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1、胚胚 胎胎 干干 细细 胞胞王王 锋锋 王王 子子 玉玉逸夫楼逸夫楼3084 84395381南京农业大学动物南京农业大学动物(dngw)胚胎工程技术中心胚胎工程技术中心动物胚胎动物胚胎(piti)工程之工程之第一页，共七十六页。内内 容容个体发生过程个体发生过程干细胞的概念干细胞的概念胚胎干细胞概念胚胎干细胞概念应用前景应用前景(qinjng)面临的问题及解决办法面临的问题及解决办法第二页，共七十六页。一一、个体发生过程、个体发生过程 受精受精 卵裂卵裂 受精后受精后72h 受精后受精后5-7天天精子精子+卵子卵子 合子合子 卵裂球卵裂球 桑椹胚桑椹胚 囊胚囊胚 滋养层滋养层胎盘及胎儿附属结
2、构胎盘及胎儿附属结构囊胚囊胚 内胚层内胚层消化道、呼吸道上皮和腺体；肝；胆；胰。消化道、呼吸道上皮和腺体；肝；胆；胰。内细胞群内细胞群 中胚层中胚层结缔组织；血液；肌肉；骨骼；泌尿生殖系统结缔组织；血液；肌肉；骨骼；泌尿生殖系统(shn zh x tn)外胚层外胚层体表结构；神经系统体表结构；神经系统第三页，共七十六页。第四页，共七十六页。囊囊 胚胚ICM第五页，共七十六页。第六页，共七十六页。二、干细胞的概念二、干细胞的概念(ginin)(ginin)1、干细胞：、干细胞：具有自我复制的能力，在一定条件下能分具有自我复制的能力，在一定条件下能分化成各种功能化成各种功能(gngnng)细胞。细
3、胞。第七页，共七十六页。2、分类、分类(fn li)（1）全能干细胞，包括：）全能干细胞，包括：胚胎干细胞（胚胎干细胞（embryonic stem cells,ES细胞）生殖干细胞（细胞）生殖干细胞（embryonic germ cells,EG细胞）细胞）具有全能性，能够分化成所有细胞类型，具有全能性，能够分化成所有细胞类型，进一步形成机体的任进一步形成机体的任何组织和器官。何组织和器官。（2）多能）多能(du nn)干细胞：具有分化成多种细胞和组织的潜能，干细胞：具有分化成多种细胞和组织的潜能，但却失去了发育成完整个体的能力。但却失去了发育成完整个体的能力。（3）专能干细胞：只能向一种或
4、密切相关的两种类型的细胞分）专能干细胞：只能向一种或密切相关的两种类型的细胞分化。化。第八页，共七十六页。第九页，共七十六页。干细胞是一种能够分裂成与自身一致的细胞或几种特殊分化干细胞是一种能够分裂成与自身一致的细胞或几种特殊分化的细胞型的细胞。的细胞型的细胞。动物体内干细胞的正常作用是在发育的过程中可提供动物体内干细胞的正常作用是在发育的过程中可提供(tgng)(tgng)不同的不同的细胞型细胞型,以生长成不同的组织和器官。它们也提供以生长成不同的组织和器官。它们也提供(tgng)(tgng)替代细胞替代细胞以修复身体不同部分的损伤。以修复身体不同部分的损伤。第十页，共七十六页。干细胞疗法就
5、是利用已特殊分化的干细胞干细胞疗法就是利用已特殊分化的干细胞,通过特殊的途径提供细胞去替代那些在退通过特殊的途径提供细胞去替代那些在退行性过程和损伤行性过程和损伤(snshng)(snshng)中失去的细胞。中失去的细胞。使用未分化干细胞也存在畸胎瘤和其他肿使用未分化干细胞也存在畸胎瘤和其他肿瘤形成的风险。瘤形成的风险。第十一页，共七十六页。目前人干细胞的主要来源或者潜在来源如下目前人干细胞的主要来源或者潜在来源如下:胚泡胚泡,可以提供多能干细胞可以提供多能干细胞;胎儿组织胎儿组织(zzh)(zzh),可以提供多能或者专能干细胞可以提供多能或者专能干细胞;脐带血脐带血,可以提供专能干细胞可以提
6、供专能干细胞;成人组织成人组织,可提供专能干细胞或单能干细胞。可提供专能干细胞或单能干细胞。第十二页，共七十六页。三、胚胎三、胚胎(piti)(piti)干细胞干细胞1 1、概念、概念胚胎干细胞胚胎干细胞(embryonic stem cells,ESC)(embryonic stem cells,ESC)是一种从早期胚胎是一种从早期胚胎内细胞团或原始生殖细胞经分离内细胞团或原始生殖细胞经分离(fnl)(fnl)、体外培养、克隆等得、体外培养、克隆等得到的具有发育全能性的细胞。到的具有发育全能性的细胞。ESES细胞可不断保持增殖而不分化且在连续培养后仍能具有发细胞可不断保持增殖而不分化且在连续
7、培养后仍能具有发育成三个胚层的潜能。育成三个胚层的潜能。这种细胞具有与早期胚胎相似的分化潜能和正常二倍体核型，这种细胞具有与早期胚胎相似的分化潜能和正常二倍体核型，因此兼有早期胚胎卵裂球及体细胞的某些特性。因此兼有早期胚胎卵裂球及体细胞的某些特性。第十三页，共七十六页。ESES细胞的全能性（细胞的全能性（totipotentytotipotenty），是指），是指ESES细胞在细胞在解除分化抑制的条件下能参与包括生殖腺在内的各解除分化抑制的条件下能参与包括生殖腺在内的各种组织的发育潜力，即种组织的发育潜力，即ESES细胞发育成完整动物体的细胞发育成完整动物体的能力能力。其实质是细胞基因组中决定
8、蛋白质编码的所有基。其实质是细胞基因组中决定蛋白质编码的所有基因按一定的时空顺序依次因按一定的时空顺序依次(yc)(yc)表达。表达。ESES细胞是能在体外大量增殖的全能性细胞细胞是能在体外大量增殖的全能性细胞，可以为细，可以为细胞的遗传操作和细胞分化研究提供丰富的实验材料。胞的遗传操作和细胞分化研究提供丰富的实验材料。第十四页，共七十六页。ESES细胞全能性的检测方法是以细胞全能性的检测方法是以胚胎干细胞进行细胞胚胎干细胞进行细胞核移植核移植。如果。如果ESES细胞能和去核的细胞融合发育成重构细胞能和去核的细胞融合发育成重构胚，而且经过胚胎移植，重构胚能发育形成胚，而且经过胚胎移植，重构胚能
9、发育形成(xngchng)(xngchng)个个体，则表明体，则表明ESES细胞具有全能性。细胞具有全能性。例如，将绵羊的类例如，将绵羊的类ESES细胞注射到去核卵母细胞中，细胞注射到去核卵母细胞中，获得重构胚。重构胚经过胚胎移植，有活的羔羊产获得重构胚。重构胚经过胚胎移植，有活的羔羊产生，证明了绵羊的类生，证明了绵羊的类ESES细胞具有发育全能性。细胞具有发育全能性。第十五页，共七十六页。2 2、ESES细胞细胞(xbo)(xbo)研究发展史研究发展史19811981年，英国剑桥大学的年，英国剑桥大学的EvansEvans和和KaufmanKaufman用囊胚内用囊胚内细胞团细胞团(ICM)
10、(ICM)建立小鼠建立小鼠ESES细胞系细胞系19981998年美国年美国ThomsonThomson从人的体外受精囊胚中分离得到了从人的体外受精囊胚中分离得到了ESES细胞。同年约翰霍普金斯大学的细胞。同年约翰霍普金斯大学的ShamblottShamblott等从人等从人的的PGCPGC细胞中分离得到人的全能性干细胞。细胞中分离得到人的全能性干细胞。人人ESES细胞的分离成功给人类的基因治疗和器官移植细胞的分离成功给人类的基因治疗和器官移植打下了基础。打下了基础。其他动物其他动物(dngw)(dngw)只获得了类只获得了类ESES细胞。细胞。第十六页，共七十六页。19991999年年1212
11、月，美国科学杂志公布了当年世界科学进展的评定结月，美国科学杂志公布了当年世界科学进展的评定结果，干细胞的研究成果列在举世瞩目耗资巨大的人类基因组工程之果，干细胞的研究成果列在举世瞩目耗资巨大的人类基因组工程之前，名列十大科学进展首位。前，名列十大科学进展首位。20022002年年3 3月，美国麻省理工学院的科学家宣布，他们首次利用人月，美国麻省理工学院的科学家宣布，他们首次利用人体胚胎干细胞培育出毛细血管，证明了胚胎干细胞技术在治疗体胚胎干细胞培育出毛细血管，证明了胚胎干细胞技术在治疗心血管疾病等领域的应用潜力。心血管疾病等领域的应用潜力。目前已有报导目前已有报导ESES细胞能在适当条件细胞能
12、在适当条件(tiojin)(tiojin)下分化为下分化为心肌细胞，心肌细胞，胰岛细胞，血管内皮细胞，肝细胞等。胰岛细胞，血管内皮细胞，肝细胞等。第十七页，共七十六页。1.1.衍生自囊胚的内细胞团或原始外胚层的细胞；衍生自囊胚的内细胞团或原始外胚层的细胞；2.2.永生化永生化(immortal)(immortal)；3.3.能维持稳定的正常的二倍体染色体结构能维持稳定的正常的二倍体染色体结构(jigu)(jigu)；4.4.有稳定的发育潜能，能被诱导增殖或分化；有稳定的发育潜能，能被诱导增殖或分化；5.5.能参与胎儿所有组织的发育过程；能参与胎儿所有组织的发育过程；3 3、胚胎、胚胎(piti
13、)(piti)干细胞的性质干细胞的性质第十八页，共七十六页。4 4、胚胎干细胞系的建立、胚胎干细胞系的建立(jinl)(jinl)过程过程4.1 概述概述(i sh)第十九页，共七十六页。第二十页，共七十六页。第二十一页，共七十六页。4.2 胚胎干细胞的分离胚胎干细胞的分离酶消化后培养酶消化后培养免疫免疫(miny)方法去处滋养层细胞方法去处滋养层细胞流式细胞仪分离法流式细胞仪分离法第二十二页，共七十六页。4.3 培养条件：培养条件：(1)特殊的培养液：用特殊的培养液：用DMEM培养液，其中胎牛血清培养液，其中胎牛血清的浓度的浓度(nngd)和质量很重要，加非必须氨基酸；和质量很重要，加非必须
14、氨基酸；-巯巯基乙醇。基乙醇。(2)以人或胚鼠的成纤维细胞为以人或胚鼠的成纤维细胞为饲养层细胞饲养层细胞。(3)必须加入必须加入LIF，抑制细胞分化。，抑制细胞分化。第二十三页，共七十六页。早期早期(zoq)(zoq)胚胎及胚胎及PGCsPGCs的培养的培养将早期将早期(zoq)(zoq)胚胎或胚胎或PGCsPGCs置于饲养层或条件培养基上，在置于饲养层或条件培养基上，在5%CO5%CO2 2、37373939度条件下进行培养。度条件下进行培养。培养液一般为培养液一般为DMEEM+15%FCSDMEEM+15%FCS。培养液中可添加多种。培养液中可添加多种细胞因子或分化抑制物，如细胞因子或分化
15、抑制物，如LIF.EGF.IGF.3-LIF.EGF.IGF.3-巯基巯基乙醇等。乙醇等。第二十四页，共七十六页。传传 代代进行体外培养进行体外培养(piyng)(piyng)时，当时，当ICMICM增殖后或增殖后或PGCsPGCs出现出现ESES样克样克隆后即可传代。隆后即可传代。ESCESC的增殖速度很快，小鼠的增殖速度很快，小鼠ESCESC每每7 78h8h倍倍增一次增一次;猪类猪类ESCESC每每20h20h倍增一次倍增一次;羊类羊类ESCESC，每，每404050h50h倍增倍增一次一次;牛类牛类ESCESC每每181824h24h倍增一次。倍增一次。传代时一般是用胰酶传代时一般是用
16、胰酶EDTAEDTA消化，再用微吸管或拨针将其打散消化，再用微吸管或拨针将其打散成单个细胞，然后移入新的饲养层上，培养几天后，即可出成单个细胞，然后移入新的饲养层上，培养几天后，即可出现新的克隆点，在其分化之前可以再进行传代。现新的克隆点，在其分化之前可以再进行传代。第二十五页，共七十六页。5.5.胚胎干细胞的鉴别胚胎干细胞的鉴别（1 1）细胞形态）细胞形态(xngti)(xngti)与结构与结构 ES ES细胞形态表现为胞体小、泡状、核大细胞形态表现为胞体小、泡状、核大(核质核质比高比高)、细胞聚集成集落生长、细胞聚集成集落生长（鸟巢状）、（鸟巢状）、细胞排列紧细胞排列紧密、无细胞界限、能连
17、续稳定传代且不分化。密、无细胞界限、能连续稳定传代且不分化。（2 2）细胞功能）细胞功能（3 3）细胞表面的特殊标志：）细胞表面的特殊标志：AKPAKP阳性阳性（4 4）细胞内特异基因的表达）细胞内特异基因的表达第二十六页，共七十六页。第二十七页，共七十六页。胚胎干细胞检测胚胎干细胞检测(jin c)(jin c)指标指标(1)(1)细胞内碱性磷酸酶活性高细胞内碱性磷酸酶活性高(2)(2)端粒酶活性高端粒酶活性高(3)(3)不被不被Hoechst33342 Hoechst33342 和和Rhodamine123Rhodamine123染色染色(4)(4)细胞膜表面有特殊细胞膜表面有特殊(tsh
18、)(tsh)的标记：的标记：SSEA-3,SSEA-4,SSEA-3,SSEA-4,TRA-1-60,TRA-1-81 TRA-1-60,TRA-1-81。(5)(5)能分化成三个胚层的细胞，将能分化成三个胚层的细胞，将胚胎干细胞植胚胎干细胞植 入免疫缺陷小鼠皮下可产生畸胎瘤入免疫缺陷小鼠皮下可产生畸胎瘤(6)(6)可诱导分化为各种成体干细胞可诱导分化为各种成体干细胞第二十八页，共七十六页。ICM细胞细胞 EG细胞细胞 来源来源 附置前早期胚胎附置前早期胚胎内细胞团内细胞团 早期胎儿生殖嵴早期胎儿生殖嵴原始生殖细胞原始生殖细胞 形态学形态学 直径一般为直径一般为1215m直径一般直径一般151
19、8m胰岛素样生长因胰岛素样生长因子受体子受体(Insulin-likereceptor,Igf2r)基因甲基化状态基因甲基化状态 印记基因印记基因Igf2r包包含含1个母系甲基化个母系甲基化位点和位点和1个父系非个父系非甲基化位点甲基化位点 印记基因印记基因Igf2r两两个位点均处于非个位点均处于非甲基化状态甲基化状态 体内分化体内分化 形成畸胎瘤形成畸胎瘤 不形成不形成 6.6.两种来源两种来源(liyun)(liyun)的的ESES细胞的区别细胞的区别第二十九页，共七十六页。7.ES细胞细胞(xbo)的诱导分的诱导分化化第三十页，共七十六页。第三十一页，共七十六页。干细胞诱导分化干细胞诱导
20、分化(fnhu)(fnhu)的常用方法的常用方法（1 1）加入诱导细胞分化的因子或化学物质，）加入诱导细胞分化的因子或化学物质，如如VGEFVGEF、bFGF bFGF、DMSODMSO和和RARA等等（2 2）将）将ESES细胞与特定的细胞共培养细胞与特定的细胞共培养 （3 3）将某种分化诱导因子的基因转入）将某种分化诱导因子的基因转入ESES细细 胞内胞内 第三十二页，共七十六页。四、四、ES细胞的应用细胞的应用(yngyng)前景前景胚胎干细胞（胚胎干细胞（ESES）成为当今生命科学和生物技术研究的热）成为当今生命科学和生物技术研究的热点。这与它具有点。这与它具有“发育发育(fy)(fy
21、)全能性全能性”的神奇功能密切相关。的神奇功能密切相关。干细胞是未分化的原始细胞。其中，全能干细胞能分干细胞是未分化的原始细胞。其中，全能干细胞能分化成人体化成人体200200多种细胞类型，形成机体的任何细胞、多种细胞类型，形成机体的任何细胞、组织和器官。组织和器官。第三十三页，共七十六页。倘能掌握其分化发育的规律，在人工条件下定向分倘能掌握其分化发育的规律，在人工条件下定向分化为所需的细胞、组织乃至器官，就可以用来化为所需的细胞、组织乃至器官，就可以用来治疗治疗目前目前(mqin)(mqin)还难以或无法治愈的帕金森氏病、早老性痴呆、还难以或无法治愈的帕金森氏病、早老性痴呆、白血病、糖尿病白
22、血病、糖尿病等顽症，并且解决十分紧缺的组织和等顽症，并且解决十分紧缺的组织和器官移植的来源问题器官移植的来源问题吗？吗？进一步，与克隆技术相结合，运用体细胞核转移技术来得进一步，与克隆技术相结合，运用体细胞核转移技术来得到到ESES，还能解决细胞治疗以及组织和器官移植的免疫排异，还能解决细胞治疗以及组织和器官移植的免疫排异难题。难题。第三十四页，共七十六页。1.1.胚胎胚胎(piti)(piti)干细胞研究的意义干细胞研究的意义 ES ES细胞特有的生物学特性细胞特有的生物学特性(txng)(txng),决定了其在生物学领域有决定了其在生物学领域有着不可估量的应用价值。着不可估量的应用价值。在
23、进行在进行ESES细胞建系和定向分化细胞建系和定向分化的同时的同时,以以ESES细胞为材料，在细胞为材料，在核移核移植、嵌合体、转基因动物植、嵌合体、转基因动物研究等方面也进行了广泛的尝试研究等方面也进行了广泛的尝试,已已经充分体现出经充分体现出ESES细胞在细胞在加快良种家畜繁育、生产转基因动物、哺加快良种家畜繁育、生产转基因动物、哺乳动物发育模型、基因和细胞治疗乳动物发育模型、基因和细胞治疗等方面有着广阔的应用前景。等方面有着广阔的应用前景。第三十五页，共七十六页。近几年来，近几年来，胚胎工程技术、基因工程技胚胎工程技术、基因工程技术、组织工程技术与术、组织工程技术与ESES细胞细胞(xb
24、o)(xbo)研究的结合研究的结合已经成为现实，将使相关的基础学科研究已经成为现实，将使相关的基础学科研究以及医药业、畜牧业等发生重大变化，走以及医药业、畜牧业等发生重大变化，走向一个新的时代。向一个新的时代。第三十六页，共七十六页。2.2.胚胎胚胎(piti)(piti)干细胞的用途干细胞的用途为在细胞和分子水平研究研究哺乳动物早期胚胎发为在细胞和分子水平研究研究哺乳动物早期胚胎发育规律育规律(gul)(gul)提供了良好的材料和方法，是基因功能提供了良好的材料和方法，是基因功能研究的有效手段。研究的有效手段。细胞分化机制，细胞癌变机理细胞分化机制，细胞癌变机理用于新药的发现、筛选及安全性实
25、验用于新药的发现、筛选及安全性实验：如药物机理及毒：如药物机理及毒性实验性实验重要的临床价值，可作为组织移植、细胞治疗和基因治疗重要的临床价值，可作为组织移植、细胞治疗和基因治疗的细胞来源：的细胞来源：制造细胞、组织和器官；人制造细胞、组织和器官；人ESES定向诱导分定向诱导分化为人体器官；生产用于人类器官移植的动物器官：无化为人体器官；生产用于人类器官移植的动物器官：无免疫排斥；猪可以作为人异种器官移植的器官供体来源。免疫排斥；猪可以作为人异种器官移植的器官供体来源。第三十七页，共七十六页。生产克隆动物：由于生产克隆动物：由于ESES细胞细胞(xbo)(xbo)是具有全能是具有全能性、未分化
26、的细胞性、未分化的细胞(xbo)(xbo)，因此是制作，因此是制作克隆动克隆动物很好的核供体物很好的核供体。生产转基因动物：建立转基因细胞系，抗生产转基因动物：建立转基因细胞系，抗病育种；药用蛋白病育种；药用蛋白第三十八页，共七十六页。ESES细细胞胞可可作作为为基基因因打打靶靶的的靶靶细细胞胞，经经打打靶靶(d(d b)b)引引入入定定点点整整合合外外源源基基因因，提提高高转转基基因因动动物物的的整整合合率率和和表表达效果。达效果。ESES细细胞胞也也可可进进行行基基因因敲敲除除，获获得得基基因因敲敲除除动动物物，如如猪猪可以作为人异种器官移植的器官供体来源。可以作为人异种器官移植的器官供体
27、来源。第三十九页，共七十六页。在在发发育育生生物物学学基基础础研研究究中中，利利用用ESES细细胞胞研研究究细细胞胞分分化化的机埋的机埋，有助于阐明细胞分化调节的机制。，有助于阐明细胞分化调节的机制。ESES细细胞胞的的多多能能性性可可以以在在一一定定培培养养条条件件下下转转化化为为特特定定的的细细胞胞。试试验验证证明明，体体外外诱诱导导小小鼠鼠ESES细细胞胞的的分分化化，可可形形成成(xngchng)(xngchng)内内脏脏卵卵黄黄囊囊、心心肌肌层层，也也可可以以得得到到神神经经元样细胞和成纤维样的细胞。元样细胞和成纤维样的细胞。第四十页，共七十六页。使使人人的的ESES细细胞胞与与猪猪
28、等等动动物物的的胚胚胎胎结结合合，可可得得到到人人-猪猪嵌嵌合合体体动动物物，由由于于ESES细细胞胞具具有有全全能能性性，可可分分化化形形成成不不同同胚胚层层，包包括括(boku)(boku)某某些些器器官官，这这样样的的器器官官与与人人的的器器官官具具有有相相同同的的免免疫疫特特性性，因因此此它它不不会会对对人产生排异反应。人产生排异反应。第四十一页，共七十六页。人人的的ESES细细胞胞也也可可在在体体外外定定向向诱诱导导培培养养，生生产产人人的的肌肌肉肉、神神经经和和造造血血细细胞胞的的细细胞胞组组织织，在在治治疗疗人人的的某某些些疾疾病病上上有有重重要的应用价值。要的应用价值。科科学学
29、家家们们一一直直试试图图诱诱导导各各种种(zhn)zhn)干干细细胞胞定定向向分分化化为为特特定定的的组组织织来来替替代代那那些些受受损损的的体体内内组组织织，比比如如把把产产生生胰胰岛岛素的细胞植入素的细胞植入糖尿病患者糖尿病患者体内。体内。第四十二页，共七十六页。科科学学家家们们已已经经能能够够使使猪猪ESES细细胞胞转转变变为为跳跳动动的的心心肌肌细细胞胞，使使人人ESES细细胞胞生生成成神神经经细细胞胞和和间间充充质质细细胞胞，并并能能使使小小鼠鼠ESES细细胞胞分分化化为为内内胚胚层层(picng)(picng)细细胞胞。这这些些结结果果为为细胞和组织替代疗法开辟了道路。细胞和组织替
30、代疗法开辟了道路。目目前前，科科学学家家已已成成功功分分离离到到人人ESES细细胞胞，而而体体细细胞胞克隆技术为生产患者自身的克隆技术为生产患者自身的ESES细胞提供了可能。细胞提供了可能。第四十三页，共七十六页。治疗性克隆治疗性克隆(k ln)(k ln)：体细胞核移植（：体细胞核移植（SCNTSCNT）去核卵细胞去核卵细胞+体细胞核体细胞核 克隆克隆 囊囊胚胚 分离内细胞群分离内细胞群 ESES细胞细胞第四十四页，共七十六页。把把患患者者(hunzh)(hunzh)体体细细胞胞移移植植到到去去核核卵卵母母细细胞胞中中形形成成重重组组胚胚，把把重重组组胚胚体体外外培培养养到到囊囊胚胚，然然后
31、后从从囊囊胚胚内内分分离离出出ESES细细胞胞，获获得得的的ESES细细胞胞使使之之定定向向分分化化为为所所需需的的特特定定细细胞胞类类型型 (如如神神经经细细胞胞、肌肌肉肉细细胞胞和和血细胞血细胞)，用于替代疗法。，用于替代疗法。这这种种核核移移植植法法的的最最终终目目的的是是用用于于干干细细胞胞治治疗疗，而而非非得得到到克克隆隆个个体体，科学家们称之为科学家们称之为“治疗克隆治疗克隆”。生殖性克隆生殖性克隆第四十五页，共七十六页。2.第四十六页，共七十六页。ESES细胞研究细胞研究(ynji)(ynji)的伦理问题的伦理问题ESES研究也引发了当前最为激烈而敏感的伦理之争。研究也引发了当前
32、最为激烈而敏感的伦理之争。主要围绕两个问题而展开：主要围绕两个问题而展开：一是如何看待胚胎。一是如何看待胚胎。ESES主要有三个来源主要有三个来源(liyun)(liyun)：（1 1）（自然和人工）流产的胚胎；）（自然和人工）流产的胚胎；（2 2）辅助生殖剩余的胚胎；）辅助生殖剩余的胚胎；（3 3）通过体细胞核转移术得到的胚胎。）通过体细胞核转移术得到的胚胎。第四十七页，共七十六页。不管哪一个来源，提取不管哪一个来源，提取ESES必定会损毁胚胎。于是，胚胎必定会损毁胚胎。于是，胚胎是不是生命是不是生命(shngmng)(shngmng)，是不是人，研究，是不是人，研究ESES是不是是不是“毁
33、灭毁灭生命生命(shngmng)(shngmng)”、“杀人杀人”，很自然地成为争论的焦点。，很自然地成为争论的焦点。国内认为：与国内认为：与“胚胎胚胎”的生命相比，的生命相比，“人人”的生命具的生命具有优先权，可以杀死胚胎来救有优先权，可以杀死胚胎来救“人人”的生命。的生命。第四十八页，共七十六页。另一焦点在于，是否必然滑向另一焦点在于，是否必然滑向生殖性克隆。生殖性克隆。20032003年年1010月，联合国大会以月，联合国大会以8080票赞成、票赞成、7979票反对、票反对、1515票弃权的票弃权的表决结果，将禁止人的克隆生殖国际公约推迟一年。表决结果，将禁止人的克隆生殖国际公约推迟一年
34、。世界各国都表示反对生殖性克隆，为什么这一国际公约通不过呢？因世界各国都表示反对生殖性克隆，为什么这一国际公约通不过呢？因为为7979个国家认为治疗性克隆必然滑向生殖性克隆，主张二者同时禁止。个国家认为治疗性克隆必然滑向生殖性克隆，主张二者同时禁止。治疗性克隆是治疗性克隆是ESES研究的主要研究的主要(zhyo)(zhyo)目的。封杀治疗性克隆，实目的。封杀治疗性克隆，实际上就是要封杀际上就是要封杀ESES研究。研究。第四十九页，共七十六页。ESES细胞技术的发展细胞技术的发展(fzhn)(fzhn)方向方向ESES细胞维持自我更新和定向分化的分子机理细胞维持自我更新和定向分化的分子机理ESE
35、S细胞治疗技术的研究细胞治疗技术的研究ESES细胞作工具探讨基因功能和个体细胞作工具探讨基因功能和个体(gt)(gt)的发生发育的发生发育ESES细胞治疗中的免疫排斥问题细胞治疗中的免疫排斥问题治疗型克隆技术治疗型克隆技术分离分离ESES细胞新途径的研究细胞新途径的研究用用ESES细胞生产转基因家畜细胞生产转基因家畜第五十页，共七十六页。ES ES细胞具有可以无限地传代增殖，而且不改变其细胞具有可以无限地传代增殖，而且不改变其基因型和表现型的特点。基因型和表现型的特点。如果以如果以ESES细胞作为核供体细胞作为核供体进行核移植进行核移植,可以在短时间可以在短时间内获得大量内获得大量基因型和表现
36、型基因型和表现型完全相同的个体。完全相同的个体。而且用而且用ESES细胞与胚胎进行细胞与胚胎进行嵌合嵌合克隆动物克隆动物,可以解决哺乳动可以解决哺乳动物远缘杂交的困难物远缘杂交的困难,生产生产(shngchn)(shngchn)出出珍贵的动物珍贵的动物,也可以进行也可以进行异种动物克隆异种动物克隆,有助于保护珍惜野生动物。有助于保护珍惜野生动物。ESES细胞细胞(xbo)(xbo)与动物克隆与动物克隆第五十一页，共七十六页。尽管体细胞克隆与尽管体细胞克隆与ESES细胞克隆相比有着易细胞克隆相比有着易于取材于取材(qci)(qci)的特点，但是体细胞克隆也存在的特点，但是体细胞克隆也存在着不少缺
37、点，如生理和免疫缺陷，目前体着不少缺点，如生理和免疫缺陷，目前体细胞克隆还不能完全代替细胞克隆还不能完全代替ESES细胞克隆。细胞克隆。第五十二页，共七十六页。ES ES细胞作基因载体细胞作基因载体 目前常用的生产转基因动物的方法是向受精卵中注射目前常用的生产转基因动物的方法是向受精卵中注射DNADNA，外源基因的整合、表达和筛选外源基因的整合、表达和筛选(shixun)(shixun)工作是在个体水平上进行工作是在个体水平上进行的，不仅工作繁琐，周期长成功率低，产生的后代的遗传性状的，不仅工作繁琐，周期长成功率低，产生的后代的遗传性状也常出现分离；也常出现分离；第五十三页，共七十六页。而利用
38、而利用ESES细胞作为基因载体，得到基因整细胞作为基因载体，得到基因整合的细胞，将载体合的细胞，将载体ESES细胞直接进行细胞直接进行(jnxng)(jnxng)核核移植或者通过与胚胎嵌合获得嵌合动物，移植或者通过与胚胎嵌合获得嵌合动物，ESES细胞在嵌合体中分化发育成全能性的生细胞在嵌合体中分化发育成全能性的生殖细胞，即可以得到携有目的基因的转基殖细胞，即可以得到携有目的基因的转基因动物。因动物。第五十四页，共七十六页。因为一个优良的因为一个优良的ESES细胞系不仅可以用于各种目的基因转细胞系不仅可以用于各种目的基因转化，用各种方法将外源化，用各种方法将外源DNADNA导入细胞，而且外源基因
39、的导入细胞，而且外源基因的整合数目、位点、表达程序以及稳定性等都可以在细胞整合数目、位点、表达程序以及稳定性等都可以在细胞水平上进行加工，筛选，在很大程度水平上进行加工，筛选，在很大程度(chngd)(chngd)上加快了动上加快了动物遗传工程的进程。物遗传工程的进程。第五十五页，共七十六页。第五十六页，共七十六页。改善改善ESES细胞的体外培养条件，建立更有效更简便的获细胞的体外培养条件，建立更有效更简便的获得得ESES细胞的方法。细胞的方法。定向诱导分化成特定类型定向诱导分化成特定类型(lixng)(lixng)细胞，用于临床疾病细胞，用于临床疾病的治疗，并解决免疫排斥和潜在的致肿瘤的问题
40、。的治疗，并解决免疫排斥和潜在的致肿瘤的问题。成体干细胞的横向分化的能力以及与胚胎干细胞的比较，成体干细胞的横向分化的能力以及与胚胎干细胞的比较，成体干细胞能否替代胚胎干细胞？成体干细胞能否替代胚胎干细胞？第五十七页，共七十六页。嵌合体实验和克隆嵌合体实验和克隆(k ln)(k ln)动物实验动物实验是将是将ESES细胞细胞与正常的胚胎融合制作嵌合体或将与正常的胚胎融合制作嵌合体或将ESES细胞作为细胞作为核供体进行核移植，产生克隆动物后代。这两核供体进行核移植，产生克隆动物后代。这两者是检验者是检验ESES细胞的最有效、最有说服力的方法。细胞的最有效、最有说服力的方法。第五十八页，共七十六页
41、。人的人的ESES细胞可以高水平地表达端粒酶活性细胞可以高水平地表达端粒酶活性，二倍体的人，二倍体的人体细胞不表达端粒酶，并且随着年龄体细胞不表达端粒酶，并且随着年龄(ninlng)(ninlng)的增长端粒的增长端粒变短，而在组织培养达到一定增殖寿命时，就开始衰老。变短，而在组织培养达到一定增殖寿命时，就开始衰老。与此相反，端粒酶在生殖系和胚胎组织中都有很高的与此相反，端粒酶在生殖系和胚胎组织中都有很高的活性。活性。ESES细胞中的高水平端粒酶活性证实了它的寿命将细胞中的高水平端粒酶活性证实了它的寿命将超过体细胞。超过体细胞。第五十九页，共七十六页。ESES细胞系的分离效率低细胞系的分离效率
42、低ESES细胞定向诱导细胞定向诱导(yudo)(yudo)分化的理论和技术水平分化的理论和技术水平低：随机的，运气。低：随机的，运气。第六十页，共七十六页。解决胚胎来源解决胚胎来源(liyun)(liyun)有限的途径：有限的途径：未成熟卵的体外成熟未成熟卵的体外成熟第六十一页，共七十六页。避免免疫排斥的方法避免免疫排斥的方法（1 1）Knock-out Knock-out 胚胎胚胎(piti)(piti)干细胞的组织相干细胞的组织相 容性抗原容性抗原（2 2）Knock-in Knock-in 受者的组织相容性抗原受者的组织相容性抗原（3 3）与同一来源的造血干细胞一同移植）与同一来源的造血
43、干细胞一同移植（4 4）受者的体细胞核移植）受者的体细胞核移植第六十二页，共七十六页。第六十三页，共七十六页。胚胎嵌合技术胚胎嵌合技术(jsh)(jsh)研究概况研究概况嵌合体嵌合体(chimera)(chimera)一词源于古希腊神话，其一词源于古希腊神话，其意是指狮头、羊身、龙尾等部分意是指狮头、羊身、龙尾等部分(b fen)(b fen)拼凑起拼凑起来的怪兽。来的怪兽。中国的中国的“龙龙”：九似：九似 图腾图腾在生物学上是指同一个体中，基因型相异在生物学上是指同一个体中，基因型相异的细胞或组织混合存在的状态。的细胞或组织混合存在的状态。第六十四页，共七十六页。天然(tinrn)嵌合体？骡
44、子骡子(lu zi)：不是。是杂种：不是。是杂种第六十五页，共七十六页。1.定义(dngy)嵌合体动物是指由两种或两种以上具有不同遗传性的嵌合体动物是指由两种或两种以上具有不同遗传性的细胞系组成的聚合胚发育成的个体。细胞系组成的聚合胚发育成的个体。在卵裂期甚至受精卵期所形成的嵌合体为在卵裂期甚至受精卵期所形成的嵌合体为原发性嵌合体原发性嵌合体(成体中每个器官都有两种类型的细胞）成体中每个器官都有两种类型的细胞）。胚胎发育的晚期，通过胚胎发育的晚期，通过(tnggu)(tnggu)组织移植或嫁接等方法组织移植或嫁接等方法所形成的部分组织或器官的嵌合称为所形成的部分组织或器官的嵌合称为次生性嵌合次
45、生性嵌合。第六十六页，共七十六页。2.2.囊胚显微囊胚显微(xin wi)(xin wi)注射法生产嵌合体注射法生产嵌合体用显微操作技术将供胚的全部内细胞团注入除去用显微操作技术将供胚的全部内细胞团注入除去(ch(ch q)q)部分内细胞团的受胚囊胚腔中，或将供胚的部分部分内细胞团的受胚囊胚腔中，或将供胚的部分内细胞团注入受胚的囊胚腔中，也可以向受胚囊胚内细胞团注入受胚的囊胚腔中，也可以向受胚囊胚腔中（或卵周间隙）注入腔中（或卵周间隙）注入1616细胞至桑甚胚的卵裂球、细胞至桑甚胚的卵裂球、胚胎干细胞或已分化的细胞，使其发育为嵌合胚胎胚胎干细胞或已分化的细胞，使其发育为嵌合胚胎的方法即为囊胚注
46、入法。的方法即为囊胚注入法。囊胚腔注射法嵌合体获得率最高囊胚腔注射法嵌合体获得率最高第六十七页，共七十六页。第六十八页，共七十六页。3.3.嵌合体技术在动物嵌合体技术在动物(dngw)(dngw)生产中的应用生产中的应用(1)人工制造有特殊(tsh)经济价值的个体 对水绍、狐狸、绒鼠等毛皮动物，利用胚胎嵌合体技术可以获得用交配或杂交法不能获得的毛皮花色类型。第六十九页，共七十六页。第七十页，共七十六页。第七十一页，共七十六页。第七十二页，共七十六页。第七十三页，共七十六页。(2)种间移植 用于分析胎儿与母体的相互关系，如将斑马的受精卵，移植到马体内生产(shngchn)斑马（拯救珍稀濒危动物）
47、。第七十四页，共七十六页。(3)可作为外源基因的导入方法 把外源目的基因先导入干细胞，再通过胚胎干细胞介导法将目的基因转入胚胎，这是转基因动物生产中基因导入的一种重要手段。(4)生产移植器官人兔胚胎嵌合体：将来发育成某种特定(tdng)器官，如能克服免疫排斥反应，有望用于器官移植。第七十五页，共七十六页。内容(nirng)总结胚 胎 干 细 胞。动物体内干细胞的正常作用是在发育的过程中可提供不同的细胞型,以生长成不同的组织和器官。能维持稳定的正常的二倍体染色体结构。6.两种来源的ES细胞的区别。这两者是检验(jinyn)ES细胞的最有效、最有说服力的方法。ES细胞中的高水平端粒酶活性证实了它的寿命将超过体细胞。嵌合体动物是指由两种或两种以上具有不同遗传性的细胞系组成的聚合胚发育成的个体第七十六页，共七十六页。