抗生素发酵工艺课件.ppt

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1、抗生素发酵工艺抗生素发酵工艺一、概述一、概述 利用微生物技术，通过高度工程化的新型综合技术，以利用微生物反应过程为基础，依赖于微生物机体在反应器内的生长繁殖及代谢过程来合成一定产物，通过分离纯化进行提取精制，并最终制剂成型来实现药物产品的生产。绪论二、抗生素的发展史u 我国早在宋朝真宗（我国早在宋朝真宗（998-1022）年代就开始）年代就开始利用接种人痘的免疫技术预防天花病。利用接种人痘的免疫技术预防天花病。u 1796年英国医生年英国医生E.Jenner利用接种牛痘苗预防天利用接种牛痘苗预防天花并获得成功。花并获得成功。u1929：Fleming在葡萄在葡萄球菌培养皿中，污染的球菌培养皿中

2、，污染的霉菌周围出现透明的抑霉菌周围出现透明的抑菌圈。菌圈。u杀菌物质，断言太不稳杀菌物质，断言太不稳定，无法分离并用作药定，无法分离并用作药物。物。u1939：牛津病理家：牛津病理家Howard Florey，化学，化学家家Ernst Chain，Norman Heatley.发酵发酵瓶培养霉菌，培养里提瓶培养霉菌，培养里提取测活性，青霉素结晶。取测活性，青霉素结晶。u1940:8只注射链球菌，只注射链球菌，提取物对提取物对4只治疗。未经只治疗。未经治疗鼠在治疗鼠在24小时内死亡，小时内死亡，治疗鼠存活数天至数周。治疗鼠存活数天至数周。u1941年年2月开始治疗第一月开始治疗第一批人类病人。

3、批人类病人。u1943：威斯康辛大学小：威斯康辛大学小组，取得突破组，取得突破u生产菌表面培养：几十生产菌表面培养：几十个单位个单位u深层培养产黄青霉：深层培养产黄青霉：100U/mluX、UV诱变育种：诱变育种：1000-1500U/mlu不产色素变种：不产色素变种：66000-70000U/mlu1941年，美国辉瑞制药公司开始介入青霉素的试验性年，美国辉瑞制药公司开始介入青霉素的试验性生产，使用了生产柠檬酸已经非常成熟的通入无菌空生产，使用了生产柠檬酸已经非常成熟的通入无菌空气并进行搅拌的深层发酵法。这种方法给发酵工业带气并进行搅拌的深层发酵法。这种方法给发酵工业带来了革命性的变化。自此

4、以后制药业走进了抗生素时来了革命性的变化。自此以后制药业走进了抗生素时代代u我国微生物发酵制药工业起步较晚，我国微生物发酵制药工业起步较晚，1953年，我国第年，我国第一家青霉素生产厂一家青霉素生产厂上海第三制药厂才建成投产。上海第三制药厂才建成投产。u1958年，我国最大的抗生素制药企业年，我国最大的抗生素制药企业华北制药厂在华北制药厂在石家庄建成投产，主要产品为青霉素、链霉素、土霉石家庄建成投产，主要产品为青霉素、链霉素、土霉素和红霉素等。素和红霉素等。三、抗生素药物的分类抗细菌：青霉素、红霉素、四环素抗细菌：青霉素、红霉素、四环素抗真菌：两性霉素抗真菌：两性霉素B、制霉菌素、灰黄霉素、制

5、霉菌素、灰黄霉素抗肿瘤：丝裂霉素、诺卡霉素抗肿瘤：丝裂霉素、诺卡霉素抗病毒：阿糖腺苷、金刚烷胺抗病毒：阿糖腺苷、金刚烷胺四、微生物发酵研究范围 微生物发酵制药是利用微生物进行药物研究、微生物发酵制药是利用微生物进行药物研究、生产和制剂的综合性应用技术科学。研究内容包括微生产和制剂的综合性应用技术科学。研究内容包括微生物制药用菌的选育，发酵以及产品的分离和纯化工生物制药用菌的选育，发酵以及产品的分离和纯化工艺等。艺等。主要讨论用于各类药物发酵的微生物来源和主要讨论用于各类药物发酵的微生物来源和改造、微生物药物的生物合成和调控机制、发酵工艺改造、微生物药物的生物合成和调控机制、发酵工艺与主要参数的

6、确定、药物发酵过程的优化控制、质量与主要参数的确定、药物发酵过程的优化控制、质量控制等。控制等。第一章 微生物药物的产生菌常见的制药用微生物常见的制药用微生物 细菌细菌 放线菌放线菌 真菌真菌细菌之芽孢杆菌属(Bacillus)放线菌 抗生素12000余种，60%左右来自放线菌，经济价值大。放线菌之诺卡氏菌属(Norcadia)生产利福霉素、蚊霉素等放线菌之小单胞菌属(Micromonospora)多种可产抗生素，如棘孢小单胞菌(M.echinospora)产庆大霉素。放线菌之游动放线菌属（Actinoplanes）典型代表：济南游动放线菌(Actinoplanes tsinanesisn)产

7、创新霉素(creatmycin；1964)真菌之曲霉属(Aspergillus)生产枸橼酸、葡萄糖酸、有机酸类、抗生素，进行甾体转化。真菌之青霉属(Penicillum)产黄青霉(Penicillum chrysogenum)生产青霉素，也可用来生产葡萄糖氧化酶、葡萄糖酸、柠檬酸和抗坏血酸真菌之头孢霉菌属(Cephalosporium)产黄头孢霉(Cephalosporium chrysogen)、顶孢头孢霉菌(Cephalosporium acremonium)都生产头孢菌素C 第二节 制药微生物的育种菌种选育菌种选育菌种筛选菌种筛选菌种保藏菌种保藏菌种的退化和复壮菌种的退化和复壮一、发酵菌

8、种的选育要求生产力：能在廉价的培养基上迅速生长，所需的代谢产物的产量高，其它类似代谢产物少操作性：培养条件简单，发酵易控制，产品易分离稳定性：抗噬菌体能力强，菌种纯粹，遗传性状稳定、不易变异退化安全性：非病源菌，不产有害生物活性物质或毒素发酵菌种的选育方法从自然界中获得新菌种诱变育种杂交育种原生质体融合基因工程（1）从自然界中获得新菌种u土壤、空气、动植物等，严重污染的水域，极端环境等u基本程序：采样预处理富集培养筛选鉴定野生型菌株（2）诱变育种物理或化学方法诱发突变物理诱变剂：紫外线、X-射线、-射线等化学诱变剂：氮芥、亚硝酸、5-氟尿嘧啶等u杂交育种杂交育种：借助有性重组，使不同菌株的遗传

9、物质得以交换u原生质体融合育种原生质体融合育种：借助原生质融合技术实现遗传物质的交换u基因工程育种基因工程育种：DNA体外重组技术定向育种，技术含量高，应用面广二、菌种筛选（1）随机筛选随机筛选 摇瓶筛选法、琼脂块筛选法摇瓶筛选法、琼脂块筛选法（2）理性化筛选）理性化筛选 筛选前体或前体结构类似物抗性突变株筛选前体或前体结构类似物抗性突变株 筛选营养缺陷型突变株筛选营养缺陷型突变株三、菌种保藏(Culture conservation)目的：保证菌种经过较长时间后仍保持生活能力，防止被杂菌污染，形态特征和生理形状尽可能不发生变异。原理：根据微生物的生理、生化特性，人工创造原理：根据微生物的生理

10、、生化特性，人工创造条件（如干燥、低温、缺氧、缺乏营养等）使微生物条件（如干燥、低温、缺氧、缺乏营养等）使微生物代谢活动处于不活泼状态，使其存活且得以延续。在代谢活动处于不活泼状态，使其存活且得以延续。在进行保藏时最好是选用菌种的休眠体，如芽孢、孢子。进行保藏时最好是选用菌种的休眠体，如芽孢、孢子。通过保藏可以减少微生物的新陈代谢，降低菌种变异通过保藏可以减少微生物的新陈代谢，降低菌种变异的几率。的几率。菌种保藏三要素典型菌种的优良纯种的休眠体；创造有利于种子休眠的环境（低温、干燥、缺氧、避光、缺少营养）；尽可能采用多种不同的手段保藏同一菌株。菌种保藏的常用方法斜面低温保藏法石蜡油封存法砂土管

11、保藏法麸皮保藏法甘油悬液保藏法冷冻真空干燥保藏法液氮超低温保藏法宿主保藏法方法名称主要特点适用范围保藏期斜面低温保藏法传代培养，4保藏各种微生物的短期保藏。1-6个月石蜡油封存法石蜡油隔绝空气，室温或4保藏各种微生物的中短期保藏，不适用某些能分解烃类的菌种。1-2年砂土管保藏法沙土管作载体，干燥器中抽真空，室温或4保藏产孢子微生物和芽孢细菌的长期保藏，不适用对干燥敏感的微生物1-10年麸皮保藏法麸皮作载体，干燥，4保藏产孢子霉菌和某些放线菌，工厂多采用此法1年甘油悬液保藏法悬浮于10-15%甘油中，需低温冰箱基因工程菌1年/10年冷冻真空干燥保藏法用保护剂制备悬液，快速冻结，减压抽真空，需冻干

12、机各类微生物5-15年液氮超低温保藏法保护剂，超低温（-196），需超低温液氮设备各类微生物15年以上宿主保藏法与培养基混合直接低温保存专性活细胞寄生微生物（如病毒）u菌种保藏机构ATCC（美国典型菌种保藏中心）CMCC(中国医学微生物菌种保藏管理中心)NBRC (日本技术评价研究所生物资源中心)四、菌种的退化和复壮退化：退化：基因突变基因突变 连续传代连续传代 环境不良或污染环境不良或污染了杂菌了杂菌生产能力下降生产能力下降抵抗不良环境条件抵抗不良环境条件能力减弱能力减弱复壮纯种分离纯种分离 粗放、精细粗放、精细寄主复壮寄主复壮选择合适的培养条件选择合适的培养条件 改变营养成分、酸碱度、培养

13、温度改变营养成分、酸碱度、培养温度第二章 培养基第一节第一节 培养基的成分培养基的成分 原则：原则：根据菌种特性、微生物生长发育阶段、发酵产物根据菌种特性、微生物生长发育阶段、发酵产物特点等因素合理配制使用不同成分及配比的培养基，为特点等因素合理配制使用不同成分及配比的培养基，为微生物提供适宜的营养物质，以满足菌体生长和合成产微生物提供适宜的营养物质，以满足菌体生长和合成产物的需求。物的需求。一、碳源 工业常用：糖蜜（营养丰富，物美价廉）玉米淀粉及其水解液（克服葡萄糖代谢过快的弊病）油脂（消除泡沫）糊精第一节第一节 培养基的成分培养基的成分二、氮源有机氮源：有机氮源：黄豆饼粉、棉籽饼粉、玉米浆

14、、蛋白胨、酵母粉、黄豆饼粉、棉籽饼粉、玉米浆、蛋白胨、酵母粉、鱼粉鱼粉无机氮源：无机氮源：铵盐、硝酸盐、氨水铵盐、硝酸盐、氨水三、无机盐和微量元素磷（链霉素、四环素）硫（青霉素、头孢菌素）铁（青霉素、四环素、麦迪霉素）镁（卡那霉素、新生霉素、链霉素）锌（链霉素、青霉素）氯（金霉素、灰黄霉素）四、前体 前体是指加入到发酵培养基中的能够直接被微生物在生物合成过程中结合到产物分子中去而自身结构没有显著变化的一类小分子物质。注意：少量多次注意：少量多次 五、促进剂和抑制剂 促进剂是指那些既不是营养物质又不是前促进剂是指那些既不是营养物质又不是前体却能提高产物产量的添加剂。体却能提高产物产量的添加剂。抑

15、制剂是指在发酵过程中会抑制某些代谢途径的抑制剂是指在发酵过程中会抑制某些代谢途径的进行，同时会使另一代谢途径活跃，从而获得人们所进行，同时会使另一代谢途径活跃，从而获得人们所需的某种产物或是正常代谢的某一代谢中间产物积累需的某种产物或是正常代谢的某一代谢中间产物积累起来。起来。六、生长因子 那些对微生物生长不可缺少的微量有机物质，微那些对微生物生长不可缺少的微量有机物质，微生物不能通过普通的碳源、氮源合成这些物质，需另生物不能通过普通的碳源、氮源合成这些物质，需另外添加，包括维生素、氨基酸、嘌呤碱和嘧啶碱及其外添加，包括维生素、氨基酸、嘌呤碱和嘧啶碱及其衍生物。衍生物。第二节 培养基的类型类别

16、：按组成成分分类别：按组成成分分 合成培养基：成分明确、稳定，多用于研究和育合成培养基：成分明确、稳定，多用于研究和育种，不适合大规模生产。种，不适合大规模生产。天然培养基：天然动植物产品，营养丰富、价格天然培养基：天然动植物产品，营养丰富、价格低廉、适于工业生产。低廉、适于工业生产。按培养基的物理状态分固体培养基：适合菌种的培养和保存固体培养基：适合菌种的培养和保存半固体培养基半固体培养基液体培养基：适合发酵工业大规模使用液体培养基：适合发酵工业大规模使用按培养基的生产用途分孢子培养基孢子培养基 供菌种繁殖孢子用的，常采用固体培养基。供菌种繁殖孢子用的，常采用固体培养基。条件：培养基营养不要

17、太丰富条件：培养基营养不要太丰富 无机盐浓度适当无机盐浓度适当 培养基的培养基的PH值要适中值要适中 常用：麸皮培养基、小米培养基、大米培养基、常用：麸皮培养基、小米培养基、大米培养基、玉米培养基玉米培养基二、种子培养基 种子培养基是供孢子萌发和菌种生长繁殖用的培种子培养基是供孢子萌发和菌种生长繁殖用的培养基，营养成分要比较丰富、完全、易被菌体利用。养基，营养成分要比较丰富、完全、易被菌体利用。营养成分：葡萄糖、糊精、蛋白胨、玉米浆、酵营养成分：葡萄糖、糊精、蛋白胨、玉米浆、酵母粉、硫酸铵等。母粉、硫酸铵等。三、发酵培养基 发酵培养基是供菌种生长、繁殖和合成产物用的发酵培养基是供菌种生长、繁殖

18、和合成产物用的培养基。培养基。注意：碳氮源速效和迟效的相互搭配，少用速效注意：碳氮源速效和迟效的相互搭配，少用速效营养，多加迟效营养，比例适宜。营养，多加迟效营养，比例适宜。第三节 培养基的设计与选择一、培养基的设计一、培养基的设计 遵循的原则：遵循的原则：1、营养物质满足微生物生命活动的需要、营养物质满足微生物生命活动的需要 2、营养物质的浓度及配比适当、营养物质的浓度及配比适当 3、PH值适宜值适宜 4、符合培养的目标、符合培养的目标 5、原料来源广泛，价格合理、原料来源广泛，价格合理二、培养基的选择1、液体培养基和固体培养基的选择、液体培养基和固体培养基的选择 液体培养基：液体培养基：种

19、子培养及大规模发酵生产。种子培养及大规模发酵生产。固体培养基：固体培养基：微生物菌种的分离、纯化及保存、微生物菌种的分离、纯化及保存、菌落特征鉴定、活细胞数目测定菌落特征鉴定、活细胞数目测定2、根据微生物的营养特点选择培养基、根据微生物的营养特点选择培养基3、依据生产实践和科学实验的要求选择培养基、依据生产实践和科学实验的要求选择培养基4、考虑培养基的成本、考虑培养基的成本 选择原则：选择原则：产物或菌体得率大的产物或菌体得率大的 降低产品的分离提纯成本降低产品的分离提纯成本 生产能力最高的生产能力最高的 副产品生成最少副产品生成最少 原料质量稳定，供应充足原料质量稳定，供应充足 工艺过程较易

20、进行工艺过程较易进行第四节 影响培养基质量的因素一、培养基组成配比的影响一、培养基组成配比的影响二、培养基原材料质量的影响二、培养基原材料质量的影响三、水质的影响三、水质的影响四、灭菌的影响四、灭菌的影响五、其他因素的影响五、其他因素的影响一、培养基组成配比的影响氮源过多：菌体生长旺盛，氮源过多：菌体生长旺盛，PH值偏高，不利于代谢产值偏高，不利于代谢产物积累。物积累。氮源不足：菌体繁殖量过少，影响产量。氮源不足：菌体繁殖量过少，影响产量。碳源过多：碳源过多：PH值偏低。值偏低。碳源不足：易引起菌体衰老和自溶。碳源不足：易引起菌体衰老和自溶。二、培养基原材料质量的影响 有机氮源（黄豆饼粉、玉米

21、浆）、配制培养基（蛋白有机氮源（黄豆饼粉、玉米浆）、配制培养基（蛋白胨）、碳源（油脂）胨）、碳源（油脂）消除原则：在工业生产中必须严加控制，按质量标准消除原则：在工业生产中必须严加控制，按质量标准进行分析检验，合乎标准的原材料方能使用。进行分析检验，合乎标准的原材料方能使用。三、水质影响 孢子培养基用蒸馏水货深井水，种子培养基、发孢子培养基用蒸馏水货深井水，种子培养基、发酵培养基用深井水或自来水，发酵生产中有的使用地酵培养基用深井水或自来水，发酵生产中有的使用地表水，但是必要时要经过适当处理才能使用。表水，但是必要时要经过适当处理才能使用。四、灭菌的影响 严格控制灭菌操作，力求达到既灭杂菌又减

22、少营严格控制灭菌操作，力求达到既灭杂菌又减少营养成分的损失，对那些易降解或易发生化学反应的组养成分的损失，对那些易降解或易发生化学反应的组分应单独灭菌。分应单独灭菌。五、其他因素影响1、培养基的、培养基的PH值值 培养基培养基PH值的调节应主要通过改变培养基营养物值的调节应主要通过改变培养基营养物质的浓度比例，特别是生理酸、碱性物质的用量来完质的浓度比例，特别是生理酸、碱性物质的用量来完成。少量培养基的成。少量培养基的PH值可用缓冲液加以缓冲。值可用缓冲液加以缓冲。2、培养基的黏度、培养基的黏度 黏度适宜黏度适宜第三章 灭菌第一节第一节 灭菌的原理和方法灭菌的原理和方法 灭菌是指用物理的或化学

23、的方法杀灭或除掉物料灭菌是指用物理的或化学的方法杀灭或除掉物料及设备中所有生命有机体的过程。及设备中所有生命有机体的过程。一、常用的灭菌方法一、常用的灭菌方法 化学物质灭菌化学物质灭菌 辐射灭菌辐射灭菌 过滤介质灭菌过滤介质灭菌 加热灭菌（干热灭菌、湿热灭菌）加热灭菌（干热灭菌、湿热灭菌）1、化学物质灭菌、化学物质灭菌 试剂：甲醛、苯酚、高锰酸钾、新洁尔灭、乙醇、试剂：甲醛、苯酚、高锰酸钾、新洁尔灭、乙醇、过氧乙酸、漂白粉等。过氧乙酸、漂白粉等。适用范围：生产环境或小型器具。不适用于培养基适用范围：生产环境或小型器具。不适用于培养基的灭菌。的灭菌。2、辐射灭菌、辐射灭菌 用于灭菌的射线包括紫外

24、线、用于灭菌的射线包括紫外线、X射线、射线、射线，其中射线，其中以紫外线最常用。以紫外线最常用。紫外线主要用于无菌室、培养间等空间的灭菌。紫外线主要用于无菌室、培养间等空间的灭菌。3、过滤介质除菌、过滤介质除菌 主要用于澄清液体及气体的除菌主要用于澄清液体及气体的除菌4、加热灭菌、加热灭菌 （1）干热灭菌）干热灭菌 火焰灭菌：火焰灭菌：主要用于金属接种工具、试管口、锥形瓶口、接主要用于金属接种工具、试管口、锥形瓶口、接种移液管和滴管外部及无用的污染物或实验动物的尸种移液管和滴管外部及无用的污染物或实验动物的尸体等灭菌。体等灭菌。金属小镊子、小刀、玻璃涂棒、载玻片、盖玻片金属小镊子、小刀、玻璃涂

25、棒、载玻片、盖玻片灭菌时，应先将其浸泡在灭菌时，应先将其浸泡在75%酒精溶液中，使用时从酒精溶液中，使用时从酒精溶液中取出来，迅速通过火焰，瞬间灼烧灭菌。酒精溶液中取出来，迅速通过火焰，瞬间灼烧灭菌。热空气灭菌热空气灭菌 生产上常用的灭菌条件为生产上常用的灭菌条件为160-170、1-1.5h。（2）湿热灭菌）湿热灭菌 利用饱和蒸汽灭菌。广泛用于工业生产中大量培利用饱和蒸汽灭菌。广泛用于工业生产中大量培养基、设备、管路及阀门的灭菌。养基、设备、管路及阀门的灭菌。二、湿热灭菌原理 热阻热阻:指某一微生物在某一种特定条件（主要是温指某一微生物在某一种特定条件（主要是温度和加热方式）下的致死时间。度

26、和加热方式）下的致死时间。相对热阻：指某一微生物在某条件下的致死时间相对热阻：指某一微生物在某条件下的致死时间与另一微生物在相同条件下的致死时间的比值。与另一微生物在相同条件下的致死时间的比值。第二节 培养基和发酵设备的灭菌 过程一、灭菌前的准备工作一、灭菌前的准备工作 设备检查设备检查二、培养基及发酵设备的灭菌（一）空罐灭菌（一）空罐灭菌 空罐灭菌又称空消，是指将饱和蒸汽通入空罐灭菌又称空消，是指将饱和蒸汽通入未加培养基的发酵罐或种子罐内，进行罐体湿热灭菌的未加培养基的发酵罐或种子罐内，进行罐体湿热灭菌的过程。过程。优点：罐内死角少，蒸汽传热效率高，灭菌效果好。优点：罐内死角少，蒸汽传热效率

27、高，灭菌效果好。适用范围：没有使用的发酵罐、染菌罐、发酵罐适用范围：没有使用的发酵罐、染菌罐、发酵罐更换菌种、培养基连续灭菌工艺、发酵罐及附属设备。更换菌种、培养基连续灭菌工艺、发酵罐及附属设备。（二）实罐灭菌 实罐灭菌又称为分批灭菌，是将饱和蒸汽直接通实罐灭菌又称为分批灭菌，是将饱和蒸汽直接通入装有配制好的培养基的发酵设备中进行灭菌的一种入装有配制好的培养基的发酵设备中进行灭菌的一种方法，简称实消。方法，简称实消。优点：不需要专门的灭菌设备，投资少，操作简优点：不需要专门的灭菌设备，投资少，操作简单，灭菌效果可靠。单，灭菌效果可靠。缺点：设备利用率较低；灭菌过程需要时间较长，缺点：设备利用率

28、较低；灭菌过程需要时间较长，培养基营养成分破坏较多。培养基营养成分破坏较多。该法多用于中小型发酵罐和种子罐的灭菌。该法多用于中小型发酵罐和种子罐的灭菌。注意：1、原料切忌结块，配料时应开动搅拌器，将各种粉饼块、原料切忌结块，配料时应开动搅拌器，将各种粉饼块打碎、搅拌均匀。打碎、搅拌均匀。2、凡进口在培养基液面下的管道应不断通入蒸汽，在、凡进口在培养基液面下的管道应不断通入蒸汽，在液面上的其余各管应排放蒸汽，这样才能保证灭菌彻液面上的其余各管应排放蒸汽，这样才能保证灭菌彻底，不留死角。底，不留死角。3、灭菌工程中要不时地搅拌，以利于泡沫破裂。、灭菌工程中要不时地搅拌，以利于泡沫破裂。（三）连续灭

29、菌 连续灭菌是将培养基在发酵罐外，通过专用灭菌连续灭菌是将培养基在发酵罐外，通过专用灭菌装置，连续不断加热，维持保温和冷却后，送入已灭装置，连续不断加热，维持保温和冷却后，送入已灭菌的发酵罐内的工艺过程，又称连消。菌的发酵罐内的工艺过程，又称连消。优点：发酵罐利用率高；热能利用较合理，适于优点：发酵罐利用率高；热能利用较合理，适于自动化控制。自动化控制。缺点：设备多，投资大，中小型发酵生产企业应缺点：设备多，投资大，中小型发酵生产企业应用较少。用较少。根据灭菌过程中使用的设备及工艺，将连消分为三种形式：1、由连消塔、维持罐和冷却器组成的灭菌系统、由连消塔、维持罐和冷却器组成的灭菌系统 该灭菌系

30、统使用的设备包括：配料罐、连消塔、维该灭菌系统使用的设备包括：配料罐、连消塔、维持罐、冷却器。持罐、冷却器。2、蒸汽喷射连续灭菌系统、蒸汽喷射连续灭菌系统 喷射式加热器在国内大多数发酵工厂采用的培养基喷射式加热器在国内大多数发酵工厂采用的培养基加热装置。加热装置。3、由热交换器组成的灭菌系统、由热交换器组成的灭菌系统 板式热交换器传热系数大，流程利用合理，节省大板式热交换器传热系数大，流程利用合理，节省大量的蒸汽和冷却水，因而广泛利用。量的蒸汽和冷却水，因而广泛利用。三、发酵罐附属设备、空气过滤器及管路等的灭菌（一）发酵罐附属设备的灭菌（一）发酵罐附属设备的灭菌 包括补料罐、计量罐和油罐等。包

31、括补料罐、计量罐和油罐等。空罐灭菌使罐内蒸汽压力达到空罐灭菌使罐内蒸汽压力达到1.5105Pa，保温，保温45min。补料罐的实罐灭菌条件应视物料性质而定。补料罐的实罐灭菌条件应视物料性质而定。（二）空气过滤器的灭菌 灭菌时，总蒸汽压力为（灭菌时，总蒸汽压力为（3-3.5）105Pa，总过滤器，总过滤器保温灭菌时间为保温灭菌时间为1.5-2h，吹干时间为，吹干时间为2-4h；中小型过；中小型过滤器一般保温滤器一般保温45-60min，吹干需，吹干需1-2h。（三）管路的灭菌 管路灭菌所用的蒸汽压力一般为（管路灭菌所用的蒸汽压力一般为（3-3.5）105Pa，灭菌保温时间为灭菌保温时间为1h二、

32、培养基及发酵设备的灭菌（一）空罐灭菌（一）空罐灭菌 定义：又称空消。是指将饱和蒸汽通入未加入培养定义：又称空消。是指将饱和蒸汽通入未加入培养基的发酵罐或种子罐内，进行罐体湿热灭菌的过程。基的发酵罐或种子罐内，进行罐体湿热灭菌的过程。优点：空罐灭菌时，罐内死角少，蒸汽传热效率高，优点：空罐灭菌时，罐内死角少，蒸汽传热效率高，灭菌效果好。灭菌效果好。第三节 常见灭菌问题的分析及处理一、影响培养基灭菌的因素一、影响培养基灭菌的因素 培养基成分培养基成分 油脂、糖类、蛋白质、有机物需要灭菌温度高；油脂、糖类、蛋白质、有机物需要灭菌温度高；盐类、色素有利于灭菌的进行。盐类、色素有利于灭菌的进行。PH值值

33、 培养积极的培养积极的PH值愈低，灭菌所需的时间愈短。值愈低，灭菌所需的时间愈短。培养基中的颗粒大小培养基中的颗粒大小 1mm的颗粒影响不大。的颗粒影响不大。泡沫泡沫 加入少量消泡剂加入少量消泡剂 二、灭菌过程中常见的问题及处理方法灭菌后培养基质量差灭菌后培养基质量差 控制好灭菌温度及灭菌时间、调整好原料的灭菌顺序控制好灭菌温度及灭菌时间、调整好原料的灭菌顺序空气突然中断空气突然中断 关闭个空气进气阀。处理顺序：发酵罐关闭个空气进气阀。处理顺序：发酵罐种子罐种子罐补料罐补料罐消沫剂罐消沫剂罐计量罐。计量罐。蒸汽压力变化蒸汽压力变化 空气过滤器压差过大空气过滤器压差过大 饱和蒸汽温度与压力不对应

34、饱和蒸汽温度与压力不对应 消后培养基带菌：设备损坏、密封不严以及空气过滤消后培养基带菌：设备损坏、密封不严以及空气过滤系统带菌等系统带菌等 第四章 种子的扩大培养 种子的制备是指由保藏的菌种开始，经过不断的种子的制备是指由保藏的菌种开始，经过不断的扩大培养，使菌体数量达到能够满足生产中发酵罐或扩大培养，使菌体数量达到能够满足生产中发酵罐或者实验室摇瓶发酵接种量的需要所涉及的菌种培养的者实验室摇瓶发酵接种量的需要所涉及的菌种培养的过程。过程。适合于工业化发酵生产的种子必须满足以下条件：适合于工业化发酵生产的种子必须满足以下条件：1、生长活力强，移种至发酵罐后能迅速生长，延滞期短。、生长活力强，移

35、种至发酵罐后能迅速生长，延滞期短。2、菌体的生理特性及生产能力稳定。、菌体的生理特性及生产能力稳定。3、菌体总量及浓度能满足发酵罐接种量的要求。、菌体总量及浓度能满足发酵罐接种量的要求。4、无杂菌污染。、无杂菌污染。以抗生素发酵生产的种子制备过程为例：以抗生素发酵生产的种子制备过程为例：其种子的制备一般包括在固体培养基上生产大量其种子的制备一般包括在固体培养基上生产大量孢子的制备过程和在液体培养基中培养大量菌丝的种孢子的制备过程和在液体培养基中培养大量菌丝的种子制备工程。子制备工程。第一节 固体孢子制备 一般繁殖能力强、孢子数量多的菌种可用固体孢子一般繁殖能力强、孢子数量多的菌种可用固体孢子进

36、罐。进罐。一、孢子制备的过程一、孢子制备的过程1、霉菌孢子制备、霉菌孢子制备 多数采用大米、小米、麦麸之类的自然培养基。多数采用大米、小米、麦麸之类的自然培养基。优点：培养基简单易得、成本低、培养基比表面积优点：培养基简单易得、成本低、培养基比表面积大，获得孢子数量比营养琼脂斜面多。大，获得孢子数量比营养琼脂斜面多。e.g 产黄青霉菌产黄青霉菌(P.chrysogonum)原始菌种原始菌种 斜面试管斜面试管 获得孢子获得孢子 250ml 茄茄子瓶（大米或小米）子瓶（大米或小米）25 28 ，414天天 成熟（在成熟（在真空下抽去水分，使水分含量在真空下抽去水分，使水分含量在10%以下，于以下，

37、于4 冰冰箱保存）。箱保存）。对于不产孢子的赤霉素生产菌对于不产孢子的赤霉素生产菌（Gibberelline fujikuroi），也可用大米固体培），也可用大米固体培养基在茄子瓶中培养菌丝体，用作种子罐种子。养基在茄子瓶中培养菌丝体，用作种子罐种子。产孢子能力不强或孢子发芽慢的菌种，产孢子能力不强或孢子发芽慢的菌种，如产链霉素的灰色链霉菌（如产链霉素的灰色链霉菌（Sgriseus ），产卡），产卡那霉素的卡那链霉菌那霉素的卡那链霉菌（Skanamyceticu），可），可以用摇瓶液体培养法，孢子接入含液体培养基的以用摇瓶液体培养法，孢子接入含液体培养基的摇瓶中，于摇床上培养，获得菌丝体，作为

38、种子。摇瓶中，于摇床上培养，获得菌丝体，作为种子。不产孢子的细菌，如生产谷氨酸的棒状不产孢子的细菌，如生产谷氨酸的棒状杆菌（杆菌（Corynebacterium）、短杆菌）、短杆菌（Brevibacterium），生产上一般采用斜面营养），生产上一般采用斜面营养细胞进行扩培，再转入液体摇瓶培养，获得细胞细胞进行扩培，再转入液体摇瓶培养，获得细胞悬液再接种。悬液再接种。2、放线菌孢子制备、放线菌孢子制备 放线菌的孢子多数采用琼脂斜面培养基来制备，放线菌的孢子多数采用琼脂斜面培养基来制备，培养基中含有适合产孢子的营养成分，如麸皮、蛋白培养基中含有适合产孢子的营养成分，如麸皮、蛋白胨和一些无机盐类物

39、质等。胨和一些无机盐类物质等。放线菌的发酵生产工艺流程：放线菌的发酵生产工艺流程：沙土管沙土管母斜面母斜面子斜面子斜面种子罐种子罐发酵罐发酵罐沙土管沙土管母斜面母斜面摇瓶菌丝摇瓶菌丝种子罐种子罐发酵罐发酵罐3、细菌孢子制备、细菌孢子制备 发酵生产的工艺流程：发酵生产的工艺流程：安剖管安剖管斜面斜面F1（第一代）（第一代）斜面斜面F2（第二代）（第二代）种子罐种子罐发酵罐发酵罐 细菌的培养温度多为细菌的培养温度多为37，培养时间一般为，培养时间一般为1-2天。天。二、孢子制备的技术要点1、霉菌类、霉菌类 菌落分散、挑选菌落中央的孢子、孢子悬液浓度菌落分散、挑选菌落中央的孢子、孢子悬液浓度适当、混

40、合均匀。适当、混合均匀。2、放线菌类、细菌类、放线菌类、细菌类 灭菌后的琼脂培养基在放凉且未凝固时摆成斜面。灭菌后的琼脂培养基在放凉且未凝固时摆成斜面。待斜面凝固后置待斜面凝固后置37培养培养2-3天，经检查无杂菌和无冷天，经检查无杂菌和无冷凝水后备用。凝水后备用。第二节 液体种子制备 液体种子的制备是将固体培养基上培养好的孢子液体种子的制备是将固体培养基上培养好的孢子或菌体转入到液体培养基中培养，使其繁殖成大量菌或菌体转入到液体培养基中培养，使其繁殖成大量菌丝或菌体的过程。丝或菌体的过程。生产种子的制备包括：摇瓶种子制备和种子罐种生产种子的制备包括：摇瓶种子制备和种子罐种子制备。子制备。一、

41、摇瓶种子制备 将斜面种子或米孢子接种入装在锥形瓶内的液体将斜面种子或米孢子接种入装在锥形瓶内的液体营养培养基中，在摇床上进行振荡培养所获得的液体营养培养基中，在摇床上进行振荡培养所获得的液体种子，称作摇瓶种子。种子，称作摇瓶种子。1、工艺流程、工艺流程 培养基配制培养基配制分装分装灭菌灭菌接种接种恒温振荡培养恒温振荡培养摇摇瓶种子瓶种子 斜面种子或米孢子斜面种子或米孢子2、培养基配制、培养基配制 培养基的配方和培养条件与种子罐相似，要求氮培养基的配方和培养条件与种子罐相似，要求氮源丰富，利于菌丝生长。源丰富，利于菌丝生长。3、接种、接种 采用菌悬液接种法，即用无菌蒸馏水将斜面种子采用菌悬液接种

42、法，即用无菌蒸馏水将斜面种子或米孢子粒上的细胞或孢子洗下，制成细胞或孢子悬或米孢子粒上的细胞或孢子洗下，制成细胞或孢子悬液，按一定题解或者一定细胞数接种至摇瓶种子培养液，按一定题解或者一定细胞数接种至摇瓶种子培养基中。基中。4、培养、培养 摇瓶种子在恒温摇床上进行培养。摇床分旋转式摇瓶种子在恒温摇床上进行培养。摇床分旋转式和往复式，抗生素工厂一般采用的是旋转式。和往复式，抗生素工厂一般采用的是旋转式。5、保存、保存 摇瓶种子应当在培养成熟后立即使用。如果不使用，摇瓶种子应当在培养成熟后立即使用。如果不使用，可置可置4冰箱中保存，保存期最好不要超过冰箱中保存，保存期最好不要超过3天。天。二、种子

43、罐种子制备 种子罐的作用是使接入种子罐内数量有限的孢子发芽、种子罐的作用是使接入种子罐内数量有限的孢子发芽、生长并繁殖成大量菌体，满足接种发酵罐的需要。生长并繁殖成大量菌体，满足接种发酵罐的需要。孢子或者摇瓶菌丝接入到体积较小的种子罐中，经孢子或者摇瓶菌丝接入到体积较小的种子罐中，经过培养后形成大量的菌丝，该种子称为一级种子。过培养后形成大量的菌丝，该种子称为一级种子。把一级种子转入到发酵罐内发酵，称为二级发酵。把一级种子转入到发酵罐内发酵，称为二级发酵。种子罐级数越少越好，原因：种子罐级数越少越好，原因：1、简化生产工艺和控制、简化生产工艺和控制2、减少接种带来的染菌机会、减少接种带来的染菌

44、机会 接种量接种量(seed volume)指移入的种子的体积和接种后指移入的种子的体积和接种后培养液的体积比培养液的体积比。接种量的大小决定于生产菌种在发酵罐中的繁殖速度。接种量的大小决定于生产菌种在发酵罐中的繁殖速度。采用较大接种量可以缩短发酵罐中菌体繁殖到达高采用较大接种量可以缩短发酵罐中菌体繁殖到达高峰的时间，使产物形成提前。峰的时间，使产物形成提前。原因：原因：1、种子多，种子液中含有大量的胞外水解酶，有利于对基、种子多，种子液中含有大量的胞外水解酶，有利于对基 质的利用质的利用、生产菌迅速占据了整个培养环境，减少染菌机会。、生产菌迅速占据了整个培养环境，减少染菌机会。但过多，易使菌

45、体（菌丝体）生长过快，培养液粘但过多，易使菌体（菌丝体）生长过快，培养液粘度增加，溶氧降低，产物合成受影响。度增加，溶氧降低，产物合成受影响。e.g.嗜碱性芽孢杆菌生产碱性蛋白酶嗜碱性芽孢杆菌生产碱性蛋白酶 接种接种1%，酶活最高；，酶活最高；1.5%4%影响不大；大于影响不大；大于4%，酶产量明，酶产量明显下降。显下降。第三节 种子质量的控制与分析 发酵生产水平发酵生产水平 种子质量种子质量 菌体本身的遗传特性和培养条件菌体本身的遗传特性和培养条件一、影响孢子质量的因素及其控制1、培养基、培养基原材料的产地、品种、加工方法以及用量原材料的产地、品种、加工方法以及用量水质（地区、季节和水源污染

46、）水质（地区、季节和水源污染）菌种不同菌种不同氮源品种氮源品种2、培养条件 温度温度 培养温度控制低一些，有利于孢子的形成。培养温度控制低一些，有利于孢子的形成。湿度湿度 在北方相对湿度控制在在北方相对湿度控制在40%-45%，而南方相对湿度，而南方相对湿度控制在控制在35%-42%，所得孢子质量较好。，所得孢子质量较好。真菌对湿度要求偏高，而放线菌对湿度要求偏低。真菌对湿度要求偏高，而放线菌对湿度要求偏低。培养时间培养时间 过于年轻的孢子经不起冷藏，过于衰老的孢子会导过于年轻的孢子经不起冷藏，过于衰老的孢子会导致生产能力下降，孢子的培养时间应控制在孢子量多、致生产能力下降，孢子的培养时间应控

47、制在孢子量多、孢子成熟、发酵产量正常的阶段终止培养孢子成熟、发酵产量正常的阶段终止培养。接种量接种量 一般传代用的斜面孢子要求菌落分布较稀，适于挑一般传代用的斜面孢子要求菌落分布较稀，适于挑选单个菌落进行传代培养。接种摇瓶或进罐的斜面孢选单个菌落进行传代培养。接种摇瓶或进罐的斜面孢子，要求菌落密度适中或稍密，孢子数达到要求标准。子，要求菌落密度适中或稍密，孢子数达到要求标准。二、影响种子质量的因素及其控制1、培养基、培养基 要求要求 氮源和维生素含量较高；营养成分尽可能与发氮源和维生素含量较高；营养成分尽可能与发酵培养基接近。酵培养基接近。2、培养条件、培养条件 选择最适温度；前期需氧量较少，

48、后期需氧量较多，选择最适温度；前期需氧量较少，后期需氧量较多，应适当增大供氧量；补料工艺应适当增大供氧量；补料工艺3、种龄、种龄 在工业发酵生产中，一般都选在生命力最旺盛的对在工业发酵生产中，一般都选在生命力最旺盛的对数生长期，菌体量尚未达到最高峰时移种。数生长期，菌体量尚未达到最高峰时移种。4、接种量、接种量 多数抗生素发酵的接种量为多数抗生素发酵的接种量为7%-15%，有时可加大到，有时可加大到20%-25%。三、种子质量标准1、种子的生长状况、种子的生长状况 菌体形态、菌体浓度以及培养液的外观，是种子质菌体形态、菌体浓度以及培养液的外观，是种子质量的重要指标。量的重要指标。2、营养物质含

49、量与、营养物质含量与PH值变化值变化3、产物生产量、产物生产量4、特殊酶活力、特殊酶活力四、种子异常分析1、菌种生长发育缓慢或过快、菌种生长发育缓慢或过快 通入种子罐的无菌空气温度较低或培养基的灭菌质通入种子罐的无菌空气温度较低或培养基的灭菌质量较差是种子生长、代谢缓慢的主要原因。量较差是种子生长、代谢缓慢的主要原因。2、菌丝结团、菌丝结团 菌丝结团和搅拌效果差、接种量小有关。菌丝结团和搅拌效果差、接种量小有关。3、菌丝黏壁、菌丝黏壁 菌丝黏壁主要原因是搅拌效果不好，搅拌时泡沫过菌丝黏壁主要原因是搅拌效果不好，搅拌时泡沫过多，以及种子罐的装料系数过小等。多，以及种子罐的装料系数过小等。第四节

50、青霉素生产的种子制备制备过程制备过程 安剖管安剖管斜面孢子斜面孢子大米孢子大米孢子一级种子一级种子二级种二级种子子发酵发酵一、斜面孢子 培养基：甘油、葡萄糖、蛋白胨等培养基：甘油、葡萄糖、蛋白胨等 培养条件：培养条件：25、7天、湿度天、湿度50%培养基特点：有利于长孢子，用量少而精细培养基特点：有利于长孢子，用量少而精细二、大米孢子培养基：大米及氮源（玉米浆）培养基：大米及氮源（玉米浆）培养条件：培养条件：25、7天、控制湿度天、控制湿度培养基特点：成本低、米粒之间结构疏松提高比表面积培养基特点：成本低、米粒之间结构疏松提高比表面积和养的传质，营养适当（要求大米的白点小）有利于和养的传质，营