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1、 碱性磷酸酶染色（碱性磷酸酶染色（NAPNAP）目的目的 掌握卡氏偶氮偶联法测定中性粒细胞碱性磷酸酶染色的原理、掌握卡氏偶氮偶联法测定中性粒细胞碱性磷酸酶染色的原理、方法、注意事项和临床意义。方法、注意事项和临床意义。原理原理 中性粒细胞胞质中的碱性磷酸酶在中性粒细胞胞质中的碱性磷酸酶在pH9.6pH9.6的碱性条件下能水解的碱性条件下能水解磷酸萘酚，生成萘酚，后者与重氮盐偶联形成不溶性的有色磷酸萘酚，生成萘酚，后者与重氮盐偶联形成不溶性的有色沉淀定位于胞质中的酶活性处。重氮盐有多种，常用的有坚沉淀定位于胞质中的酶活性处。重氮盐有多种，常用的有坚牢蓝牢蓝RRRR、坚牢蓝、坚牢蓝BBBB、坚牢紫
2、酱等。、坚牢紫酱等。1.1.新鲜干燥的涂片用冷新鲜干燥的涂片用冷10%10%甲醛甲醇固定液固定甲醛甲醇固定液固定30s30s，流水轻轻冲洗，流水轻轻冲洗303060s60s，待干。，待干。2.2.把涂片浸入基质孵育液中，在室温把涂片浸入基质孵育液中，在室温(冬季放水浴箱冬季放水浴箱)下温育下温育101015min15min。3.3.流水冲洗流水冲洗1 1 2min2min，加苏木素染色液中复染，加苏木素染色液中复染5 58min8min，流水冲洗，待，流水冲洗，待干，镜检。干，镜检。4.4.结果判断胞质中出现紫黑色或棕红色颗粒为阳性。判断标准如下：结果判断胞质中出现紫黑色或棕红色颗粒为阳性。判
3、断标准如下：0 0分：胞质中无阳性染色颗粒。分：胞质中无阳性染色颗粒。1 1分：胞质中含少量颗粒或呈弥漫浅色。分：胞质中含少量颗粒或呈弥漫浅色。2 2分：胞质中含中等量的颗粒或呈弥漫着色。分：胞质中含中等量的颗粒或呈弥漫着色。3 3分：胞质中含较多颗粒或弥漫较深色。分：胞质中含较多颗粒或弥漫较深色。4 4分：胞质中充满粗大颗粒或弥漫深色。分：胞质中充满粗大颗粒或弥漫深色。5 5 计算阳性率和积分值。计算阳性率和积分值。方法步骤方法步骤1.磷酸萘酚盐和重氮试剂品种繁多，应根据基质选择相适磷酸萘酚盐和重氮试剂品种繁多，应根据基质选择相适应的重氮盐，坚牢蓝等重氮盐的质量好坏是本法成败的应的重氮盐，坚
4、牢蓝等重氮盐的质量好坏是本法成败的关键。关键。2.基质孵育液必须临用前新鲜配制，先应将血膜固定干燥基质孵育液必须临用前新鲜配制，先应将血膜固定干燥后，才开始配制基质液。后，才开始配制基质液。3.若无若无2-氨基氨基-2-甲基甲基-1,3-丙二醇，可用巴比妥缓冲液丙二醇，可用巴比妥缓冲液(pH9.2)或或0.2mol/L Tris缓冲液缓冲液(pH9.2)代替。代替。注意事项注意事项 临床上主要用于鉴别：临床上主要用于鉴别：1.慢性粒细胞白血病与类白血病反应：慢性粒细胞白血病与类白血病反应：慢性粒细胞白血病慢性粒细胞白血病(无继发性感染者无继发性感染者)时，时，NAP积分一般明显下降，积分一般明
5、显下降，积分常积分常13分，甚至为零分；类白血病反应时则显著增高，积分分，甚至为零分；类白血病反应时则显著增高，积分常常200分。分。2.阵发性睡眠性血红蛋白尿症与再生障碍性贫血：阵发性睡眠性血红蛋白尿症与再生障碍性贫血：阵发性睡眠性血红蛋白尿症常降低；再生障碍性贫血常增高，病阵发性睡眠性血红蛋白尿症常降低；再生障碍性贫血常增高，病情好转时，情好转时，NAP积分则可逐渐下降。积分则可逐渐下降。3.急性白血病的细胞类型：急性白血病的细胞类型：ALL增高，增高，AML下降。下降。临床意义临床意义 铁染色（铁染色（Iron stain）目的目的 掌握骨髓铁染色的原理、方法、注意事项及临床意义。掌握骨
6、髓铁染色的原理、方法、注意事项及临床意义。原理原理 骨髓小粒中的含铁血黄素称细胞外铁，其所含的三价铁骨髓小粒中的含铁血黄素称细胞外铁，其所含的三价铁经稀盐酸处理后而游离，并能与酸性亚铁氰化钾溶液发经稀盐酸处理后而游离，并能与酸性亚铁氰化钾溶液发生普鲁士蓝反应，生成蓝色亚铁氰化铁沉淀，定位于含生普鲁士蓝反应，生成蓝色亚铁氰化铁沉淀，定位于含铁的部位。细胞内铁也可用此法显示，根据反应的强弱铁的部位。细胞内铁也可用此法显示，根据反应的强弱可了解骨髓中铁的含量。可了解骨髓中铁的含量。1.1.干燥涂片用甲醇固定干燥涂片用甲醇固定10min10min，待干。，待干。2.2.玻片上滴满酸性亚铁氰化钾，玻片上
7、滴满酸性亚铁氰化钾，3737染色染色30min30min。3.3.用蒸馏水冲洗后用核固红染液复染用蒸馏水冲洗后用核固红染液复染101015min15min。4.4.流水冲洗，待干，镜检。流水冲洗，待干，镜检。5.5.结果判断结果判断 (1)(1)幼红细胞核呈鲜红色，胞质呈淡黄红色，铁粒呈蓝绿色。幼红细胞核呈鲜红色，胞质呈淡黄红色，铁粒呈蓝绿色。(2)(2)细胞外铁细胞外铁 用低倍镜观察涂片，特别是涂片尾部和髓粒附近，注用低倍镜观察涂片，特别是涂片尾部和髓粒附近，注 意翠蓝色颗粒的存在，可分五级标准。意翠蓝色颗粒的存在，可分五级标准。(3)(3)细胞内铁细胞内铁 用油镜计数用油镜计数100100
8、个中、晚幼红细胞，记录胞质中含有蓝个中、晚幼红细胞，记录胞质中含有蓝色铁颗粒的细胞色铁颗粒的细胞(铁粒幼细胞铁粒幼细胞)的百分率。根据细胞内铁颗粒的数目、的百分率。根据细胞内铁颗粒的数目、大小、染色深浅和颗粒分布的情况，将铁粒幼细胞分为四型。大小、染色深浅和颗粒分布的情况，将铁粒幼细胞分为四型。方法步骤方法步骤细胞外铁的划分标准细胞外铁的划分标准:(-)(-)：无颗粒。：无颗粒。(+)(+)：有少数铁颗粒或偶见铁小珠：有少数铁颗粒或偶见铁小珠(颗粒体积大于嗜酸性粒细胞的颗粒者颗粒体积大于嗜酸性粒细胞的颗粒者 称为铁小珠称为铁小珠)。(+)(+)：有较多的铁颗粒或小珠。：有较多的铁颗粒或小珠。(
9、+)(+)：有很多的铁颗粒、小珠和少数小块状。：有很多的铁颗粒、小珠和少数小块状。(+)(+)：有极多铁颗粒、小珠，并有很多的小块，密集成堆。：有极多铁颗粒、小珠，并有很多的小块，密集成堆。铁粒幼细胞划分：铁粒幼细胞划分：型：幼红细胞内含型：幼红细胞内含1 12 2个小铁颗粒。个小铁颗粒。型：幼红细胞内含型：幼红细胞内含3 35 5个小铁颗粒。个小铁颗粒。型：幼红细胞内含型：幼红细胞内含6 61010个小铁颗粒，或个小铁颗粒，或1-41-4个大铁颗粒。个大铁颗粒。型：幼红细胞内含型：幼红细胞内含1010个以上小铁颗粒，或个以上小铁颗粒，或5 5个以上大铁颗粒。个以上大铁颗粒。环形铁粒幼细胞：环
10、形铁粒幼细胞：是指幼红细胞含铁粒是指幼红细胞含铁粒6 6个，绕核个，绕核2/32/3以上者。以上者。1.1.玻片需经去铁处理玻片需经去铁处理 将新玻片用清洁液浸泡将新玻片用清洁液浸泡24h24h，取出后，取出后反复水洗浸入反复水洗浸入95%95%酒精中酒精中24h24h，晾干，再浸泡在，晾干，再浸泡在5%5%盐酸中盐酸中24h24h，用双蒸水反复浸洗玻片，取出烤干后备用。，用双蒸水反复浸洗玻片，取出烤干后备用。2.2.骨髓取材要满意，外铁一定要有骨髓碎块或颗粒，取材骨髓取材要满意，外铁一定要有骨髓碎块或颗粒，取材不佳时，往往影响结果。不佳时，往往影响结果。3.3.酸性亚铁氰化钾溶液须新鲜配制。
11、酸性亚铁氰化钾溶液须新鲜配制。注意事项注意事项1.鉴别缺铁性贫血和非缺铁性贫血：鉴别缺铁性贫血和非缺铁性贫血：IDA时骨髓细胞外铁显著减少或消失，时骨髓细胞外铁显著减少或消失，铁粒幼红细胞明显减少，所见铁粒细小色浅，且以铁粒幼红细胞明显减少，所见铁粒细小色浅，且以型为主，型为主，型极少见，型极少见，型以上不见。经铁剂治疗后细胞外铁及内铁可迅速增多，此检查是诊断型以上不见。经铁剂治疗后细胞外铁及内铁可迅速增多，此检查是诊断IDA及指导铁剂治疗的一种辅助方法；非及指导铁剂治疗的一种辅助方法；非IDA，如，如HA、MA、AA等病人的等病人的细胞外铁通常增高，内铁亦增高，以细胞外铁通常增高，内铁亦增高，以型、型、型为主，可以见到型为主，可以见到型，罕型，罕见见型。因此，有助于鉴别型。因此，有助于鉴别IDA与非与非IDA。2.用于诊断铁粒幼细胞性贫血：能找到数量不等的环形铁粒幼细胞，多见粗用于诊断铁粒幼细胞性贫血：能找到数量不等的环形铁粒幼细胞，多见粗颗粒的颗粒的型与型与型铁粒幼细胞。型铁粒幼细胞。3.用于诊断伴环形铁粒幼细胞增多的用于诊断伴环形铁粒幼细胞增多的MDS：骨髓中环形铁粒幼细胞：骨髓中环形铁粒幼细胞15%。临床意义临床意义