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1、实验四实验四DNA分子的体外连接分子的体外连接实验五实验五DNA连接产物的转化与重组子的筛选连接产物的转化与重组子的筛选在实验室一个在实验室一个重组重组DNA分子制作分子制作过程的基本步骤主过程的基本步骤主要包括要包括6个基本步个基本步骤，骤，酶切酶切制备制备DNA连接连接转化转化复制、筛选复制、筛选 一一.实验目的实验目的1.学习和掌握学习和掌握DNA体外连接的方法与操作步骤。体外连接的方法与操作步骤。2.学学习习和和掌掌握握连连接接产产物物DNA的的转转化化方方法法及及操操作作步步骤骤。二二.原理原理分子的体外连接分子的体外连接l分子的体外连接就是在一定条件下，分子的体外连接就是在一定条件
2、下，由连接酶催化两个双链片段由连接酶催化两个双链片段组邻的组邻的端磷酸与端磷酸与端羟基之间形成端羟基之间形成磷酸酯键的生物化学过程，磷酸酯键的生物化学过程，分子的分子的连接是在连接是在PCR反应获得互补序列基础上进反应获得互补序列基础上进行的。行的。质质粒粒必必须须通通过过转转化化，才才能能进进入入细细菌菌内内进进行行扩扩增增。转转化化效效率率的的高高低低与与受受体体菌菌的的生生理理状状态态有有关关。用用CaCl2处处理理细细菌菌可可以以提提高高细细菌菌吸吸收收周周围围环环境境中中的的DNA分分子子,这种状态的细菌被称为感受态细菌。这种状态的细菌被称为感受态细菌。冰冰冷冷条条件件下下，CaCl
3、2能能使使细细菌菌细细胞胞膨膨胀胀，细细胞胞壁壁通通透透性性增增强强，转转移移到到42下下进进行行短短暂暂热热刺刺激激，待待转转化的外源化的外源DNA便会被细胞所吸收。便会被细胞所吸收。决决定定细细菌菌转转化化效效率率（频频率率）的的因因素素有有：DNA的的浓浓度度、纯纯度度和和构构型型；转转化化细细胞胞的的生生长长状状态态；在在CaCl2处处理理和和储储藏藏之之后后的的存存活活率率以以及及转转化化的的环环境境条条件如：温度、件如：温度、pH值、离子浓度等。值、离子浓度等。互补法互补法l现在使用的许多载体（如系列）有含有现在使用的许多载体（如系列）有含有一个大肠杆菌的短区段，其中含有一个大肠杆
4、菌的短区段，其中含有半乳糖苷酸基因（半乳糖苷酸基因（lacZ）的调控序列和头）的调控序列和头个氨基酸偏码区。这个编码区中插入一个多个氨基酸偏码区。这个编码区中插入一个多克隆位点。克隆位点。半乳糖苷酶基因（半乳糖苷酶基因（lacZ和和lacZ）半乳糖苷酶基因有半乳糖苷酶基因有1021AAs，基因产物装配为四聚体后才有酶活。该基因产物装配为四聚体后才有酶活。该蛋白质可分为两部分：蛋白质可分为两部分：链和链和链。前者负责四聚体装配，后者具链。前者负责四聚体装配，后者具半乳糖苷半乳糖苷酶活性；只有当两者都存在时，才会表现出酶活性，该作用称之为酶活性；只有当两者都存在时，才会表现出酶活性，该作用称之为-
5、互补作用互补作用。这两个部分可独立存在，这两个部分可独立存在，分别由两个基因编码。为分别由两个基因编码。为链编码的基因称之为链编码的基因称之为lacZ(编码编码145AAs)。这两个基因（这两个基因（LacZ和和LacZ）均可作为标记基因。均可作为标记基因。lacZ（lacZ）中含有多克隆位点，当无外源中含有多克隆位点，当无外源DNA片段插入时，质粒表达片段插入时，质粒表达半乳糖苷酶的半乳糖苷酶的-肽，与缺失突变体宿主菌（不能编码肽，与缺失突变体宿主菌（不能编码-肽）表达的肽）表达的lacZ基基因产物（因产物（链）互补，产生有活性的链）互补，产生有活性的半乳糖苷酶，在含有指示剂半乳糖苷酶，在含
6、有指示剂X-gal和诱和诱导剂导剂IPTG的存在下，菌落呈现兰色；外源基因的插入后，破坏的存在下，菌落呈现兰色；外源基因的插入后，破坏了了lacZ-肽肽基基因的结构，细菌内不能产生因的结构，细菌内不能产生半乳糖苷酶活性，菌落呈白色。半乳糖苷酶活性，菌落呈白色。半乳糖苷酶基因的优点半乳糖苷酶基因的优点:a.酶催化酶催化X-Gal水解为兰色产物，检测直观水解为兰色产物，检测直观b.lacZ编码编码5-端可容许很大的变化（如加入多克隆位点）而不影响酶活性端可容许很大的变化（如加入多克隆位点）而不影响酶活性c.lacZ和和链基因的分别表达可使载体小而容量大链基因的分别表达可使载体小而容量大PLacZL
7、acZ转录转录 翻译翻译 LacZ基因的结构与产物基因的结构与产物利用利用LacZ基因筛选重组子基因筛选重组子plasmid DNAhost DH5LacZ-N端端LacZ-C端端-互补互补-半乳糖苷酶基因半乳糖苷酶基因三三.试剂与器材试剂与器材一一试剂试剂1LB培养基培养基:在在950ml水中加入水中加入:bacto-tryptone10gbacto-yeastextract5gNaCl10g用用5mol/LNaOH调调pH至至7.0加水至加水至1L,高压灭菌。高压灭菌。2.LB/Amp平板平板:在在950ml水中加入水中加入:bacto-tryptone10gbacto-yeastextr
8、act5gNaCl10g用用5mol/LNaOH调调pH至至7.0加加15g琼琼脂脂，加加水水至至1L,高高压压灭灭菌菌，冷冷却却至至50,加加氨苄青霉素至终浓度氨苄青霉素至终浓度60g/ml。3.IPTG储储存存液液：200mg/ml的的双双蒸蒸水水溶溶液液，用用0.22m的一次性滤器过滤除菌，的一次性滤器过滤除菌，-20保存。保存。4.X-gal储储存存液液：20mg/ml的的二二甲甲基基甲甲酰酰胺胺溶溶液，不必除菌，液，不必除菌，-20保存。保存。5.0.1mol/LCaCl2感受态细胞感受态细胞二二器材器材1.37温箱、水浴锅、恒温振荡器温箱、水浴锅、恒温振荡器2.高速冷冻离心机高速冷
9、冻离心机 四四.操作步骤操作步骤 1 1、DNADNA片段的连接片段的连接根据目的片段和载体大小，以等摩尔比（载体根据目的片段和载体大小，以等摩尔比（载体DNA：插入插入DNA片段片段=1:3 1:10）计算各自）计算各自DNA加样量加样量 连接体系：连接体系：组组分分体体积积目的片段（目的片段（GFP基因）基因）6 lT载载体体0.5 l10连连接接酶酶buffer1 lT4DNA连连接接酶酶0.1 lddH2O3 l合合计计10 l台式离心机离心台式离心机离心10秒以混合均匀，程序为秒以混合均匀，程序为:8 3 103012301430165183041(共共26个循环个循环)再再6530
10、1024h 2.感受态细胞的转化感受态细胞的转化(1)在在10 l连连接接反反应应物物中中取取10 l（50ng）加加于于200 l感感受受态态细细菌菌，冰冰浴浴中中放放置置30分分钟钟，同同时时设设对对照照：a:标标准准质质粒粒DNA；b:未未连连接接的的DNA产产物物;c:不加不加DNA的感受态细胞。的感受态细胞。(2)42热激热激90秒后，立即放回冰浴中。秒后，立即放回冰浴中。3-5分钟后补加分钟后补加LB液体（不加抗生素）液体（不加抗生素）800 l，于，于37振摇振摇45-60分钟。分钟。(3)事先将事先将35 lX-gal和和8 lIPTG均匀涂布于均匀涂布于一个一个LB(Amp+
11、)平板上平板上。(4)取取100l或或200l细细菌菌培培养养液液，直直接接涂涂布布于于此此含含60g/ml氨氨苄苄青青霉霉素素的的平平板板上上，于于37培培养养14-16小小时时，观观察察平平板板上上的的细细菌菌密密度度并并通通过过显显色色反反应应（白白色色菌菌落落），初初步步确确定定含含有有重重组组质质粒粒的的阳阳性性菌菌落落。一一般般来来说说，含含有有活活性性半半乳乳糖糖苷苷酶酶的的细细菌菌比比无无活活性性酶酶的的细细菌菌生生长长慢慢，故故过过夜夜培培养养后后可可见见到到毫毫米米大大小小的的阳阳性性白白色色菌菌落落而而阴阴性性的的兰兰色色菌菌落落只只有有针针尖尖大小。于大小。于4将平板放
12、置数小时使兰色充分显现。将平板放置数小时使兰色充分显现。(5)通过质粒通过质粒DNA提取鉴定重组子。提取鉴定重组子。五、注意事项五、注意事项1.1.-80-80冰冰箱箱储储存存的的感感受受态态细细胞胞在在5-65-6周周后后，转转化化率率很很低低。可可用用一一已已知知标标准准闭闭环环质质粒粒鉴鉴定定感感受受态态细细胞胞的转化能力。的转化能力。2.2.用用无无DNADNA转转化化物物的的感感受受态态细细菌菌铺铺板板，若若有有菌菌落落生生长，说明其中抗生素浓度不够或有杂菌污染。长，说明其中抗生素浓度不够或有杂菌污染。分子的体外连接分子的体外连接l分子的体外连接就是在一定条件下，分子的体外连接就是在
13、一定条件下，由连接酶催化两个双链片段由连接酶催化两个双链片段组邻的组邻的端磷酸与端磷酸与端羟基之间形成端羟基之间形成磷酸酯键的生物化学过程，磷酸酯键的生物化学过程，分子的分子的连接是在连接是在PCR反应获得互补序列基础上进反应获得互补序列基础上进行的。行的。四结果与分析讨论四结果与分析讨论计算转化率。计算转化率。根据转化率和阴性对照分析实验结果。根据转化率和阴性对照分析实验结果。问题与讨论：问题与讨论：根据本实验认为影响转化率的因素有哪根据本实验认为影响转化率的因素有哪些？些？抗性法筛选和互补筛选原理是什么？抗性法筛选和互补筛选原理是什么？问题与讨论：简述简述T4DNA连接酶作用机理。连接酶作用机理。简述一个完整外源简述一个完整外源DNA的克隆过程。的克隆过程。连接反应中应注意些什么问题及如何提连接反应中应注意些什么问题及如何提高连接效率。高连接效率。