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1、中药化学与分析教研室现代仪器分析 经典液相色谱法经典液相色谱法经典液相色谱法v包括经典柱色谱法和平面色谱法。包括经典柱色谱法和平面色谱法。v经经典典液液相相色色谱谱法法是是在在常常压压下下靠靠重重力力或或毛细作用输送流动相的色谱方法。毛细作用输送流动相的色谱方法。v经典色谱法与现代色谱法的区别：经典色谱法与现代色谱法的区别：主主要要在在于于输输送送流流动动相相方方式式、固固定定相相种种类类和和规规格格、分分离离效效能能、分分析析速速度度和和检测灵敏度等方面。检测灵敏度等方面。经典色谱法经典色谱法优点优点：v设备简单，操作方便。v分析速度快。v广泛的应用：在药物研究、食品化学、环境化学、临床化学
2、、法检分析及化学化工等行业都有用。（特别是在天然药物的分离研究及定性鉴别等方面发挥着独特的作用，是中国药典中药的主要鉴别手段之一。）内容简介 第二节第二节 分配色谱法分配色谱法 2第四节第四节 尺寸排阻色谱法尺寸排阻色谱法4第一节第一节 吸附色谱法吸附色谱法 3 1 第三节第三节 离子交换色谱法离子交换色谱法 3 3第五节第五节 聚酰胺色谱法聚酰胺色谱法 3 5第一节第一节 吸附柱色谱法吸附柱色谱法一、定义一、定义：固定相为固体吸附剂、流动相为液相固定相为固体吸附剂、流动相为液相的柱色谱法的柱色谱法分离原理：分离原理：K K值不同而产生差速迁移值不同而产生差速迁移应用：应用：样品预处理、化学分
3、离样品预处理、化学分离（一）吸附与吸附平衡（一）吸附与吸附平衡(二)吸附等温线(absorption isotherm)v吸咐等温线：吸咐等温线：指在一定温度下，某一组分在固定相和流动相之间达到平衡时，以组分在固定相中的浓度Cs为纵坐标，以组分在流动相中的浓度Cm为横坐标得到的曲线。v它是分配系数K的的图示方法图示方法 v吸咐等温线有三种类型：吸咐等温线有三种类型：线型线型、凸型凸型和和凹型凹型。（高斯峰）（拖尾峰）（前延峰）三种等温线的讨论v1线形线形吸附等温线：吸附等温线：（高斯峰）整个工作浓度范围K是常数，谱带移动速度与浓度无关，故色谱峰前沿和后沿都是对称的，呈高斯分布。v2 2凸形凸形
4、吸附等温线吸附等温线：（拖尾峰）K随浓度变化，浓度 ，K变，溶质移动速度加快，故色谱峰有一个变锐的前沿和扩散的后沿。v3 3凹形凹形吸附等温线：吸附等温线：（前延峰）K随浓度变化，浓度 ，K变，故色谱峰有一个扩散的前沿和锐利的后沿。进样量对保留值的影响（1）对称峰的保留值与进样量无关（2）拖尾峰的保留值随进样量增加而减少（3）前延峰的保留值与进样量增加而增加 所以，为了保证流出曲线的对称性，防止拖尾，在色谱分析中就应该控制溶质的量，每种色谱方法有一定的线性范围线性范围，超出了这一范围，不对称峰就会出现。二、吸附剂二、吸附剂吸附色谱的固定相为吸附剂，有以下特点（要求）：吸附色谱的固定相为吸附剂，
5、有以下特点（要求）：1)1)较大的比表面和一定的吸附能力较大的比表面和一定的吸附能力大于大于200200M M2 2/克克2)2)较好的选择性较好的选择性3)3)良好的稳定性（化学惰性）良好的稳定性（化学惰性），且不溶于洗脱剂，且不溶于洗脱剂4)4)粒度均匀，粒度要细，使用方便粒度均匀，粒度要细，使用方便(d=75150m，即，即100200目目)(一一)常用的吸附剂常用的吸附剂 吸附剂可分为有机和无机两大类。吸附剂可分为有机和无机两大类。有机类：活性炭、淀粉、蔗糖、乳糖、聚酰胺以及纤维素等；有机类：活性炭、淀粉、蔗糖、乳糖、聚酰胺以及纤维素等；无机类：氧化铝、硅胺、氧化镁、碳酸钙、磷酸钙、滑
6、石粉、无机类：氧化铝、硅胺、氧化镁、碳酸钙、磷酸钙、滑石粉、硅藻土等。其中以硅胶和氧化铝、聚酰胺较为常用。硅藻土等。其中以硅胶和氧化铝、聚酰胺较为常用。1.硅 胶 v常以SiO2XH2O表示，是多孔性的硅氧交链结构。其骨架表面的硅醇基，能吸附大量水分，硅胶的活性与含水量有关。v硅胶由于硅醇基的存在，能吸附大量水分，这种表面吸附水称为“结合水”，加热至 105110左右能除去。称为“活化”硅胶硅胶：中等极性吸附剂中等极性吸附剂吸附机制：吸附机制：表面的硅醇基，与物质形成氢键表面的硅醇基，与物质形成氢键适用范围：具微酸性，适于酸性和中性物质适用范围：具微酸性，适于酸性和中性物质失活：失活：水与硅醇
7、基结合使其失去活性水与硅醇基结合使其失去活性活化：活化：105-110加热加热30min粒度：粒度：100200目目硅醇基的两种形式硅醇基的两种形式:硅醚结构硅醚结构1.游游离离型型2.键键合合型型到到200 200 非极性，不再对极性化合物有选择性保留作用而失去色谱活性2 2.氧化铝：氧化铝：强极性吸附剂强极性吸附剂吸附机制：碱性位置、吸附机制：碱性位置、Al-OH粒度：粒度：100200目目分类：碱性、中性和酸性分类：碱性、中性和酸性活化温度：活化温度：200400适于分离酸适于分离酸性化合物，性化合物，及对酸稳定及对酸稳定的中性物质的中性物质 A酸性氧化铝酸性氧化铝酸性氧化铝酸性氧化铝(
8、pH54)适用于碱性适用于碱性和中性化合和中性化合物的分离物的分离 C碱性氧化铝碱性氧化铝碱性氧化铝碱性氧化铝 (pH910)适用范围广，适用范围广，分离生物碱分离生物碱等，及酸碱等，及酸碱不稳定成分不稳定成分 B中性氧化铝中性氧化铝中性氧化铝中性氧化铝(pH7.5 pH7.5)2.2.氧化铝氧化铝 ：为一种吸附力较强的吸附剂，具有分离能力强、为一种吸附力较强的吸附剂，具有分离能力强、活性可以控制等优点。活性可以控制等优点。(二)吸附剂的活性硅胶含水量硅胶含水量吸附剂的活性和含水量有一定的关系：吸附剂的活性和含水量有一定的关系：（1 1）含水量愈高，其吸附活性愈低，（）含水量愈高，其吸附活性愈
9、低，（2 2）活性级数愈大，吸附力就愈弱。）活性级数愈大，吸附力就愈弱。氧化铝与硅胶相比：氧化铝与硅胶相比：副反应多、回收率低，样品处理量大、副反应多、回收率低，样品处理量大、分离效果好分离效果好255151036活性级别活性级别 氧化铝含氧化铝含水量（水量（%）038 015（活度测定法：活度测定法：BrockmamnBrockmamn法法）3 3.聚酰胺聚酰胺商品名：锦纶、尼龙商品名：锦纶、尼龙-6 白色多孔的非晶型粉末白色多孔的非晶型粉末 不溶于水和有机溶剂，易溶于甲酸、酚、浓酸不溶于水和有机溶剂，易溶于甲酸、酚、浓酸分离机制：主要是氢键吸附分离机制：主要是氢键吸附适用对象：黄酮类适用对
10、象：黄酮类粒度：粒度：6060100100目目三、色谱条件的选择酰胺类醇类酰胺类醇类酚类羧酸类酚类羧酸类 二甲胺酯类酮类醛类硫醇胺类二甲胺酯类酮类醛类硫醇胺类醚硝基化合物醚硝基化合物烷烃烯烃烷烃烯烃烷烃烯烃醚硝基化合物二甲胺酯类酮类醛类硫醇烷烃烯烃醚硝基化合物二甲胺酯类酮类醛类硫醇胺类酰胺类醇类酚类羧酸类胺类酰胺类醇类酚类羧酸类 常见化合物按其极性由小到大顺序为：常见化合物按其极性由小到大顺序为：常用溶剂的极性顺序为：常用溶剂的极性顺序为：吸附剂的极性顺序为：吸附剂的极性顺序为：吸附剂和流动相的选择吸附剂和流动相的选择1、被测物质的结构、极性与吸附力、被测物质的结构、极性与吸附力吸附规律：吸附
11、规律：通常组分极性强，吸附强，后出柱通常组分极性强，吸附强，后出柱 组分极性弱，吸附弱，先出柱组分极性弱，吸附弱，先出柱多糖、蛋白质等大分子、生物碱盐多糖、蛋白质等大分子、生物碱盐苷类（皂苷、黄酮苷、蒽醌苷）苷类（皂苷、黄酮苷、蒽醌苷）黄酮、蒽醌等苷元、有机酸黄酮、蒽醌等苷元、有机酸香豆素、萜类、挥发油等亲脂性成分香豆素、萜类、挥发油等亲脂性成分极 性 渐 小2 2、吸附剂的选择及用量、吸附剂的选择及用量酸性成分：硅胶酸性成分：硅胶 碱性成分：氧化铝碱性成分：氧化铝黄酮类：聚酰胺黄酮类：聚酰胺化学分离：氧化铝用量为样品量的化学分离：氧化铝用量为样品量的20-50倍，倍，硅胶为硅胶为30-60倍
12、倍除杂：一般用量除杂：一般用量10倍倍3、流动相的选择、流动相的选择 “相似相溶相似相溶”原理原理 常用：不同配比的甲醇常用：不同配比的甲醇-水或甲醇水或甲醇 亲脂性成分用氯仿、乙酸乙酯亲脂性成分用氯仿、乙酸乙酯吸附剂类型：吸附剂类型：（1）硅胶：）硅胶：硅胶硅胶H，硅胶硅胶G，硅胶硅胶GF254 （2）氧化铝：氧化铝：氧化铝氧化铝G，氧化铝氧化铝H，氧化铝氧化铝HF254 （3）聚酰胺聚酰胺展开剂选择：展开剂选择：单一、二元、多元单一、二元、多元展开剂？展开剂？选择三原则：选择三原则：综合考虑综合考虑1.被分离组分性质被分离组分性质，2.展开剂极性展开剂极性，3.吸附剂活度吸附剂活度1.三角
13、形选择法三角形选择法固定相固定相流动相流动相2.可用点滴实验法选择展开剂v先用单一溶剂展开，先用单一溶剂展开，若若R Rf f值太小，值太小，则加入一定量极性则加入一定量极性强的溶剂，如乙醇、丙酮等，强的溶剂，如乙醇、丙酮等，如果如果R Rf f值太大，值太大，则加入适量极性则加入适量极性弱的溶剂弱的溶剂(如环己烷、石油醚等如环己烷、石油醚等)，以降低极性。，以降低极性。v 可加入一定比例的可加入一定比例的酸或碱酸或碱,使使斑点集中。斑点集中。v为了提高分离一般用为了提高分离一般用二元二元甚至甚至五元五元展开系统。展开系统。四、操作方法四、操作方法 1、色谱柱的制备、色谱柱的制备 要求：填装均
14、匀、紧密，不能有气泡。要求：填装均匀、紧密，不能有气泡。装柱时柱要垂直，表面平整。装柱时柱要垂直，表面平整。固定相的用量适宜。固定相的用量适宜。柱体：色谱柱、注射器、滴定管柱体：色谱柱、注射器、滴定管 方法：干装法、湿装法方法：干装法、湿装法2、上样、上样3 3、洗脱、洗脱四、操作方法 根据被分离物质而定，内径与柱长根据被分离物质而定，内径与柱长的比例，一般在的比例，一般在1101102020之间之间 吸附剂的用量应根据被分离的样品量而定 色谱柱的制备色谱柱的制备(一一)柱色谱柱色谱（玻璃、石英柱、尼龙柱）吸附剂的颗粒大小一般应在吸附剂的颗粒大小一般应在100100200200目目 (1)玻璃
15、柱干装法干装法 湿装法湿装法 1.1.色谱柱的制备色谱柱的制备 （原则是填充均匀！）（原则是填充均匀！）(2)尼龙柱 应有一定的强度，且易于切割；对有机溶剂呈惰性，能用手工热封；能透过紫外线，便于将无色物质在柱上定位。填充时将一端封闭，底部塞入玻璃棉并打上小孔，装匀即可。柱色谱的制备流程柱色谱的制备流程 (四步曲）四步曲）1.1.色谱柱的制备色谱柱的制备2.2.加样加样加样加样 3.3.3.3.洗脱洗脱洗脱洗脱4检检 出出 装柱装柱（1）溶解样品）溶解样品（2）上样）上样（3 3）洗脱）洗脱 采用相应的物理和化采用相应的物理和化学方法进行检出。学方法进行检出。常用的检出方法很多，常用的检出方法
16、很多，如化学反应法、如化学反应法、TLC及其它方法及其它方法(1)(1)玻璃柱玻璃柱(2)(2)尼龙柱尼龙柱vv2.2.加样与洗脱加样与洗脱加样与洗脱加样与洗脱(二)薄层色谱(thin layer chromatography)TLCTLC：固定相（吸附剂或载体）涂布成固定相（吸附剂或载体）涂布成一均匀薄层，点样，（密闭的容器中）一均匀薄层，点样，（密闭的容器中）展开，斑点显色，（与对照物质）比较展开，斑点显色，（与对照物质）比较进行定性定量。进行定性定量。1.供试品溶液2.对照品溶液3.阴性对照溶液冰片的薄层色谱图特点：特点：v快，需十至几十分钟，同时展开多个试样。快，需十至几十分钟，同时展
17、开多个试样。v试样预处理简单，对试样限制少。试样预处理简单，对试样限制少。v载样量比较大，适用于制备。载样量比较大，适用于制备。v仪器简单，操作方便。仪器简单，操作方便。v分离能力较强。分离能力较强。v灵敏度较高。灵敏度较高。薄层色谱法的应用广泛v微量、快速、简便的分离分析技术；v广泛应用于药用植物药用植物的分析中，并作为植物药鉴别方法被世界上多数药典收录。v2005版药典中现代分析技术得到进一步扩大应用。药典药典一部品种中薄层色谱法用于鉴别的已达l523项，用于含量测定的为45项；v对于大量的有机化合物大量的有机化合物都能直接检测，包括很难用于气相色谱分析的较高沸点样品；按分离机理：吸附、分
18、配、离子交换等。按分离机理：吸附、分配、离子交换等。v吸附薄层色谱法吸附薄层色谱法原理：组分在薄层板上吸附、解吸附、再吸附、再解原理：组分在薄层板上吸附、解吸附、再吸附、再解吸附的过程。吸附的过程。组分因吸附系数不等实现分离。组分因吸附系数不等实现分离。（吸附薄层应用最为广泛，重点讨论！吸附薄层应用最为广泛，重点讨论！）薄层色谱法的主要类型和原理薄层色谱法的主要类型和原理薄层色谱法的主要类型和原理薄层色谱法的主要类型和原理v分配薄层色谱法原理：多次分配的过程，分配系数（溶解度）不等实现分离分类：正相色谱、反相色谱正相色谱、反相色谱正相色谱正相色谱：水为固定相（硅胶载体），有机溶剂为：水为固定相
19、（硅胶载体），有机溶剂为流动相。流动相。极性强的组分极性强的组分K大，大，Rf值小。值小。反相色谱反相色谱：烷基化学键合相为固定相，水有机溶：烷基化学键合相为固定相，水有机溶剂为流动相。剂为流动相。极性强的组分极性强的组分K小，小，Rf值大。值大。薄层色谱操作方法薄层色谱操作方法（四步曲）（四步曲）1.制板制板 均匀均匀2.点样点样 集中集中3.展开展开(多种方式多种方式)预饱和与否？预饱和与否？4.斑点检出斑点检出 显色显色1.1.制制 板板（1）手工制板v不含粘合剂的软板及含粘合剂的硬板v板材：玻璃板v规格：10cm10cm,10cm15cm,20cm10cm或20cm20cm的2mm厚v
20、制板厚度：0.3、0.4、0.5及0.6mm四种规格 硅胶的硅胶的活度：活度：与含水量的关系：含水量高，与含水量的关系：含水量高，活性活性级高级高，活度低。，活度低。活化：活化：加热至加热至100100左右，除去吸附水提高活度。左右，除去吸附水提高活度。3030minmin左右左右 （注意温度不可过高）（注意温度不可过高）分离效率：分离效率：与其粒度、孔径及表面积等有关。与其粒度、孔径及表面积等有关。常用硅胶：常用硅胶：硅胶硅胶H H，不含黏合剂不含黏合剂硅胶硅胶G G，含煅石膏黏合剂含煅石膏黏合剂硅胶硅胶GF254GF254，含煅石膏和一种无机荧光剂，即含煅石膏和一种无机荧光剂，即锰激活的硅
21、酸锌，在锰激活的硅酸锌，在254254nmnm紫外光下呈强烈黄绿色紫外光下呈强烈黄绿色荧光背景。荧光背景。仪器装置：（2）预制板由工厂生产出来的商品板，使用方便，涂布均匀，薄层光滑，牢固结实，分离效果及重现性好。加入固定加入固定相匀浆相匀浆2点样成功分离和精确定量的关键成功分离和精确定量的关键点样要求：点样要求：v点样体积：点样体积：110L v点样原点通常应小而圆，点样量大时可以选点样原点通常应小而圆，点样量大时可以选择细带状点样，距板边缘择细带状点样，距板边缘1.0-1.51.0-1.5cmcm；v需要可多次点样（每次挥干后），防止边缘需要可多次点样（每次挥干后），防止边缘效应；效应；v点
22、样量勿超载，防止拖尾；勿伤薄层表面点样量勿超载，防止拖尾；勿伤薄层表面 点样装置：点样装置：1.1.定量毛细管定量毛细管 2.2.手动点样器手动点样器 3.3.薄层自动点样仪薄层自动点样仪1.1.定量毛细管定量毛细管2.2.手动点样器手动点样器3.3.薄层自动点样仪薄层自动点样仪3展开 条件选择决定分离结果条件选择决定分离结果展开原理：差速迁移展开方式：上行、下行、径向、楔形、双向、多次展开等。上行展开：展开剂从下往上爬行。注意事项：注意事项：1.密闭的展开系统（展开缸展开缸）；2.展开剂浸入薄层下端不超过0.50.5cmcm；3.3.点样处不能接触展开剂；点样处不能接触展开剂；4.4.展距一
23、般距展距一般距薄层顶端顶端1-21-2cmcm。展开过程：展开缸内溶剂饱和 再行展开 挥干溶剂 挥干展开剂挥干展开剂再行展开再行展开饱和饱和边缘效应：点于同一薄层的同一物质的斑点，在色谱展开过程中，靠薄层边缘处斑点的Rf值与中心区域斑点的Rf值有所不同，多数呈凹形凹形。减少边缘效应的办法：减少边缘效应的办法：(1)最好用较小体积的展开缸或将薄层在缸内放置一定时间，待溶剂蒸汽达到饱和后再行展开；(2)在展开缸内壁贴上浸湿展开剂的滤纸条；(3)如采用3cm以下的狭小薄层板，只点23个点时，也会减小边缘效应。4斑点的检出斑点的检出（1）光学检出法）光学检出法 自然光下直接观察斑点。可吸收紫外光，发射
24、不同颜色的荧光斑点，在紫外灯下显现不同颜色。紫外分析仪有(254nm)和(366nm)两种灯。在可见紫外光下都不显色，可以用荧光薄层进行分离。（2）试剂显色法）试剂显色法 喷雾显色 浸渍显色 蒸气检出法（用I2，NH3等挥发性物质）五、定性与定量分析五、定性与定量分析 早期的TLC技术，主要用于定性和间接间间接定量。接定量。70 70年代发明年代发明TLC-SCANTLC-SCAN后，定量工作得到后，定量工作得到发展，比较著名的有：发展，比较著名的有：1.1.瑞士瑞士卡玛卡玛CAMAGCAMAG公司（昂贵，性能好）；公司（昂贵，性能好）；2.2.日本岛津日本岛津CSCS系列（便宜，一般用）；系
25、列（便宜，一般用）；3.3.上海科贺生化技术有限公司（国内唯一）上海科贺生化技术有限公司（国内唯一）定性分析定性分析 v比较比较Rf值值、斑点颜色或荧光斑点颜色或荧光v常采用已知标准物质对照（同一板上展开）常采用已知标准物质对照（同一板上展开）v多种展开系统的多种展开系统的Rf值与对照品一致值与对照品一致。定量分析定量分析v洗脱法（间接定量法）洗脱法（间接定量法）v直接定量法直接定量法1.1.目视比较法（目视比较法（如杂质限度检查方法如杂质限度检查方法）2.2.薄层扫描法薄层扫描法薄层色谱法参数薄层色谱法参数v定性参数定性参数1）比移值）比移值(Rf值值)2）相对比移值相对比移值(relati
26、ve Rf；Rr)v相平衡参数相平衡参数1）分配系数）分配系数K=Cs/Cm 2）容量因子）容量因子 k=CsVs/CmVm 定性参数定性参数 1 1比移值比移值(Rf值值)溶质移动距离与流动相移动距离之比。溶质移动距离与流动相移动距离之比。（速度之比？）（速度之比？）Rf=L/L0 （定时展开）定时展开）L为原点（为原点（origin）至斑点中心的距至斑点中心的距离，离，L0为原点至溶剂前沿的距离为原点至溶剂前沿的距离。v与组分及色谱条件（展开剂，展距，与组分及色谱条件（展开剂，展距，薄层板等）有关；薄层板等）有关；v在给定条件下，在给定条件下，R Rf f值为常数，其值值为常数，其值在在0
27、.20.20.80.8之间之间 定性参数定性参数2 2相对比移值相对比移值(relative Rf；Rr)Rr=Rf(i)/Rf(s)=L(i)/L(s)v与组分、色谱条件、参考物质有关。与组分、色谱条件、参考物质有关。vRr值可以大于值可以大于1，也可以小于，也可以小于1。v重现性和可比性均比重现性和可比性均比Rf值好，能消除系统误值好，能消除系统误差（差（参考物质与组分在完全相同的条件下参考物质与组分在完全相同的条件下展开）展开）相平衡参数相平衡参数v分配系数分配系数K=Cs/Cm v容量因子容量因子 k=CsVs/CmVmvK、k与与Rf值的关系：值的关系：相平衡参数与相平衡参数与Rf值
28、关系值关系vK、k与与Rf值关系推导：值关系推导：(与定距展开比较与定距展开比较)Rf=L/L0=u/u0=R=R为保留比（见为保留比（见P224公式）公式）影响影响Rf值最重要的因素是：值最重要的因素是：v吸附剂的性质与展开剂的极性和溶解能力。吸附剂的性质与展开剂的极性和溶解能力。v薄层厚度、展开距离、展开剂的饱和度、点样量薄层厚度、展开距离、展开剂的饱和度、点样量 薄层色谱法定量分析薄层色谱法定量分析 v洗脱法洗脱法（间接定量法）（间接定量法）展开后将被测物斑点或区带捕集，用溶展开后将被测物斑点或区带捕集，用溶剂洗脱，然后再用适当的分析方法剂洗脱，然后再用适当的分析方法(比色法、比色法、分
29、光光度法、气相色谱、荧光分析法分光光度法、气相色谱、荧光分析法等等)测测定含量。定含量。v直接定量法直接定量法1.1.目视比较法（目视比较法（如杂质限度检查方法如杂质限度检查方法）2.2.薄层扫描法（薄层扫描法（TLC-SCANTLC-SCAN）薄层扫描法薄层扫描法 （TLC-SCANTLC-SCAN）用薄层扫描仪直接测量板上被分离化合物斑点的吸吸收收光光、反反射射光光、荧荧光光等进行定量的方法，称为薄薄层扫描法层扫描法。优点：优点：该法快速、简便，结果灵敏、准确，适用于多组分物质和微量组分的定量。薄层扫描法虽然精密度不如HPLC法高，但可作为补充，用于无紫外吸收，或不易用HPLC法分析的组分
30、如人参皂甙、贝母生物碱等。TLC-SCAN TLC-SCAN 试验条件的选择试验条件的选择v薄层色谱条件：原则组分应薄层色谱条件：原则组分应完全分离完全分离，斑点对称斑点对称，均匀均匀，不拖尾不拖尾。v检测方法：检测方法：吸收测定法吸收测定法和和荧光测定法荧光测定法两种。在可两种。在可见、紫外区有吸收的组分，可在见、紫外区有吸收的组分，可在200800200800nmnm范围内范围内采用吸收测定法测定。有荧光的组分，可选择好采用吸收测定法测定。有荧光的组分，可选择好激发光波长（激发光波长（exex）和发射波长（和发射波长（emem），），用荧光用荧光法具有专属性强、灵敏度高和线性范围宽度等特法
31、具有专属性强、灵敏度高和线性范围宽度等特点。点。（3）吸收测定法原理吸收测定法原理：光学系统：光学系统：光源(氘灯与钨灯)、单色器(入口狭缝出口狭缝、光栅等)以及检测器(监测光电倍增管、反射和透射测定光电倍增管)组成。吸收测定类型：吸收测定类型：有反射法和透射法两种。反射法反射法：将光束照射到薄层斑点上，测量反射光的强度；反射光灵敏度较低，受薄层厚度影响较小，基线较稳，信噪比较大，因而使用较多。反射法示意图反射法示意图：单色器单色器光源光源薄层板薄层板斑点斑点检测器检测器透射法：透射法：受薄层厚度影响较大，且玻璃对紫外光有吸收，所以实际应用较少。光源光源薄层板薄层板斑点斑点检测器检测器单色器单
32、色器 薄层扫描仪光学系统结构示意图反射法透射法基本原理与方法基本原理与方法分为薄层吸收扫描薄层吸收扫描及薄层荧光扫描薄层荧光扫描两类方法。1.薄层吸收扫描法的基本原理薄层吸收扫描法的基本原理 用可见光或紫外线的单色光照射展开后的薄层用可见光或紫外线的单色光照射展开后的薄层色谱板，测定薄层色谱斑点色谱板，测定薄层色谱斑点(简称斑点简称斑点)的吸光度的吸光度(A)随展开距离随展开距离(L)的变化，而获得的变化，而获得AL成成ARf曲线，即薄层色谱扫描图曲线，即薄层色谱扫描图(简称扫描图简称扫描图)。曲线上。曲线上的色谱峰面积可用于定量分析。的色谱峰面积可用于定量分析。由于薄层板存在着明显的散射现象
33、，而使斑点由于薄层板存在着明显的散射现象，而使斑点中物质的浓度与吸光度的关系不服从中物质的浓度与吸光度的关系不服从Beer定律，定律，需田需田KubelkaMunk(古柏尔卡古柏尔卡曼克曼克)理论来描理论来描述。述。(该方程式是薄层扫描法的定量分析基础该方程式是薄层扫描法的定量分析基础)。式中Sx是薄层板的散射参数，它与固定相的种类、粒度、薄层厚度及涂布均匀程度有关。式中的X为薄层厚度，1.1 KubelkaMunk理论KubelkaMunk理论说明了固定相的散射参数对斑点中物质的浓度与吸光度间关系的影响。该理论的基本方程式如下。（1）薄层色谱斑点的透射率：）薄层色谱斑点的透射率：（2）薄层色
34、谱斑点的反射率薄层色谱斑点的反射率(R)K为单位薄层厚度的吸光系数。K虽称为“吸光系数”是因“单位厚度”而得名，它与分光光度法中物质的吸收系数不向，与薄层色谱斑点中物质的浓度有关。KX称为吸收参数，相当于薄层色谱斑点单位相当于薄层色谱斑点单位面积中物质的含量面积中物质的含量(ugcm2)KX的含义：的含义：(3)(3)薄层色谱斑点的吸光度薄层色谱斑点的吸光度(A)A)理想的空白薄层板(简称空白板)的单位薄层厚度的吸光系数K0。事实上，一般空白板K0。为了消除此影响，通常在薄层扫描中都是以空白板为基准，测定相对透光率及相对反射率来计算薄层色谱斑点的吸光度。(a)在透射法中薄层色谱斑点的吸光度：在
35、透射法中薄层色谱斑点的吸光度：i及i0分别为透过斑点及空白板的透射光光强；I0为照射光光强；T与T0分别为斑点及空白板的透射率；反射法示意图(b)在反射法中薄层色谱斑点的吸收度A：1.2 KubelkaMunk曲线 曲线是以薄层固定相不吸收照射光，即空白板的K0为前提，按照空白板的散射参数，用KubeIkaMunk理论有关方程式算出斑点的AKX理论曲线。由于薄层固定相颗粒的散射作用，对于透射法及反射法造成偏离Beer定律的影响正好相反，故需按两种情况讨论。（1）透射法的）透射法的KubelkaMunk曲线曲线（2）反射法的KubelkaMunk曲线透射法和透射法和反射法的的KubelkaKub
36、elkaMunkMunk曲线比较：曲线比较：由于薄层固定相的散射作用使在透射法中所测得的斑点的吸光度产生正偏差正偏差，而在反射法测定时产生负偏差负偏差。这是因为照射光被散射，降低了透射率，吸光度增加；散射光增加了反射光光强，增加了反射率，而降低了吸光度的缘故。其次，还可发现后图比前图的横座标大50倍，说明了反射法的灵敏度灵敏度(响应值响应值)比透过法小。1.3 Kubelka-Munk曲线校直KubelkaMunk曲线说明了薄层色谱斑点的吸光度与其浓度间呈非线性关系，该曲线是薄层扫描法进行定量分析的理论依据。曲线处理采用两类方法：曲线处理采用两类方法：（1）曲线校直法（CS系列仪器）（2）采用
37、及计算机回归法(线性及非线性回归)。（CAMAG仪器）曲线校直法是根据薄层板的散射参数SX值，将KubelkaMunk曲线校正为直线，简化A与KX间的关系，以利于定量分析。用曲线校正法校直KubelkaMunk曲线，必须巳知薄层板的SX值，Merck预制氧化铝板的SX7，可参考上述数据试调，而后检查校正是否适宜，修正SX值再校，直至AKX曲线成直线为止。检查方法如下图所示。扫描条件：扫描方式扫描方式、波长及测光方式波长及测光方式等。扫描方式：直线式直线式及锯齿式扫描锯齿式扫描。扫描波长的选择：至关重要，不仅关系检测灵敏度，而且关系干扰的排除等。测光方式：透射式及反射式2.1 扫描方式选择扫描方
38、式选择(1)直线扫描直线扫描 直线式扫描是用一光带先照射在薄层板的一端，而后作直线运动至另端。在作直线式扫描时，实际上是光带固定，薄层板相对于光带作直线运动。2.薄层吸收扫描法的扫描方式及条件的选择薄层吸收扫描法的扫描方式及条件的选择 在作直线扫描时，光带的长度对扫描后所得的色诺峰峰面积影响很大，光带太长，检测灵敏度低，光带太短，光带只通过斑点的一部分，所得的蜂面积，不能真实反应斑点的吸收情况。因此，正常扫描时，应使光带长度略大于斑点直径。在多斑点扫描的，光带长度略大于最大斑点直径。为了降低定量误差，应使标准品斑点的直径与检品斑点的直径尽量接近。不规则斑点，用直线式扫描定量，即使光带长度适宜，
39、定量误差仍然较大，因为所得峰面积还与扫描方向有关。直线式扫描较适用于规则圆形薄层色谱斑点及条状薄层色谱斑点的定量分析。所能测定斑点的大小，以仪器的光带长度为上限。(2)锯齿式扫描锯齿式扫描 用截面积为正方形的光束照射薄层板，光束的运动轨迹为矩齿形。因此锯齿式扫描适用于直径小于30mm的斑点。锯齿式扫描特点：锯齿式扫描特点：在做锯齿形扫描时，由于光束来回通过斑点，吸光度积分值比直线式扫描大，重复性较好。锯齿扫描还适用于不规则斑点的定量。虽然扫描方向不同时，所得的色谱峰形状有差别，但积分值差别较小。可以同时做背景补偿，斑点吸收较强时，扫描时取扫描振幅以外的一点作为背景扣除。机械锯齿式描仪器扫描速度
40、慢是其缺点，飞点扫描型仪器(如CS9000型薄层扫描仪)则克服了此缺点。2.2 2.2 波长选择波长选择 波长选择适宜不仅可以提高灵教度，在双波长法还可排除干扰并可使基线平直，因而波长选择关系重大。(1)单波长薄层扫描法单波长薄层扫描法 用一种波长的单色光进行薄层扫描的方法称为单波长薄层扫描法，简称单波长法。用单波长法所得的薄层色诺扫描图是ARf或AL曲线。通常选max为测量波长，以增加检测灵敏度。单波长法较适用于分离度较好，无背景干扰的薄层色谱的扫描，否则基线波动较大。(2)双波长薄层扫描法双波长薄层扫描法 用两种波长的单色光交替照射薄层板，测定斑点对两种波长的单色光的吸光度之差称双波长薄层
41、扫描法，简称双波长法。所得的薄层色谱扫描图是ARf或AL曲线。双双波长波长法原理法原理 排除背景污染的干扰排除两个斑点间的相互干扰(3)双双波长波长法的优点法的优点a.可以排除分离度不佳的两个斑点间的相互干扰，能用于分离度不佳以至于完全重叠斑点的定量分析。b.可以排除背景污染的干扰，使基线平直。c.可以提高灵敏度。d.可以改变色谱峰的倒正。这些优点的实现，主要取决于波长对的选择。三、使用中应注意的问题v正确选择测量波长与参比波长v在正确的位置用正确的波长设置零点v设置正确的扫描范围v用程序扫描时精确测量斑点的间隔v保证足够的扫描长度TLC-SCAN TLC-SCAN 测定方法的选择测定方法的选
42、择1.外标法：若标准曲线经过原点，可用一点法校正，如不外标法：若标准曲线经过原点，可用一点法校正，如不通过原点，宜采用二点法校正，必要时用多点校正法。通过原点，宜采用二点法校正，必要时用多点校正法。测定时，供试品溶液和对照品溶液应交叉点于同一薄层测定时，供试品溶液和对照品溶液应交叉点于同一薄层板上，供试品点样不少于板上，供试品点样不少于4个，对照品每一浓度不少于个，对照品每一浓度不少于2个。个。2.内标法：内标法是将内标加入供试品溶液和对照品溶液内标法：内标法是将内标加入供试品溶液和对照品溶液中以其峰面积的比值作为定量依据。目前应用较少。中以其峰面积的比值作为定量依据。目前应用较少。注意事项注
43、意事项 影响因素较多，测定时应注意以下几点：影响因素较多，测定时应注意以下几点：1.薄层厚度应均匀，表面应平整，最好使用预制板；薄层厚度应均匀，表面应平整，最好使用预制板；2.点样应准确，原点大小应一致；点样应准确，原点大小应一致；3.喷洒显色剂应均匀，量适中；并用胶布加以固定。喷洒显色剂应均匀，量适中；并用胶布加以固定。TLC-SCAN TLC-SCAN 实验示例实验示例中国药典中脑得生丸中人参皂甙的含量测定中国药典中脑得生丸中人参皂甙的含量测定 精密称取供试品精密称取供试品2g，置索氏提取器中先用乙醚除去脂溶性杂质，再用置索氏提取器中先用乙醚除去脂溶性杂质，再用甲醇连续回流提取人参皂甙，挥
44、去甲醇，残渣加水溶解后，用正丁醇提甲醇连续回流提取人参皂甙，挥去甲醇，残渣加水溶解后，用正丁醇提取纯化，正丁醇减压回收后，残渣加甲醇溶解，作为供试品溶液；另取取纯化，正丁醇减压回收后，残渣加甲醇溶解，作为供试品溶液；另取人参皂甙人参皂甙Rg1对照品，加甲醇制成每对照品，加甲醇制成每ml含含0.5mg的溶液，作为对照液。的溶液，作为对照液。吸取供试品溶液吸取供试品溶液24l，对照品溶液对照品溶液2l和和4l分别交叉点于高效硅胶分别交叉点于高效硅胶G薄薄层板上，以氯仿层板上，以氯仿-醋酸乙酯醋酸乙酯-甲醇甲醇-水（水（15：40：22：10）510放置放置12小时的下层液为展开剂，展开，取出，晾干
45、。喷以小时的下层液为展开剂，展开，取出，晾干。喷以10%硫酸乙醇溶液，硫酸乙醇溶液，110加热至斑点颜色清晰，取出，在薄层板上盖同样大小的玻璃板，加热至斑点颜色清晰，取出，在薄层板上盖同样大小的玻璃板，用胶布固定，用胶布固定，照薄层扫描法测定，波长：照薄层扫描法测定，波长：S=525nm，R=700nm，测定供试品和对照品吸收度积分值，计算，即得。测定供试品和对照品吸收度积分值，计算，即得。v本法使用两点校正法，标准曲线可用计算器作线性回归处理，也可按下本法使用两点校正法，标准曲线可用计算器作线性回归处理，也可按下式计算，因式计算，因 m=a+Bav故故 b=（m1-m2）/（A1-A2），）
46、，a=m1-bA1吸附色谱法主要内容：吸附色谱法主要内容：v吸附薄层色谱法：原理，吸附剂、展开吸附薄层色谱法：原理，吸附剂、展开剂及其选择剂及其选择v比移值及其与比移值及其与K K和和k k的关系、相对比移值的关系、相对比移值v薄层色谱定性薄层色谱定性定量定量方法方法v薄层薄层扫描仪扫描仪：原理和实验条件：原理和实验条件五、应用实例（一）硅胶柱（一）硅胶柱 准确称取加正己烷索氏提取10h加样于硅胶柱上(硅胶12g，硅胶柱为由10 x250mm的玻璃柱，湿法装柱)。先用约50ml石油醚洗涤，再用石油醚乙醚甲酸(89：11：1)洗脱，收集分析化学.2002，30（8）：901高效液相色谱法测定银杏
47、外种皮中银杏酸的含量 （二）氧化铝柱（二）氧化铝柱十全大补丸中白芍的鉴别十全大补丸中白芍的鉴别 中华人民共和国药典中药薄层色谱彩色图集 提取液拌入少许中性氧化铝，水浴上拌匀干燥，装入一预先装好的中性氧化铝小柱（200300目，1g，内径1015mm）顶部，以甲醇40ml洗脱，收集（三）聚酰胺柱（三）聚酰胺柱聚酰胺柱的制备：聚酰胺柱的制备：取取1g1g聚酰胺，用聚酰胺，用60%60%乙醇适量浸泡乙醇适量浸泡1h1h，湿法上，湿法上柱，柱长柱，柱长30cm30cm，直径，直径0.5cm0.5cm。先用。先用20ml60%20ml60%乙醇冲乙醇冲洗，再用水洗，再用水30ml30ml冲洗备用。冲洗备
48、用。精密称定上聚酰胺柱，先用30ml水以10滴/min速度洗脱，再用60%乙醇20ml以8滴/min速度洗脱，收集中国现代应用药学杂志.1999，16（1）：58HPLC法测定鼻渊灵冲剂中黄芩苷含量（四）大孔树脂柱（四）大孔树脂柱1 1、大孔树脂：具孔穴结构的交联聚合物，、大孔树脂：具孔穴结构的交联聚合物，以苯乙烯、二乙烯苯为原料，在以苯乙烯、二乙烯苯为原料，在0.5%0.5%的明的明胶水混悬液中加入一定比例的致孔剂聚合而成胶水混悬液中加入一定比例的致孔剂聚合而成的高分子吸附剂的高分子吸附剂 白色球形颗粒，白色球形颗粒，20206060目目2 2、吸附原理：范德华力或氢键、吸附原理：范德华力或
49、氢键3 3、分类：非极性、中等极性、极性、分类：非极性、中等极性、极性 极性吸附极性物质，非极性吸附非极性物质极性吸附极性物质，非极性吸附非极性物质 非极性常用，如非极性常用，如D1014、预处理、预处理 95%乙醇浸泡乙醇浸泡24小时，湿法装柱，以小时，湿法装柱，以 95%乙醇冲洗至洗脱液加等体积水不浑浊乙醇冲洗至洗脱液加等体积水不浑浊 为止，改用水冲洗至洗脱液不含乙醇。为止，改用水冲洗至洗脱液不含乙醇。5 5、洗脱、洗脱 一般用甲醇或乙醇与水的不同配比一般用甲醇或乙醇与水的不同配比 对于非极性树脂，对于非极性树脂，洗脱剂极性越小，洗脱能力越强洗脱剂极性越小，洗脱能力越强 流速：流速：0.5
50、-5ml/min0.5-5ml/min高效液相色谱法测定五味沙棘散中栀子苷的含量高效液相色谱法测定五味沙棘散中栀子苷的含量吸附小柱的制备：吸附小柱的制备：取40-60目大孔树脂适量，乙醇浸泡24小时，湿法装入5ml酸式滴定管内，以95%乙醇冲洗至洗脱液加等体积水不浑浊为止，改用水冲洗至洗脱液不含乙醇，备用。中草药，中草药，20012001，3232（2 2）：）：218218供试品溶液的制备：供试品溶液的制备：取五味沙棘散约2.0g，精密称定，超声提取1h，提取液加入大孔树脂小柱，以足量水洗脱至无色，改用50%乙醇洗脱，收集50%乙醇洗脱液第二节第二节 分配色谱法分配色谱法 Partition