贝从Ti质粒脱离后，可与质粒脱离后，可与vir的产物的产物VIR D2蛋白结合，并在蛋白结合，并在VIR D4和和VIR B蛋白的帮助下蛋白的帮助下穿过农杆菌内膜、外膜、壁和植物细胞壁、细胞膜穿过农杆菌内膜、外膜、壁和植物细胞壁、细胞膜及核膜，最后整合到植物染色体上。及核膜，最后整合到植物染色体上。章鱼碱代谢基因和胭脂碱代谢基因：章鱼碱代谢基因和胭脂碱代谢基因：分别编码代谢这两种冠瘿碱的酶。维持农杆分别编码代谢这两种冠瘿碱的酶。维持农杆菌生长。菌生长。冠冠瘿碱代碱代谢基因基因 T-DNA两端各两端各25bp的重复序列的重复序

18、列,参与整合。参与整合。尤其是尤其是右边界右边界。左右边界：左右边界：主要是主要是裸子植物裸子植物和和双子叶被子植物双子叶被子植物、单子叶植物（少数，效果不佳）。单子叶植物（少数，效果不佳）。（1）能够自发地整合到植物的染色体上。）能够自发地整合到植物的染色体上。（2）能转化多种植物。）能转化多种植物。（3）有强启动子）有强启动子（2）Ti质粒粒转化的化的对象象（3）Ti质粒作为载体的可能性质粒作为载体的可能性T-DNA的冠瘿碱的冠瘿碱(opine)合成酶基因上有一个合成酶基因上有一个强启动子，能启动外源基因的表达。强启动子，能启动外源基因的表达。（1）分子量太大（）分子量太大（200kb）！

19、）！（2）限制性酶切位点太多。）限制性酶切位点太多。（3）被转化的植物细胞成为肿瘤，不能）被转化的植物细胞成为肿瘤，不能 再分化。再分化。（4）在大肠杆菌中不能复制。）在大肠杆菌中不能复制。（4）天然天然Ti质粒作粒作载体的缺点体的缺点（1）保留）保留T-DNA的转移功能部分（的转移功能部分（vir基因，基因，左右边界左右边界）。）。（2）减少限制性酶切位点，引入）减少限制性酶切位点，引入单一插入位点单一插入位点（3）取消）取消T-DNA的致瘤基因，使被转化的植的致瘤基因，使被转化的植 物细胞不再成为肿瘤，能正常物细胞不再成为肿瘤，能正常分化分化。（4）冠瘿碱合成对于植物无意义，应剔除掉。）冠

20、瘿碱合成对于植物无意义，应剔除掉。（5）加入大肠杆菌的加入大肠杆菌的ori和选择标记和选择标记。（6）加上真核生物的）加上真核生物的转录信号转录信号和和结束信号结束信号以以 及及添加添加polyA的信号序列的信号序列。（5）Ti质粒的改造粒的改造改造后的Ti质粒载体模式LeftRightMCSAMProriVirSelectPA200kb转移转移（6）Ti载体的体的类型型共整合共整合载体体（cointegratecointegrate vectors vectors）最早获得广泛应用的最早获得广泛应用的Ti质粒是比利时科学质粒是比利时科学家家P.Zambrisky等等1983年改造的年改造的p

21、GV3850。用用pBR322部分代替了部分代替了T-DNA。pGV3850LeftRightpBR322Ti plasmid pGV3850的特点的特点：需要需要同源重组同源重组才能插入外源基因。才能插入外源基因。外源基因不能直外源基因不能直接插入，需要借接插入，需要借助于助于pBR322质粒质粒作为中间载体。作为中间载体。1）农杆菌选择标记）农杆菌选择标记 中间载体中间载体pBR322上的上的卡那霉素抗性卡那霉素抗性（Kanr）基因。）基因。2）最）最终受体植物的受体植物的选择标记 卡那霉素抗性卡那霉素抗性（Kanr）基因（卡那霉）基因（卡那霉素对植物有剧毒！）素对植物有剧毒！）位于位于T

22、-DNA右半部分的右半部分的胭脂碱合成酶胭脂碱合成酶基因（基因（nos）。）。选择标记外源基因插入外源基因插入pGV3850的的过程程同源重同源重组pGV3850pBR322insertkanrpBR322LeftRightTi plasmid重组重组pGV3850LeftRightTi plasmidkanrInsert表达表达过程程外源基因外源基因Kanr pBR322土壤农杆菌土壤农杆菌含含pGV3850植物组织植物组织卡那霉素筛选卡那霉素筛选胭脂碱筛选胭脂碱筛选抗卡那霉素抗卡那霉素的土壤农杆菌的土壤农杆菌外源基因外源基因表达鉴定表达鉴定转化转化插入插入感染感染pBR322与与pGV38

23、50重组重组整合到整合到染色体上染色体上转化后可化后可诱导愈愈伤组织分化成分化成转基因植物基因植物双元双元载体体（binary vectorsbinary vectors）既有大肠杆菌复制起点也有农杆菌复制起点，是个既有大肠杆菌复制起点也有农杆菌复制起点，是个穿梭载体穿梭载体。用表达元件代替了用表达元件代替了T-DNA、冠瘿碱代冠瘿碱代谢基因、并剔除谢基因、并剔除vir基因基因。双元载体的结构双元载体的结构Ti的精髓：的精髓：Vir基因（转移）和左右界（整合）基因（转移）和左右界（整合）大幅度减小质粒的体积。（大幅度减小质粒的体积。（10kb）所以，所以，删除除Vir就需要有一个帮助就需要有一

24、个帮助质粒粒 Binary vector植物选标记植物选标记amprnos启启A.oriE.oriR35S启启TerPoly A MCSnos终终L植物的选择性标记：植物的选择性标记：双子叶植物用双子叶植物用卡那霉素卡那霉素，单子叶植物都具有卡那霉素，单子叶植物都具有卡那霉素的抗性，经常选择的抗性，经常选择潮霉素或膦丝菌素潮霉素或膦丝菌素。胭脂碱合成酶胭脂碱合成酶(NOS)启动子启动子 双元双元载体的体的转化化在大肠杆菌里操作。在大肠杆菌里操作。受体农杆菌内要求带有整套受体农杆菌内要求带有整套vir基因基因（但（但缺失缺失T-DNA及左右边界）的及左右边界）的“帮助质粒帮助质粒”提供提供vir

25、产物产物。1）基因插入）基因插入双元载体双元载体2）帮助质粒帮助质粒（helper plasmid）VirA.ori左左右右外源基因外源基因双元载体双元载体Vir帮助质粒帮助质粒农杆菌农杆菌Vir农杆菌农杆菌左左右右外源基因外源基因感染植物感染植物转化转化左左右右外源基因外源基因进入植物细胞核，进入植物细胞核，整合，表达整合，表达E.coli三三亲融合法融合法(triparentaltriparental mating)mating)三种菌混合培养，然后通过各自的抗菌素抗性标记三种菌混合培养，然后通过各自的抗菌素抗性标记,选择选择吸收了吸收了外源基因外源基因、左右界左右界、和、和Vir的农杆菌

26、。的农杆菌。含双元载体的大肠杆菌：含双元载体的大肠杆菌：含有含有外源基因外源基因和和左右边界左右边界。含有帮助质粒含有帮助质粒pRK2013的辅助细菌：的辅助细菌：含含vir基因基因。含有含有pAL4404的受体农杆菌的受体农杆菌LBA4404：三亲三亲能够帮助转移能够帮助转移RK2类质粒（双元载体）。类质粒（双元载体）。一、真核细胞基因克隆载体一、真核细胞基因克隆载体1酵母细胞酵母细胞克隆载体克隆载体3动物细胞动物细胞克隆载体克隆载体2植物细胞植物细胞克隆载体克隆载体常用的常用的SV40载体，是从猿猴空泡病毒载体，是从猿猴空泡病毒SV40（simian vacuolating virus40

27、）改改造而来的。造而来的。3.动物细胞基因克隆载体动物细胞基因克隆载体（1）SV40病毒病毒 20面体外壳：面体外壳：由由VP1、VP2和和VP3三三种病毒外壳蛋白构成。种病毒外壳蛋白构成。5243bp的环状双链。的环状双链。DNA：SV40病毒的病毒的结构构SV40感染和生存方式感染和生存方式SV40猿猴细胞猿猴细胞细胞裂解细胞裂解释放释放SV40啮齿类细胞啮齿类细胞细胞癌变细胞癌变SV40DNA整合整合到寄主染色体上到寄主染色体上permissivenonpermissive允许病毒复制允许病毒复制不允许病毒复制不允许病毒复制T-抗原（抗原（Tumor antigen）:SV40 DNA的

28、复制的复制SV40编码的蛋白。编码的蛋白。功能是在功能是在SV40 DNA复制的时候复制的时候解开解开DNA双链双链。早期表达区：早期表达区：编码大编码大T抗原抗原（控制（控制DNA复制）和小复制）和小t抗原。抗原。晚期表达区：晚期表达区：在在DNA复制一段时间后复制一段时间后表达，产物是表达，产物是VP1、VP2和和VP3三种外壳蛋白三种外壳蛋白。SV40病毒的病毒的转录和翻和翻译对非受纳细胞（对非受纳细胞（non permissive cells），），只有只有T 抗原表达，随后病毒基因组随机整合到宿抗原表达，随后病毒基因组随机整合到宿主染色体上。主染色体上。SV40病毒的整合病毒的整合整

29、合整合SV40有有严格的包装限制严格的包装限制。如果插入的外源基因。如果插入的外源基因过大，就无法包装。过大，就无法包装。SV40病毒的包装病毒的包装去掉一部分去掉一部分DNA(T抗原或者抗原或者VP基因）。基因）。助手型助手型SV40去掉去掉T抗原基因的病毒，抗原基因的病毒，保留晚期表达保留晚期表达启动子启动子。SV40基因基因组的改造的改造不能复制，但能不能复制，但能提供外壳蛋白提供外壳蛋白。这两种缺陷型病毒混合感染，才能互补。这两种缺陷型病毒混合感染，才能互补。既能使插入既能使插入SV40SV40的外源基因复制，又能的外源基因复制，又能使外源基因被包装进病毒颗粒，得以扩使外源基因被包装进

30、病毒颗粒，得以扩增。增。去掉去掉VP基因，插入基因，插入外源基因，保留早期表外源基因，保留早期表达启动子达启动子。不能包装，但能复制。不能包装，但能复制。重组型重组型SV40 包装重组型包装重组型SV40SV40提供重组提供重组DNA和和T抗原。抗原。助手型助手型SV40:提供提供VP外壳蛋白。外壳蛋白。重组型重组型SV40：提供提供T抗原，外抗原，外源源DNA。包装成的病毒颗粒包装成的病毒颗粒中，中，既有含外源基既有含外源基因的重组型因的重组型，又有，又有助手型助手型DNADNA。SV40混合混合转染染过程程感染细胞，整合感染细胞，整合 能够持久表达病毒能够持久表达病毒T抗原的特殊细胞系抗原

31、的特殊细胞系 用复制起点有缺陷的用复制起点有缺陷的SV40病毒侵染的猴病毒侵染的猴细胞株细胞株CV-1得到的。所以称得到的。所以称COS （CV-1，Origin,SV40）（2）COS细胞细胞病病毒不能复制，但能产生毒不能复制，但能产生T抗原。抗原。（类似重组型（类似重组型SV40）DNA整合整合到猴染色体上。所以到猴染色体上。所以COS细胞中只有细胞中只有T抗原，无游离的抗原，无游离的SV40DNA。COS细胞的特点：细胞的特点：有有SV40的的T抗原抗原。有利于有利于SV40来源的载体复制。来源的载体复制。利用利用COS细胞细胞扩增扩增外源外源基因基因基因工程总结基因工程总结目的基因的获得目的基因的获得载体的提纯载体的提纯重组载体的构建重组载体的构建(酶切酶切/连接）连接）转化转化/转染细胞的筛选转染细胞的筛选宿主细胞的转化宿主细胞的转化/转染转染宿主细胞的培养宿主细胞的培养目的基因的（诱导）表达目的基因的（诱导）表达谢谢！谢谢！