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1、常用生物化学检验技术常用生物化学检验技术光谱分析技术光谱分析技术电化学技术电化学技术电泳技术电泳技术层析技术层析技术离心技术离心技术自动生化分析技术自动生化分析技术1光谱分析光谱分析概念概念：利用物质具有吸收、发射或散：利用物质具有吸收、发射或散射光谱谱系的特点，对物质进行射光谱谱系的特点，对物质进行定性定性或定量或定量的分析方法的分析方法2u发射光谱发射光谱 火焰光度法、原子发射光谱法、荧光光谱法火焰光度法、原子发射光谱法、荧光光谱法u吸收光谱吸收光谱 紫外、可见光、红外光及原子吸收分光光度法紫外、可见光、红外光及原子吸收分光光度法u散光光谱散光光谱 比浊法比浊法光谱分析技术光谱分析技术34
2、567分光光度技术的基本原理分光光度技术的基本原理透光度与吸光度透光度与吸光度T=I/IOT%=T100%A=-lgT=-lg I/IO=lgIO/I8Lambert-Beer定律定律A=KLC适用用于可见光、紫外光、红外光和适用用于可见光、紫外光、红外光和均匀非散射的液体均匀非散射的液体（摩尔吸光系数）：摩尔吸光系数）：当液层厚度为当液层厚度为1 1cmcm，物质浓度为物质浓度为1 1mol/Lmol/L时时波长下的吸光度值波长下的吸光度值9分光光度计的基本结构分光光度计的基本结构光源光源单色器单色器比色杯比色杯检测器检测器显示器显示器10光光 源源v光源应在一定光谱区域内发射出连续光光源应
3、在一定光谱区域内发射出连续光谱，有足够强度和稳定性谱，有足够强度和稳定性v可见光分光光度计可见光分光光度计钨灯钨灯v紫外光光度计紫外光光度计氢灯氢灯11单单 色色 器器将将光源的复合光分散为单色光的装置光源的复合光分散为单色光的装置滤光片滤光片棱镜棱镜光栅光栅12 比比 色色 杯杯v玻璃或石英玻璃或石英v光径为光径为0.110cm,一般为一般为1cmv校准校准13 检检 测测 器器v光光信号转为电信号信号转为电信号v光电管及光电倍增管光电管及光电倍增管14 显显 示示 器器v检流检流计、微安表、记录器计、微安表、记录器 透光度和吸光度透光度和吸光度v数字显示器数字显示器 透光度和吸光度和浓度透
4、光度和吸光度和浓度15操作方法操作方法k开关开关打开比色池盖子打开比色池盖子20分钟预热分钟预热k选定预定波长选定预定波长k空白、校准或待测液放入比色池，空白置于光空白、校准或待测液放入比色池，空白置于光路中路中k开光于开光于T位，打开比色池盖子，粗、细调位，打开比色池盖子，粗、细调T为为0.0关上比色盖子，调关上比色盖子，调T为为100.0k开关于开关于A，用消光调零用消光调零k重复步骤重复步骤4和和5k将校准或待测液光路中测将校准或待测液光路中测A16分光光度技术的定量方法分光光度技术的定量方法标准曲线法标准曲线法 条件变应重新绘制条件变应重新绘制 标准品纯且准标准品纯且准 待测液吸光度超
5、过线性范围，应稀释再测待测液吸光度超过线性范围，应稀释再测 待测液与标准曲线条件相同待测液与标准曲线条件相同比较法比较法 CU=(AUCS)/AS17 火焰光度法火焰光度法(原子发射光谱原子发射光谱)v原理原理 标本原子（基态）标本原子（基态）激发态激发态释放光能释放光能不不同原子有不同特征光谱线同原子有不同特征光谱线浓度与发射光强浓度与发射光强度成正比度成正比v钠的特征谱线为钠的特征谱线为589nmv钾的特征谱线为钾的特征谱线为767nm18192021 溶液中带电粒子在直流电场溶液中带电粒子在直流电场中向电性相反电极移动的现象称中向电性相反电极移动的现象称为为电泳电泳。电电 泳泳22 利用
6、带电粒子在电场作用下利用带电粒子在电场作用下定向移动的特性，对混合物组分定向移动的特性，对混合物组分进行分离、纯化和测定的技术称进行分离、纯化和测定的技术称为为电泳技术电泳技术。电泳技术电泳技术23 COO-H C NH3+R COO-H C NH2 R COOH H C NH3+RH+H+OH-OH-pH=pIpHpI原理原理24人血清蛋白的等电点和电泳迁移率人血清蛋白的等电点和电泳迁移率 蛋白质蛋白质 等电点等电点 电泳迁移率电泳迁移率cm2.s-1.v-1 白蛋白白蛋白 4.84 5.910-5 球蛋白球蛋白 5.06 5.110-5 球蛋白球蛋白 5.06 4.110-5 球蛋白球蛋白
7、 5.12 2.810-5 球蛋白球蛋白 6.857.30 1.010-5 25 电泳迁移率电泳迁移率是带电粒子在单位是带电粒子在单位电场强度作用下的移动速度。电场强度作用下的移动速度。即反映带电粒子在每厘米降为即反映带电粒子在每厘米降为1 1伏特（伏特（V/cmV/cm）的电场强度下每秒钟的电场强度下每秒钟内移动的厘米数（内移动的厘米数（cm/scm/s）。）。26=V/E=(1/t)/E=1/tE=cm2/V.sv 为电泳迁移率，为电泳迁移率，vV V为粒子移动的速度（为粒子移动的速度（cm/scm/s），），即即1/1/t tvE E为电场强度（为电场强度（V/cmV/cm）vT T为时
8、间（秒）为时间（秒）v1 1为移动的距离（为移动的距离（cmcm）v 为蛋白质电泳的特征常数为蛋白质电泳的特征常数v 的单位为的单位为cmsvcmsv27 电泳速度（电泳速度（V V）与其电量（与其电量（Q Q）和和电场电场强度成正比，而与粒子的半径强度成正比，而与粒子的半径（r r）和介质粘度系数（和介质粘度系数（）成反比，成反比，即即 V=QE/6rV=QE/6r这样这样 =V/E=Q/6rV/E=Q/6r根据根据StokeStoke定律定律281 1、根据被分离的样品多少分为、根据被分离的样品多少分为 分析电泳分析电泳 制备电泳制备电泳2 2、根据电泳时电压的高低分为、根据电泳时电压的高
9、低分为 高压电泳高压电泳 （50 50 V/cmV/cm以上）以上）常压电泳常压电泳 （50 50 V/cmV/cm以下）以下）电泳的分类电泳的分类293 3、根据电泳媒介的不同分为、根据电泳媒介的不同分为 自由电泳自由电泳 （溶液）（溶液）区带电泳区带电泳 （支持介质）（支持介质）4 4、根据电泳系统是否均一分为、根据电泳系统是否均一分为 连续电泳连续电泳 不连续电泳不连续电泳30 影响电泳的因素影响电泳的因素1 1、分子的形状和性质分子的形状和性质2 2、电场强度、电场强度电场强度大，速度快，产热多，变性；电场强度大，速度快，产热多，变性；电场强度小，速度慢，产热少，区带模糊电场强度小，速
10、度慢，产热少，区带模糊31v组成成分组成成分pH pH pHpH与与pIpI比较，比较，4.5-9.0,4.5-9.0,正极正极pH pH 负极负极v离子强度离子强度离子强度越大，缓冲容量越大，离子强度越大，缓冲容量越大，pHpH越稳定，电越稳定，电泳速度越慢，标本扩散，产热多，蒸发快；泳速度越慢，标本扩散，产热多，蒸发快；0.05-0.10.05-0.1mol/Lmol/L3 3、缓冲液、缓冲液325 5、蒸发作用、蒸发作用6 6、样品、样品4 4、支持物、支持物v吸附作用吸附作用v电渗作用电渗作用33 电电 泳泳 仪仪 由由直流电源直流电源和和电泳槽电泳槽两部分组两部分组成。成。一、直流电
11、源一、直流电源 一般由交流电经过整流获得一般由交流电经过整流获得 恒压电源恒压电源 恒流电源恒流电源 恒功电源恒功电源34二、电泳槽二、电泳槽 盖盖 电极及电极室电极及电极室 支架支架35363738常用的区带电泳常用的区带电泳u滤纸电泳（滤纸电泳（PE已淘汰已淘汰）u醋酸纤维薄膜电泳（醋酸纤维薄膜电泳（CAE）u琼脂糖凝胶电泳（琼脂糖凝胶电泳（AGE）u聚丙烯酰胺凝胶电泳（聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）394041电泳区带的测定电泳区带的测定n区带区带染色染色 溴酚蓝、丽春红溴酚蓝、丽春红（蛋白质蛋白质）PMS-NBT系统系统 （同工酶同工酶）苏丹红、苏丹黑苏丹红、苏丹黑 （血浆脂蛋白血浆脂
12、蛋白）溴化乙啶溴化乙啶 （核酸核酸）42区带定量区带定量v光光密度扫描法密度扫描法v洗脱比色法洗脱比色法43SDS-SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳444546474849 不同的蛋白质具有不同的等电点，不同的蛋白质具有不同的等电点，利用具有线性利用具有线性pHpH梯度的电泳介质来分离梯度的电泳介质来分离等电点不同的蛋白质，这种电泳技术称等电点不同的蛋白质，这种电泳技术称为为等电聚焦电泳等电聚焦电泳。50进行等电聚焦电泳的条件进行等电聚焦电泳的条件1.1.有一个在电泳条件下基本稳定的、有一个在电泳条件下基本稳定的、重复性良好的重复性良好的pHpH梯度。梯度。2.2.有一个抗对流的电
13、泳材料。有一个抗对流的电泳材料。3.3.电泳后有适当的方法来鉴定电泳后有适当的方法来鉴定 分离的区带。分离的区带。51 双向电泳双向电泳是先把样品从一个方向是先把样品从一个方向进行电泳分离，接着再与其成进行电泳分离，接着再与其成9090方方向进行第二次电泳分离。向进行第二次电泳分离。第一次电泳以其电荷性质为基础；第一次电泳以其电荷性质为基础；第二次电泳则按分子量不同进行分离。第二次电泳则按分子量不同进行分离。52 转移电泳转移电泳是将凝胶电泳的高分辩是将凝胶电泳的高分辩率与放射标记或酶标记等免疫化学方率与放射标记或酶标记等免疫化学方法的高灵敏度结合起来的电泳技术。法的高灵敏度结合起来的电泳技术
14、。53545556 1.1.用凝胶电泳分离蛋白质或核酸用凝胶电泳分离蛋白质或核酸 2.2.用电泳的方法将已分离的蛋白质或用电泳的方法将已分离的蛋白质或 核酸转移到硝酸纤维膜或重氮苄氨核酸转移到硝酸纤维膜或重氮苄氨 基甲基纸上。基甲基纸上。3.3.鉴定纸上的蛋白质或核酸鉴定纸上的蛋白质或核酸 其方法步骤其方法步骤57层析技术层析技术v利用混合物中各组分的理化性质（吸附力、利用混合物中各组分的理化性质（吸附力、分子形状和大小、极性、亲和力、分配系数分子形状和大小、极性、亲和力、分配系数等）的差异，使各组分以不同程度分布在固等）的差异，使各组分以不同程度分布在固定相和流动相，从而以不同速度移动而分离。定相和流动相，从而以不同速度移动而分离。58纸纸层析层析比移值（比移值（Rf）=溶质谱溶质谱带中心移动距离带中心移动距离/流动流动相前沿移动的距离相前沿移动的距离59凝胶凝胶层析层析6061