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1、DNA/RNA的琼脂糖凝胶检测的琼脂糖凝胶检测 一、实验原理一、实验原理 电泳是现在用于分离和纯化DNA/RNA片段的最常用技术。当制备好的一块“胶”即一块包含电解质的多孔支持介质并把它置于静电场中，DNA/RNA分子将向阳极移动，这是因为DNA/RNA分子沿其双螺旋骨架两侧带有富含负电荷的磷酸根残基。当DNA/RNA长度增加时，来自凝胶的阻力就会增加，不同长度的DNA/RNA片段就会出现不同的迁移率。因而就可依据DNA/RNA分子的大小使其分离。分离长度分离长度凝胶电泳凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳200bp近近50kb 聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳 5500bp 分辨率高分辨
2、率高采用不同浓度的凝胶可以分辨范围广泛的采用不同浓度的凝胶可以分辨范围广泛的DNA分子分子。含不同量琼脂糖的凝胶的分离范围含不同量琼脂糖的凝胶的分离范围 凝胶中的琼脂糖含量%（W/V）DNA/RNA分子的分离范围（kb）0.35600.61200.70.8100.90.571.20.461.50.2320.12EB染料染料 溴化乙锭（溴化乙锭（EB）是一种吖啶类染料，它在紫外）是一种吖啶类染料，它在紫外灯照射下能发射荧光，当灯照射下能发射荧光，当DNA样品在琼脂糖凝样品在琼脂糖凝胶中电泳时，琼脂糖凝胶中的胶中电泳时，琼脂糖凝胶中的EB就插入就插入DNA分分子中形成荧光络合物，使子中形成荧光络合
3、物，使DNA发射的荧光增强发射的荧光增强几十倍，电泳后就可直接紫外灯照射下检测琼几十倍，电泳后就可直接紫外灯照射下检测琼脂糖中的脂糖中的DNA。电泳缓冲液的组成电泳缓冲液的组成 1.Tris乙酸（乙酸（TAE）2.Tris硼酸（硼酸（TBE）3.Tris磷酸（磷酸（TPE）其浓度约为其浓度约为50mmoL/L，PH为为7.57.8,这些缓冲液这些缓冲液均含有均含有EDTA。这些缓冲液通常配制成浓缩液，贮存。这些缓冲液通常配制成浓缩液，贮存于室温于室温。常用的电泳缓冲液的配制常用的电泳缓冲液的配制缓冲液缓冲液使用液使用液浓贮存液（每升）浓贮存液（每升）Tris乙酸乙酸（TAE）1：0.04moL
4、/L Tris乙酸乙酸 0.001moL/L EDTA 50：242g Tris碱碱57.7mL 冰乙酸冰乙酸100mL 0.5moL/L EDTA(PH8.0)Tris磷酸磷酸（TPE）1：0.09moL/L Tris磷酸磷酸 0.002moL/L EDTA10：108g Tris碱碱15.5mL 85%磷酸磷酸40mL 0.5moL/L EDTA(PH8.0)Tris硼酸硼酸（TBE）0.50.045moL/L Tris硼酸硼酸 0.001moL/L EDTA5：54g Tris碱碱27.5g硼酸硼酸20mL 0.5moL/L EDTA(PH8.0)加样缓冲液加样缓冲液 缓冲液类型缓冲液类
5、型 6缓冲液缓冲液贮存温度贮存温度I 0.25%溴酚蓝溴酚蓝 0.25%二甲苯青二甲苯青FF 40%（W/V）蔗糖水溶液）蔗糖水溶液4II 0.25%溴酚蓝溴酚蓝 0.25%二甲苯青二甲苯青FF 15%聚蔗糖水溶液聚蔗糖水溶液室温室温III 0.25%溴酚蓝溴酚蓝 0.25%二甲苯青二甲苯青FF 30%甘油水溶液甘油水溶液4IV 0.25%溴酚蓝溴酚蓝 40%（W/V蔗糖水溶液）蔗糖水溶液）4V（碱性加样缓冲液）（碱性加样缓冲液）300m moL/L NaoH 6 mmoL/L EDTA 18%聚蔗糖水溶液聚蔗糖水溶液 015%溴甲酚绿溴甲酚绿 025%二甲苯青二甲苯青FF4加样缓冲液可以增大
6、样品密度，以确保加样缓冲液可以增大样品密度，以确保DNA均匀进入均匀进入样品孔内，还可以使样品呈现颜色，从而使加样操作样品孔内，还可以使样品呈现颜色，从而使加样操作更为便利。更为便利。溴酚蓝在琼脂糖凝胶中移动的速率约为二甲苯青溴酚蓝在琼脂糖凝胶中移动的速率约为二甲苯青FF的的2.2倍倍,溴酚蓝在琼脂糖凝胶中移动的速率约与长溴酚蓝在琼脂糖凝胶中移动的速率约与长300bp的双链线性的双链线性DNA相同相同,而二甲苯青而二甲苯青FF在琼脂糖凝在琼脂糖凝胶中移动的速率则与胶中移动的速率则与4kb双链线性双链线性DNA相同。相同。DNA片段长度标记片段长度标记 DNA片段长度标记通常叫作 DNA Mar
7、ker,本实验使用Gene RulerTM DNA Ladder Mix 为DNA片段长度标记，分别由100bp、200 bp、300 bp、400 bp、500 bp、600 bp、700 bp、800 bp、900 bp、1031 bp、1200 bp、1500 bp、2000 bp、2500 bp、3000 bp、3500 bp、4000 bp、5000 bp、6000 bp、8000 bp、10000 bp 组成，DNA Marker不仅可以作为凝胶中DNA片段长度的一个标记，还可以作为电泳的对照。二、实验方法二、实验方法 150TAE的稀释：如的稀释：如制备制备50mL 1TAE，取
8、，取1mL 50TAE加入加入49mL水定容至水定容至50mL。2制备制备1%的琼脂糖胶液：的琼脂糖胶液：取取0.2g琼脂糖溶于琼脂糖溶于20mL TAE中，在短时间里加热中，在短时间里加热琼脂糖全部熔化，使溶液琼脂糖全部熔化，使溶液冷却至冷却至60.(加入浓度为加入浓度为10mg/mL的的EB 2L，使，使EB的终浓度为的终浓度为1g/mL)。3用于用于RNA电泳的电泳槽用去污剂洗干净，再用水冲洗，用电泳的电泳槽用去污剂洗干净，再用水冲洗，用乙醇干燥后灌满乙醇干燥后灌满3%的的H2O2溶液，于室温放置溶液，于室温放置10分钟，然后用分钟，然后用DEPCSDW冲洗电泳槽，梳子同样处理。冲洗电泳
9、槽，梳子同样处理。4用胶带封住胶床，放好梳子。用胶带封住胶床，放好梳子。5将温热琼脂糖倒入胶床中，凝胶的厚度在将温热琼脂糖倒入胶床中，凝胶的厚度在35mm之间，凝之间，凝固固2060min。6在凝胶完全凝固之后，小心移去梳子，将胶床放在电泳槽内，在凝胶完全凝固之后，小心移去梳子，将胶床放在电泳槽内，加样孔一侧靠近阴极（黑极）。加样孔一侧靠近阴极（黑极）。7向电泳槽中注入适量的向电泳槽中注入适量的TAE缓冲液，通常缓冲液高于胶面缓冲液，通常缓冲液高于胶面1cm。8分别将分别将DNA/RNA样品与加样缓冲液混合样品与加样缓冲液混合,用移液枪将样品加用移液枪将样品加入加样孔。入加样孔。9正确连接电泳
10、槽和电源，设定稳压为正确连接电泳槽和电源，设定稳压为75V，电流一般为，电流一般为50mA。10电泳结束后，在紫外观测仪上进行观察。电泳结束后，在紫外观测仪上进行观察。三、注意事项三、注意事项与实验技巧与实验技巧制胶和加样过程中要防治气泡的产生。制胶和加样过程中要防治气泡的产生。紫外光对人眼有害，观察时加盖玻璃罩，观察时间不宜太长。紫外光对人眼有害，观察时加盖玻璃罩，观察时间不宜太长。EB具有强诱变性，可致癌。必须戴手套操作，严格注意防护。具有强诱变性，可致癌。必须戴手套操作，严格注意防护。加样时，加样时，Tip头不宜插入样品孔太深，也不要穿破胶孔壁，否则头不宜插入样品孔太深，也不要穿破胶孔壁
11、，否则样品渗漏或样品渗漏或DNA带型不整齐。带型不整齐。配胶和灌电泳槽需使用同一批缓冲液。因为配胶和灌电泳槽需使用同一批缓冲液。因为pH 或离子强度很或离子强度很小的差别也会在凝胶前部造成紊乱，影响小的差别也会在凝胶前部造成紊乱，影响DNA 片段的泳动。片段的泳动。梳板的选用梳板的选用 一般每个制胶模具均配有多个齿型不同的梳板，梳一般每个制胶模具均配有多个齿型不同的梳板，梳齿宽厚，形成的点样容积较大，用于齿宽厚，形成的点样容积较大，用于DNA 片段回收实验等；相片段回收实验等；相反，梳齿窄而薄，形成的点样容积就较小，用于反，梳齿窄而薄，形成的点样容积就较小，用于PCR产物、酶产物、酶切产物鉴定
12、等。一般来说，上样量小时尽量选择薄的梳板制胶，切产物鉴定等。一般来说，上样量小时尽量选择薄的梳板制胶，此时电泳条带致密清晰，便于结果分析。此时电泳条带致密清晰，便于结果分析。四、跑出好看的电泳图四、跑出好看的电泳图凝胶一定要加热熔解完全，均匀，可以对着光亮的地方看看清凝胶一定要加热熔解完全，均匀，可以对着光亮的地方看看清澈不清澈澈不清澈；一般情况下，梳子越薄而长，条带越好看一般情况下，梳子越薄而长，条带越好看；上样量不宜过多，会造成条带的相互挤压；上样量不宜过多，会造成条带的相互挤压；如果点样孔多余，将样点到中间，尽量避免边缘效应如果点样孔多余，将样点到中间，尽量避免边缘效应，中间电中间电场比较均匀场比较均匀；做胶的缓冲液和跑胶的缓冲液浓度应该一致；做胶的缓冲液和跑胶的缓冲液浓度应该一致；加样时不要太快，让其自然沉底，均匀分布在电泳孔内加样时不要太快，让其自然沉底，均匀分布在电泳孔内；电泳开始时可以采用低电压使其跑出孔后，再调高电压。电泳开始时可以采用低电压使其跑出孔后，再调高电压。Thanks农药学