电化学免疫传感器的应用.ppt

《电化学免疫传感器的应用.ppt》由会员分享，可在线阅读，更多相关《电化学免疫传感器的应用.ppt（32页珍藏版）》请在taowenge.com淘文阁网|工程机械CAD图纸|机械工程制图|CAD装配图下载|SolidWorks_CaTia_CAD_UG_PROE_设计图分享下载上搜索。

1、 分析化学专业分析化学专业 丁红红丁红红电化学免疫传感器的应用电化学免疫传感器的应用目录目录目录目录 1 1 1 1 前言前言前言前言 免疫分析免疫分析 电化学免疫分析电化学免疫分析2 2 2 2 电化学免疫传感器电化学免疫传感器电化学免疫传感器电化学免疫传感器 免疫传感器免疫传感器 电化学免疫传感器电化学免疫传感器3 3 3 3 发展及展望发展及展望发展及展望发展及展望前言前言前言前言 1.1.免疫分析免疫分析（ImmunoassayImmunoassay）概念概念 ：基于用抗体或抗原作为选择性化学试：基于用抗体或抗原作为选择性化学试剂以分析测定抗原或抗体及半抗原的分析方法。剂以分析测定抗原

2、或抗体及半抗原的分析方法。分子识别材料分子识别材料：抗原或抗体：抗原或抗体 分子识别基本原理：分子识别基本原理：AgAg十十AbAb AgAg AbAb 分类分类 放射性免疫分析（放射性免疫分析（RIARIA）酶联免疫分析酶联免疫分析 （ELISAELISA）发光免疫分析发光免疫分析 （LIALIA）电化学免疫分析（电化学免疫分析（ECIAECIA）电化学免疫分析法电化学免疫分析法电化学免疫分析法电化学免疫分析法 是将免疫技术与电化学检测相结合的一种分析方法是将免疫技术与电化学检测相结合的一种分析方法 19511951年，年，由由BreyerBreyer和和RadclifRadclif首次应用

3、，极谱法测定由偶氮标记首次应用，极谱法测定由偶氮标记的抗原的抗原 六七十年代后六七十年代后 电分析技术方法的发展：电分析技术方法的发展：液相色谱电化学分析液相色谱电化学分析 电化学流动注射分析电化学流动注射分析 微分脉冲伏安法微分脉冲伏安法 阳极溶出伏安法阳极溶出伏安法电化学免疫传感器电化学免疫传感器电化学免疫传感器电化学免疫传感器1 1 1 1 免疫传感器免疫传感器免疫传感器免疫传感器与测定抗原抗体反应有关的传感器与测定抗原抗体反应有关的传感器19901990年年HenryHenry等提出等提出 结构：感受器、转换器、结构：感受器、转换器、电子放大器。电子放大器。分类：电化学免疫传感器、光学

4、免疫传感器、压电免疫分类：电化学免疫传感器、光学免疫传感器、压电免疫传感器和传感器和SPRSPR型免疫传感器等。型免疫传感器等。2.2.2.2.电化学免疫传感器电化学免疫传感器电化学免疫传感器电化学免疫传感器 是一种将电化学分析方法与免疫学技术相结合而发展出来是一种将电化学分析方法与免疫学技术相结合而发展出来的具有快速、灵敏、选择性高、操作简便等特点的生物传的具有快速、灵敏、选择性高、操作简便等特点的生物传感器感器。根据根据20012001年的对生物传感器分类标准年的对生物传感器分类标准,电化学电化学免疫传感器是基于抗原免疫传感器是基于抗原 抗体反应的抗体反应的,可进行特异性的定量可进行特异性

5、的定量或半定量分析的自给式的集成器件或半定量分析的自给式的集成器件,其中抗原其中抗原/抗体是分子抗体是分子识别元件识别元件,且与电化学传感元件直接接触且与电化学传感元件直接接触,并通过传感元件并通过传感元件把某种或者某类化学物质浓度信号转变为相应的电信号。把某种或者某类化学物质浓度信号转变为相应的电信号。根据检测信号的不同根据检测信号的不同,电化学免疫传感器可分为电位型、电化学免疫传感器可分为电位型、电流型、电导型和电容型。电流型、电导型和电容型。2.1 2.1 电位型免疫传感器电位型免疫传感器 2.1.12.1.1 直接型电位免疫传感器直接型电位免疫传感器 原理原理 利用抗原或抗体在水溶液中

6、两性解离本身带电的特性利用抗原或抗体在水溶液中两性解离本身带电的特性,将其将其中一种固定在电极表面或膜上中一种固定在电极表面或膜上,当另一种与之结合形成抗原抗当另一种与之结合形成抗原抗体复合物时体复合物时,原有的膜电荷密度将发生改变原有的膜电荷密度将发生改变,从而引起膜的从而引起膜的DonnanDonnan 电位和离子迁移的变化电位和离子迁移的变化,最终导致膜电位改变。最终导致膜电位改变。参比电极抗原结合抗体的膜原理：先通过聚氯乙烯膜把抗体固定在金属电极上，然后用相应的抗原与之特异性结合抗体膜中的离子迁移移率随之发生变化，从而使电极上的膜电位也相应发生改变。膜电位的变化与待测物浓度之间存在对数

7、关系 应用应用 早期的研究者利用此原理测定了人血清中的梅毒抗体、人早期的研究者利用此原理测定了人血清中的梅毒抗体、人血清白蛋白血清白蛋白,并完成了血清鉴定并完成了血清鉴定 Yamamoto Yamamoto 等分别等分别将将HCGHCG抗原或其抗体固定在钛金属电极表抗原或其抗体固定在钛金属电极表面面,检测检测了了HCGHCG及其抗体及其抗体 国内学者彭图治等分别报道了对人国内学者彭图治等分别报道了对人CA15CA153 3、AFPAFP、IgGIgG、HBsAgHBsAg的直接检测的直接检测.（彭图治，祝方猛等（彭图治，祝方猛等.测定甲胎蛋白的非测定甲胎蛋白的非标记电位型免疫传感器标记电位型免

8、疫传感器.应用化学，应用化学，19981998，0101：47474949）2.1.22.1.2酶标记电位型免疫传感器酶标记电位型免疫传感器 将免疫化学的专一性和酶化学的灵敏性融为一体将免疫化学的专一性和酶化学的灵敏性融为一体,对低含量物对低含量物质的检测。质的检测。标记酶标记酶:辣根过氧化物酶、葡萄糖氧化酶、碱性磷酸酶和脲酶。辣根过氧化物酶、葡萄糖氧化酶、碱性磷酸酶和脲酶。酶标记传感器酶标记传感器(电位型或电流型电位型或电流型),),最后均可归结为最后均可归结为是对是对NADHNADH、苯酚、苯酚、O O2 2、H H22O O2 2、NHNH33及新近开发的电活性物质的检出。及新近开发的电

9、活性物质的检出。应用应用 GhindilisGhindilis报道了一种无介质反应体系。它用一种具有报道了一种无介质反应体系。它用一种具有电催化活性的生物催化剂电催化活性的生物催化剂(如乳糖酶如乳糖酶)来标记抗胰岛素来标记抗胰岛素抗体。与固定在电极上的胰岛素特异性结合，乳糖酶抗体。与固定在电极上的胰岛素特异性结合，乳糖酶催化电极上氧的电还原反应，从而使电极上电位增加，催化电极上氧的电还原反应，从而使电极上电位增加，其增加值与溶液中游离抗原其增加值与溶液中游离抗原(胰岛素胰岛素)浓度有比例关系。浓度有比例关系。检测胰岛素检测胰岛素,获得了很宽的线性范围获得了很宽的线性范围(300 mV)(300

10、 mV)（Direct Direct electron transfer catalyzed by enzymes:application for electron transfer catalyzed by enzymes:application for biosensor developmentJ .biosensor developmentJ .BiosensBiosens BioelectronBioelectron,2000 ,2000,28(2):84,28(2):848989）发展发展 敏感膜如敏感膜如PVC PVC 膜、醋酸纤维素膜、聚合物薄膜、蚕丝膜、醋酸纤维素膜、聚合物薄膜

11、、蚕丝膜膜,以及固定化技术、膜电极制备技术的提高以及固定化技术、膜电极制备技术的提高 离子选择电极离子选择电极(ISE(ISE）、）、pH pH 电极和气敏电极的发展电极和气敏电极的发展 不足之处不足之处 较低的信号较低的信号/噪声比噪声比;线性范围窄线性范围窄;与与ISEISE（离子选择电极）离子选择电极）相联系的免疫传感器不可避免相联系的免疫传感器不可避免地要受到其他离子的影响。地要受到其他离子的影响。电流型免疫传感器电流型免疫传感器电流型免疫传感器电流型免疫传感器概念概念 在恒定电压的情况下监测由于抗原抗体结合或继后反在恒定电压的情况下监测由于抗原抗体结合或继后反应中电流的变化应中电流的

12、变化分类分类 非酶标记电流型免疫传感器非酶标记电流型免疫传感器 酶标记电流型免疫传感器酶标记电流型免疫传感器2.2.12.2.12.2.12.2.1非酶标记电流型免疫传感器非酶标记电流型免疫传感器非酶标记电流型免疫传感器非酶标记电流型免疫传感器 标记的电活性物质：标记的电活性物质：Fe(CN)Fe(CN)6 6 3-3-/Fe(CN)/Fe(CN)3 3 4-4-、二茂铬铁、二茂铬铁、PbPb2+2+、ZnZn2+2+等等 主要是根据抗原和标记抗原对定量抗体进行竞争结合，主要是根据抗原和标记抗原对定量抗体进行竞争结合，而标记抗原与抗体结合后氧化或还原电流减少。而标记抗原与抗体结合后氧化或还原电

13、流减少。应用应用 二茂铁标记吗啡，以伏安免疫测定法，测定二茂铁二茂铁标记吗啡，以伏安免疫测定法，测定二茂铁吗啡结合物在抗吗啡抗体的存在与不存在时的氧化作吗啡结合物在抗吗啡抗体的存在与不存在时的氧化作用，在抗体存在时，由二茂铁用，在抗体存在时，由二茂铁吗啡结合物产生的氧吗啡结合物产生的氧化电流减少，这个结果构成对吗啡均相测定的依据。化电流减少，这个结果构成对吗啡均相测定的依据。使用的工作电位为使用的工作电位为500mv500mv，因此很容易使其他药物氧化，因此很容易使其他药物氧化，选择性欠佳。（孙宝元选择性欠佳。（孙宝元 杨宝清主编杨宝清主编.传感器及其应用传感器及其应用手册手册.北京：机械工业

14、出版社，北京：机械工业出版社，2004 2004：348348）刘志国用纳米金的优良吸附性能和褐藻酸钠的强负电性，刘志国用纳米金的优良吸附性能和褐藻酸钠的强负电性，将褐藻酸钠通过胱胺共价修饰到纳米金表面形成褐藻酸将褐藻酸钠通过胱胺共价修饰到纳米金表面形成褐藻酸钠钠-纳米金复合物（纳米金复合物（ASNASN）标记标记T3 T3 抗体（三碘甲状腺氨抗体（三碘甲状腺氨酸抗体酸抗体）；用为）；用为Fe(CN)Fe(CN)663-/4-3-/4-电化学探针，用循环伏安法电化学探针，用循环伏安法获取金电极表面微环境改变的电流信息来检测获取金电极表面微环境改变的电流信息来检测T3T3抗体，抗体，检测的线性范

15、围为检测的线性范围为100-1600ng/ml100-1600ng/ml，检出限为检出限为45ng/ml45ng/ml （基于褐藻酸钠基于褐藻酸钠-纳米金复合物作纳米金复合物作 非酶标记的新型电化非酶标记的新型电化学免疫传感器的研制学免疫传感器的研制.理化检验理化检验-化学分册，化学分册，20042004，40(840(8）:445-449:445-449）2.2.22.2.2酶标记电流型免疫传感器酶标记电流型免疫传感器2.2.22.2.2酶标记电流型免疫传感器酶标记电流型免疫传感器酶标记电流型免疫分析酶标记电流型免疫分析 原理原理：主要是竞争法和夹心法：主要是竞争法和夹心法 前者是用酶标抗原

16、与样品中的抗原竞争结合电极上的前者是用酶标抗原与样品中的抗原竞争结合电极上的抗体，催化氧化还原反应，产生电活性物质而引起电抗体，催化氧化还原反应，产生电活性物质而引起电流变化，从而可测得样品中抗原浓度。流变化，从而可测得样品中抗原浓度。后者则是在样品中的抗原与电极上的抗体结合后，再后者则是在样品中的抗原与电极上的抗体结合后，再加酶标抗体与样品中的抗原结合，形成夹心结构，从加酶标抗体与样品中的抗原结合，形成夹心结构，从而催化氧化还原反应产生电流值变化。而催化氧化还原反应产生电流值变化。电流型酶标记免疫传感器的工作原理电流型酶标记免疫传感器的工作原理 第一代酶标记电流型免疫传感器以非电活性物质第一

17、代酶标记电流型免疫传感器以非电活性物质如如O O22作为氧化还原的电子受体为代表。先用竞争法或夹心作为氧化还原的电子受体为代表。先用竞争法或夹心法葡萄糖氧化酶或过氧化物酶标记物结合到膜或电极法葡萄糖氧化酶或过氧化物酶标记物结合到膜或电极上上,再通过氧电极测量葡萄糖转化为葡萄糖酸中消耗的再通过氧电极测量葡萄糖转化为葡萄糖酸中消耗的氧氧,或过氧化氢分解中产生的氧。或过氧化氢分解中产生的氧。以过氧化氢酶作为标记酶来说明以过氧化氢酶作为标记酶来说明 其工作原理其工作原理(图图101056)56)：(1)(1)在在测测定定溶溶液液中中加加人人标标记记过过氧氧化化氢氢酶酶抗抗原原，然然后后将将抗抗体体膜膜

18、免免疫疫传传感感器器插插入入上上述述溶溶液液中中，未未标标记记抗抗原原(被被测测物物)和标记抗原与膜上的抗体发生竞争结合；和标记抗原与膜上的抗体发生竞争结合；(2)(2)洗去未反应的抗原；洗去未反应的抗原；(3)(3)将将传传感感器器插插人人测测定定酶酶活活性性的的溶溶液液中中，这这时时传传感感器显示的电流值是由测定液中溶存氧量决定的；器显示的电流值是由测定液中溶存氧量决定的；(4)(4)向向溶溶液液中中加加人人定定量量的的H H22O O22，结结合合在在膜膜上上的的过过氧氧化氢酶化氢酶使使H H22O O22分解产生分解产生O O2,2,传感器的电流值增大。传感器的电流值增大。(5)(5)

19、据据此此可可以以测测定定IgGIgG、HCGHCG、甲甲胎胎蛋蛋白白、茶茶碱碱和和胰胰岛素等。岛素等。易受样品溶解氧及pH的影响,工作电位较高,背景较差。虽然通入气体氩能有效消除溶解氧,但无形中又增添了许多麻烦。第二代酶标记电流型免疫传感器使用电活性物质替代分子第二代酶标记电流型免疫传感器使用电活性物质替代分子OO22,这这些电活性物质包括二茂铁衍生物、苯醌、氯醌、亚甲基蓝、血红些电活性物质包括二茂铁衍生物、苯醌、氯醌、亚甲基蓝、血红素等。素等。应用：应用：CianaCiana选择对羟基磷酸苯为碱性磷酸酶的底物选择对羟基磷酸苯为碱性磷酸酶的底物,结合结合FIA(FIA(流动注射流动注射分析分析

20、)使使AFP(-AFP(-甲胎蛋白甲胎蛋白)检测下限达到检测下限达到00.07 07 ngng/ml/ml。(CianaCiana L D,L D,BernaccaBernacca G,NittiG,Nitti C D,C D,et al.et al.Highly sensitive Highly sensitive amperometricamperometric enzyme immunoassay for enzyme immunoassay for-fetoprotein in fetoprotein in human serum J .J human serum J .J Immun

21、olImmunol Methods,1996,193(1):51-Methods,1996,193(1):51-62.)62.)优点优点 酶促反应放大，酶促反应放大，灵敏度高灵敏度高 不足不足 多次洗涤分离操作、多次洗涤分离操作、酶标容易失活、酶标容易失活、费时和重现性较差等费时和重现性较差等2.32.3电导型免疫传感器电导型免疫传感器电导型免疫传感器电导型免疫传感器 原理原理 化学反应产生或消耗的离子化学反应产生或消耗的离子,能使溶液的导电能能使溶液的导电能力发生改变。力发生改变。应用应用 19961996年年 YagiudaYagiuda用电导法测定了尿中的吗啡用电导法测定了尿中的吗啡.(

22、YagiudaYagiuda K,HemmiK,Hemmi A,Ito S,A,Ito S,et al.et al.Development of conductivityDevelopment of conductivity-based based immunosensorimmunosensor for sensitive detection of methamphetamine (stimulant for sensitive detection of methamphetamine (stimulant drug)in human urineJ .drug)in human urineJ

23、 .BiosensBiosens BioelectrionBioelectrion,1996,11(8):703,1996,11(8):703-707.)707.)20012001年年 DiiksmaDiiksma 用交流阻抗法测定了用交流阻抗法测定了干扰素干扰素,下下限达到限达到0 0.02 02 fgfg/ml/ml。(DiiksmaDiiksma M,M,KampKamp B,B,HoogvlietHoogvliet J C,J C,et et al.al.Development of an electrochemical Development of an electrochemica

24、l immunosensorimmunosensor for direct for direct detection of interferondetection of interferon-at the at the attomolarattomolar level J .Anal Chem,2001 level J .Anal Chem,2001,73(3):901,73(3):901-907)907)电导法易受被测样品离子强度和缓冲液容积的影响电导法易受被测样品离子强度和缓冲液容积的影响,并并且难以克服非特异吸附且难以克服非特异吸附determinationof MA in the co

25、ncentration range 1-10 g/ml was possible within about 15 min for each sample.determine the critical concentration(1 g/ml)of MA in human urine.电容型免疫传感器电容型免疫传感器电容型免疫传感器电容型免疫传感器 其信号转换器由一对处于流体环境的导电体组成。其信号转换器由一对处于流体环境的导电体组成。识别分子固定在电极上识别分子固定在电极上,相关检测物及液体的移动引起相关检测物及液体的移动引起介电常数的改变介电常数的改变,导致电容的变化。可以用于实时检测导致电

26、容的变化。可以用于实时检测免疫反应免疫反应 此类传感器的报道甚少。此类传感器的报道甚少。发展及展望发展及展望发展及展望发展及展望 发展发展 寻找更合适的固定方法和固定材料寻找更合适的固定方法和固定材料,探求更灵敏稳定的探求更灵敏稳定的标记系统和电活性物质标记系统和电活性物质,追求更完美的信号检出系统。追求更完美的信号检出系统。电极表面的设计是提高电极寿命并增强反应信号的重电极表面的设计是提高电极寿命并增强反应信号的重要因素要因素 原因：在免疫反应发生时，抗原和抗体的结合会导致原因：在免疫反应发生时，抗原和抗体的结合会导致工作电极表面微环境的改变，宏观上则表现为电流、工作电极表面微环境的改变，宏

27、观上则表现为电流、电压、电导率等电化学信息的变化电压、电导率等电化学信息的变化用戊二醛交联法在铂或银电极上固定IgG抗体,电位差E与抗原浓度C之间存在着良好的线性关系,回收率高,使用仪器装置简单,可重复使用（孙宝元 杨宝清主编.传感器及其应用手册.北京：机械工业出版社，2004：348）LouisLouis等在用巯基烷烃保护金电极减少杂蛋白的非特异吸附又不等在用巯基烷烃保护金电极减少杂蛋白的非特异吸附又不降低其导电能力的同时降低其导电能力的同时,用含巯基的硅烷作偶联剂将链霉亲合素用含巯基的硅烷作偶联剂将链霉亲合素定向固定在金电极表面的定向固定在金电极表面的SiO2 SiO2 层层,使之能够与生

28、物素化抗原精确使之能够与生物素化抗原精确结合结合,效果很好。效果很好。（TiefenauerTiefenauer L X,L X,KossekKossek S,S,PadestePadeste C,C,et al.et al.Towards Towards amperometricamperometric immunosensorimmunosensor devicesJ .devicesJ .BiosensBiosens BioelectronBioelectron,1997,12(3):213,1997,12(3):213223.223.）DiiksmaDiiksma指出指出,如果使用短链

29、的烷基硫醇效果更佳。如果使用短链的烷基硫醇效果更佳。(DiiksmaDiiksma M,M,KampKamp B,B,HoogvlietHoogvliet J C,J C,et al.et al.Development of an electrochemical Development of an electrochemical immunosensorimmunosensor for direct detection of interferonfor direct detection of interferon-at the at the attomolarattomolar level J

30、 .Anal Chem,2001,73 level J .Anal Chem,2001,73(3):901(3):901-907)907)LiuLiu用高氟磺化阳离子树脂处理玻碳圆盘电极用高氟磺化阳离子树脂处理玻碳圆盘电极,结合多聚苯胺结合多聚苯胺,偶偶联葡萄球菌蛋白联葡萄球菌蛋白A,A,定向固定兔定向固定兔IgGIgG,脲酶标记山羊抗兔脲酶标记山羊抗兔IgGIgG,对兔对兔IgGIgG的测定线性范围很宽的测定线性范围很宽(50(502 000 2 000 ngng/ml/ml）（Liu C H,Liu C H,LiaoLiao K T K T,Huang H J,Huang H J,Ampe

31、rometricAmperometric immunosensorsimmunosensors based on protein a coupled based on protein a coupled polyanilinepolyaniline22perfluorosulfonated perfluorosulfonated ionomerionomer composite electrodesJ .Anal Chem,2000 composite electrodesJ .Anal Chem,2000,72(13):2925,72(13):292529292929.）BLMBLM（双层类

32、脂膜）电化学免疫传感器是在修饰了双层双层类脂膜）电化学免疫传感器是在修饰了双层类脂膜的电极上嵌入抗体或它们相应的结合物类脂膜的电极上嵌入抗体或它们相应的结合物(抗原或抗原或半抗原半抗原)作为生物识别单元作为生物识别单元,双层类脂膜为配体双层类脂膜为配体-受受体提供了一个作用空间体提供了一个作用空间,并保持了抗体和抗原的生物并保持了抗体和抗原的生物活性活性 。（。（双层类脂膜电化学免疫传感器的研究及应用进展双层类脂膜电化学免疫传感器的研究及应用进展.分分析测试学报，析测试学报，20032003，2222（66）：）：108108112.112.）刘志国刘志国 基于褐藻酸钠基于褐藻酸钠纳米金复合物作非酶标记测定纳米金复合物作非酶标记测定T3T3抗体。（抗体。（基于褐藻酸钠基于褐藻酸钠-纳米金复合物作非酶标记的新型电化纳米金复合物作非酶标记的新型电化学免疫传感器的研制学免疫传感器的研制.理化检验理化检验-化学分册，化学分册，20042004，40(840(8）:445-:445-449449）展望展望展望展望 小型化小型化 适于非极性物质的检测适于非极性物质的检测 多系统优化组合多系统优化组合 实现多样品多组分自动化检测实现多样品多组分自动化检测感谢欣赏