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1、选修三 专题三 胚胎工程 拓展视野 哺乳动物胚胎的性别鉴定与控制人教版 主讲人：夏 丰 单 位：永城市高级中学学习重点1.哺乳动物胚胎性别鉴定与控制的意义2.哺乳动物性控胚胎的生产原理3.哺乳动物性别鉴定与控制的方法杜泊种公羊杜泊种公羊荷兰黑白花奶牛荷兰黑白花奶牛撒能奶山羊撒能奶山羊1.1.哺乳动物胚胎性别鉴定和控制的研究意义哺乳动物胚胎性别鉴定和控制的研究意义及进展及进展胚胎性别鉴定技术是胚胎工程技术的重要的组成胚胎性别鉴定技术是胚胎工程技术的重要的组成部分。通过移植已知性别胚胎，可使家畜达到理部分。通过移植已知性别胚胎，可使家畜达到理想的性别比例，在畜牧业生产上具有重要的意义。想的性别比例
2、，在畜牧业生产上具有重要的意义。对于畜群品种的改良、濒危物种的保种等显得非对于畜群品种的改良、濒危物种的保种等显得非常重要。常重要。1919世纪末，世纪末，CuenotCuenot就确立了遗传物质决定性别的就确立了遗传物质决定性别的学说，真正行之有效的性别控制方法是在学说，真正行之有效的性别控制方法是在2020世纪世纪中期，直到目前，在生产中有实用价值的中期，直到目前，在生产中有实用价值的2 2种途径种途径是是受精前精子的分离受精前精子的分离（免疫学方法、流式细胞分（免疫学方法、流式细胞分类法类法 ）、）、受精后胚胎的性别鉴定受精后胚胎的性别鉴定（细胞学方法、（细胞学方法、免疫学方法、生物化学
3、方法）。免疫学方法、生物化学方法）。2 2、性控胚胎的生产原理、性控胚胎的生产原理 决定哺乳动物性别的基因是决定哺乳动物性别的基因是Y Y染色体上染色体上的一个核心区基因，即的一个核心区基因，即SRYSRY基因（基因（Sex-Sex-determining region of the Y determining region of the Y Chromosome Chromosome；Y Y染色体的性别决定区染色体的性别决定区 ）。2、性控胚胎的生产原理、性控胚胎的生产原理X XX XX XY Y雌性性染色体雌性性染色体雌性性染色体雌性性染色体雄性性染色体雄性性染色体雄性性染色体雄性性染色体
4、 SRY SRY 基因基因基因基因精子决定性别X XX XXXXXX XY YXYXY3 胚胎性别鉴定的方法胚胎性别鉴定的方法 受精前受精前受精前受精前 精子精子精子精子 的分离的分离的分离的分离 受精后胚胎的受精后胚胎的性别鉴定性别鉴定物理法物理法免疫法免疫法流式细胞分离法流式细胞分离法流式细胞分离法流式细胞分离法细胞遗传学方法细胞遗传学方法细胞遗传学方法细胞遗传学方法（核型分析法）（核型分析法）（核型分析法）（核型分析法）生物学的微量分析法生物学的微量分析法（X-X-X-X-相关相关相关相关酶法）酶法）酶法）酶法）免疫学方法免疫学方法免疫学方法免疫学方法分子生物学方法（分子生物学方法（PC
5、R PCR 法）法）3 受精后胚胎性别鉴定的方法受精后胚胎性别鉴定的方法 分子生物法分子生物法 （PCRPCR法）法）11）常规）常规PCRPCR22）巢式）巢式PCRPCR（Nest-Nest-PCRPCR）3 3）otstartPCRotstartPCR3 胚胎性别鉴定的方法胚胎性别鉴定的方法3.1.精子的分离精子的分离精子分离法物理法免疫法流式细胞分离法流式细胞分离法3.1.1、流式细胞分离法 流式细胞分离法流式细胞分离法 它它 根根 据据 X X、Y Y精精 子子DNADNA含含量量的的差差异异，借借助助特特异异性性染染色色剂剂染染色色，然然后后根根据据发发出出荧荧光光的的强强度度测测
6、定定DNADNA含含量量，来来分分离离X X、Y Y精子。精子。流式细胞分离示意图 3.1.1、流式细胞分离法3.2 受精后早期胚胎性别鉴定受精后早期胚胎性别鉴定哺乳动物早期胚胎性别鉴定哺乳动物早期胚胎性别鉴定PCRPCR反应方法的建立及反应方法的建立及优选优选 哺乳动物早期胚胎取样鉴定后体外发育潜能研究哺乳动物早期胚胎取样鉴定后体外发育潜能研究 哺乳动物早期胚胎鉴定后胚胎移植效果的研究哺乳动物早期胚胎鉴定后胚胎移植效果的研究 3.早期胚胎性别鉴定流程图早期胚胎性别鉴定流程图 取样取样取样取样PCR PCR 性别鉴定性别鉴定性别鉴定性别鉴定雄性雄性雄性雄性雌性雌性雌性雌性奶用胚胎奶用胚胎奶用胚
7、胎奶用胚胎肉用胚胎肉用胚胎肉用胚胎肉用胚胎移植移植移植移植移植移植移植移植移植前胚胎移植前胚胎移植前胚胎移植前胚胎鉴定后发育潜能的研究鉴定后发育潜能的研究鉴定后发育潜能的研究鉴定后发育潜能的研究早期胚胎性别鉴定早期胚胎性别鉴定早期胚胎性别鉴定早期胚胎性别鉴定分子生物学方法（分子生物学方法（PCR PCR 法）法）常规常规PCRPCR巢式巢式PCRPCR（Nest-PCRNest-PCR）otstartPCRotstartPCR思考讨论聚合酶链式反应法（PCR法）原理，原料，优点。思考讨论1 1聚合酶链式反应法（聚合酶链式反应法（PCRPCR法）原理法）原理 以以DNADNA双链复制的原理为依据
8、，在模板双链复制的原理为依据，在模板DNADNA、引物和、引物和4 4种脱氧核糖核苷酸存在的条件下依赖于种脱氧核糖核苷酸存在的条件下依赖于DNADNA聚合酶的促聚合酶的促合成作用，在体外合成合成作用，在体外合成DNADNA片段的方法。片段的方法。思考讨论聚合酶链式反应法（聚合酶链式反应法（PCRPCR法）优点法）优点简便：与常规热启动酶反应条件一致，无需改变简便：与常规热启动酶反应条件一致，无需改变 PCRPCR程序设置。程序设置。高效：有效减少了杂带及拖带产生，从而实现高高效：有效减少了杂带及拖带产生，从而实现高特异性的特异性的PCRPCR。灵敏：可从灵敏：可从0.05ng0.05ng人基因
9、组人基因组DNADNA模板中扩增出特定模板中扩增出特定基因片段。基因片段。思考讨论2.PCR法扩增目的基因的条件？原料（四种）酶(Taq酶）引物缓冲液模板4.受精后受精后胚胎性别鉴定的过程4.1.试验材料杜泊种公羊杜泊种公羊杜泊羊供体杜泊羊供体受体羊受体羊 杜泊种羊基地杜泊种羊基地试验仪器试验仪器显微操作仪显微操作仪 COCO2 2培养箱培养箱凝胶成像系统凝胶成像系统4.2.14.2.1胚胎的获取胚胎的获取子宫角冲胚子宫角冲胚胚胎的获取胚胎的获取4.2.4.2.试验方法试验方法4.2.2.4.2.2.胚胎质量鉴定胚胎质量鉴定胚胎等级胚胎形态特征A级形态典型，卵细胞和分裂球的轮廓清晰，细胞质致密
10、，色调和分布均一，变性部分在10%以内；B级与典型胚胎相比，稍有变形，但卵细胞和分裂球的轮廓清晰，细胞质较致密，分布均匀，变性细胞和水泡不超过10%-30%；C级 胚胎发育阶段与胚龄不太一致，轮廓不清晰，色调变暗，结构较松散，游离的细胞或液泡较多，变性细胞达30-50%；D级有碎片的卵、细胞无组织结构，变性细胞占胚胎大部分，约75%。表表表表2-52-5胚胎质量鉴定胚胎质量鉴定胚胎质量鉴定胚胎质量鉴定4.2.34.2.3胚胎的冷冻和解冻胚胎的冷冻和解冻 冷冻操作程序为：冷冻操作程序为：胚胎管胚胎管 程序冷冻仪程序冷冻仪 1/1/分的速度下降至分的速度下降至-6 -6 植冰植冰（0.3/0.3/
11、分）分）-35-35（10min10min）液氮保存液氮保存 解冻程序：解冻程序：解冻温度为解冻温度为35353838。解冻时将麦管从液氮中取出直接。解冻时将麦管从液氮中取出直接进入进入3535的水浴的水浴5S5S，去除防冻剂。，去除防冻剂。4.2.44.2.4PCRPCR引物的合成与设计引物的合成与设计基因Gene引物序列Primer sequences产物大小（bp）Size of PCR ProductSRYF1：5-AAAAGGCTTACAGATGCTG-3R1：5-CTGCTGTGATGCTCCTTT-3F2：5-AAGCGCCCATTCTTTGAG-3R2：5-TTGGCTTTCC
12、ATTTGTGAGT-3302219MyogeninF1：5-CGTGGGCGTGTAAGGTGT 3R1：5-CAGGCGCTCTATGTACTGGAT3F2：5-AGGAAGTCGGTGTCTGTGGA 3R2：5-ACTTTGGGCAGCCTCTGG 3197134表表2-6 绵羊绵羊SRY基因和基因和myogenin基因的引物序列基因的引物序列4.2.54.2.5 PCR PCR反应模板的制备反应模板的制备杜泊羊血液基因组杜泊羊血液基因组DNADNA的提取的提取 血液和组织的血液和组织的DNADNA提取试剂盒（提取试剂盒（DNeasy Tissue kit DNeasy Tissue
13、kit,QIAGEN,QIAGEN）提取）提取DNA DNA 胚胎细胞的显微取样及胚胎细胞的显微取样及DNADNA的提取的提取 胚胎细胞的显微取样胚胎细胞的显微取样 取样细胞取样细胞DNADNA的提取的提取吸取法反复冻融法4.2.64.2.6数据整理及分析数据整理及分析运用运用ExcelExcel对数据进行统计，再用对数据进行统计，再用SASSAS进行分析。进行分析。早期胚胎性别鉴定早期胚胎性别鉴定-扩增结果及分析示意图：扩增结果及分析示意图：1 2 3 4 5 1 2 3 4 5雄性特雄性特雄性特雄性特异性条带异性条带异性条带异性条带内内内内 标标标标早期胚胎性别鉴定早期胚胎性别鉴定-扩增结
14、果及分析示意图：扩增结果及分析示意图：1 2 3 4 5 1 2 3 4 51 1，4 4 雌性；雌性；雌性；雌性；2 2，3 3，5 5 雄性雄性雄性雄性雄性特雄性特雄性特雄性特异性条带异性条带异性条带异性条带内内内内 标标标标5.15.1杜泊羊早期胚胎性别杜泊羊早期胚胎性别PCRPCR方法的建立及优选方法的建立及优选5.1.1245.1.124个细胞提取个细胞提取DNAPCRDNAPCR扩增结果扩增结果Hot start PCRHot start PCR方法扩增条带方法扩增条带方法扩增条带方法扩增条带常规常规常规常规PCRPCR方法扩增条带方法扩增条带方法扩增条带方法扩增条带nest-PC
15、Rnest-PCR方法扩增条带方法扩增条带方法扩增条带方法扩增条带M12345678910M123456789101234M56789101234M56789101234M56789101234M56789105.结果5.1.2685.1.268个细胞提取个细胞提取DNAPCRDNAPCR扩增结果扩增结果常规常规常规常规PCRPCR方法扩增条带方法扩增条带方法扩增条带方法扩增条带nest-PCRnest-PCR方法扩增条带方法扩增条带方法扩增条带方法扩增条带Hot start PCRHot start PCR方法扩增条带方法扩增条带方法扩增条带方法扩增条带1234M56789101234M56
16、789101234M56789101234M56789101234M56789101234M56789105.1.35.1.3 9 9 1111个细胞提取个细胞提取DNA PCRDNA PCR扩增结果扩增结果 常规常规PCRPCR方法扩增条带方法扩增条带nest-PCRnest-PCR方法扩增条带方法扩增条带HotstartPCRHotstartPCR方法扩增条带方法扩增条带1234M56789101234M56789101234M56789101234M56789101234M56789101234M56789105.25.2杜泊羊取样鉴定后胚胎的体外发育潜能研究杜泊羊取样鉴定后胚胎的体外发
17、育潜能研究5.2.15.2.15.2.15.2.1鉴定鲜胚与未鉴定鲜胚体外发育潜能鉴定鲜胚与未鉴定鲜胚体外发育潜能鉴定鲜胚与未鉴定鲜胚体外发育潜能鉴定鲜胚与未鉴定鲜胚体外发育潜能 胚型 胚胎数 囊胚率（%）扩张囊胚率（%）孵化囊胚率（%）鉴定胚胎 19 47.4 a 36.8 a 31.6 a未鉴定胚胎 12 58.3 b 58.3 b 41.7 b表表表表-鉴定鲜胚与未鉴定鲜胚体外发育潜能比较鉴定鲜胚与未鉴定鲜胚体外发育潜能比较鉴定鲜胚与未鉴定鲜胚体外发育潜能比较鉴定鲜胚与未鉴定鲜胚体外发育潜能比较5.2.25.2.2鉴定冻胚和未鉴定冻胚体外培养的发育潜能的比较鉴定冻胚和未鉴定冻胚体外培养的
18、发育潜能的比较胚型 胚胎数 囊胚率（%）扩张囊胚率（%）孵化囊胚率（%）鉴定胚胎 16 37.5 a 37.5 a 31.25 a未鉴定胚胎 13 46.2 b 38.5 b 38.5 b表表表表3-2 3-2 鉴定冻胚和未鉴定冻胚体外培养的发育潜能的比较鉴定冻胚和未鉴定冻胚体外培养的发育潜能的比较鉴定冻胚和未鉴定冻胚体外培养的发育潜能的比较鉴定冻胚和未鉴定冻胚体外培养的发育潜能的比较5.2.35.2.3鉴定鲜胚冷冻和未鉴定冻胚体外培养的发育潜能的比较鉴定鲜胚冷冻和未鉴定冻胚体外培养的发育潜能的比较鉴定鲜胚冷冻和未鉴定冻胚体外培养的发育潜能的比较鉴定鲜胚冷冻和未鉴定冻胚体外培养的发育潜能的比较
19、胚型 胚胎数 囊胚率（%）扩张囊胚率（%）孵化囊胚率（%）鉴定冻胚胎 18 33.3 a 27.8 a 27.8 a未鉴定冻胚 10 50.0 b 40.0 b 40.0 b表表表表3-33-3鉴定鲜胚冷冻和未鉴定冻胚体外培养的发育潜能的比较鉴定鲜胚冷冻和未鉴定冻胚体外培养的发育潜能的比较鉴定鲜胚冷冻和未鉴定冻胚体外培养的发育潜能的比较鉴定鲜胚冷冻和未鉴定冻胚体外培养的发育潜能的比较5.2.45.2.4鉴定鉴定鉴定鉴定8-168-168-168-16细胞胚胎和鉴定桑椹胚的发育潜能细胞胚胎和鉴定桑椹胚的发育潜能细胞胚胎和鉴定桑椹胚的发育潜能细胞胚胎和鉴定桑椹胚的发育潜能 胚型 胚胎数 囊胚率（%
20、）扩张囊胚率（%）孵化囊胚率（%）8-16细胞鉴定胚胎 16 25.0 a 12.5 a 鉴定桑椹胚胎 12 41.7 b 25.0 b 16.7 b表表表表3-4 3-4 鉴定鉴定鉴定鉴定 8-168-16细胞胚胎和鉴定桑椹胚发育潜能比较细胞胚胎和鉴定桑椹胚发育潜能比较细胞胚胎和鉴定桑椹胚发育潜能比较细胞胚胎和鉴定桑椹胚发育潜能比较5.35.3杜泊羊取样鉴定后胚胎的体外发育潜能研究杜泊羊取样鉴定后胚胎的体外发育潜能研究解冻后胚胎解冻后胚胎早期囊胚早期囊胚扩张囊胚和孵化胚扩张囊胚和孵化胚5.45.4杜泊羊取样鉴定后胚胎的体外发育潜能研究杜泊羊取样鉴定后胚胎的体外发育潜能研究鉴定后培养鉴定后培养
21、鉴定后培养鉴定后培养24h24h24h24h囊胚囊胚囊胚囊胚培养培养培养培养48h48h48h48h孵化胚孵化胚孵化胚孵化胚5.5 5.5 杜泊羊鉴定后胚胎移植效果的研究杜泊羊鉴定后胚胎移植效果的研究5.5.15.5.1鉴定鲜胚和冻胚与未鉴定结果比较鉴定鲜胚和冻胚与未鉴定结果比较 移植只数 妊娠率（%）出生率（%）流产率（%）鉴定胚胎 16 43.8 a 43.8 a 未鉴定胚胎 10 70.0 b 60.0 b 14.3鉴定胚胎 16 37.5 a 31.2 a 12.5 未鉴定胚胎 10 50.0 b 50.0 b 合计 52 25 23鲜胚鲜胚冻胚冻胚表表表表3-7 3-7 鲜胚、冻胚移
22、植结果鲜胚、冻胚移植结果鲜胚、冻胚移植结果鲜胚、冻胚移植结果受体羊编号 胚胎性别（、）移植数（+，-）分娩羔羊数 羔羊性别 性别验证结果1 +一致2 +-3 +-4 +一致5 +-6 +一致7 +-8 +-9 +-10 +一致11 +-12 +一致13 +-14 +-15 +流产 、一致5.5.25.5.2鉴定冻胚胚胎移植结果鉴定冻胚胚胎移植结果鉴定冻胚胚胎移植结果鉴定冻胚胚胎移植结果 表表表表3-5 3-5 受体情况及冻胚胚胎移植结果受体情况及冻胚胚胎移植结果受体情况及冻胚胚胎移植结果受体情况及冻胚胚胎移植结果5.5.35.5.3鉴定鲜胚胚胚胎移植结果鉴定鲜胚胚胚胎移植结果鉴定鲜胚胚胚胎移植
23、结果鉴定鲜胚胚胚胎移植结果受体羊编号 胚胎性别（、）移植数（+，-）分娩羔羊数 羔羊性别 性别验证结果 1 +-2 +-3 +-4 +一致 5 +-6 +一致 7 +-8 +一致 9 +-10 +一致 11 +-12 +一致 13 +-14 +一致 15 +-16 +一致表表表表3-6 3-6 鲜胚胚胎移植结果鲜胚胚胎移植结果鲜胚胚胎移植结果鲜胚胚胎移植结果6.结果6.16.16.16.1胚胎的显微取样对胚胎发育能力的影响胚胎的显微取样对胚胎发育能力的影响胚胎的显微取样对胚胎发育能力的影响胚胎的显微取样对胚胎发育能力的影响 从结果中可以看出常规PCR方法和nest-PCR方法对于取样10时，对
24、胚胎造成的损伤较大，其移植妊娠率比取样个数 l0有明显下降。有人认为取样细胞数5时，鉴定效率会降低。因此，为了保证胚胎移植后的妊娠率，在完成性别鉴定条件下，取样细胞应越少越好，以减小对胚胎的损伤。6.结果6.26.26.26.2不同发育阶段的胚胎对胚胎发育潜能的影响不同发育阶段的胚胎对胚胎发育潜能的影响不同发育阶段的胚胎对胚胎发育潜能的影响不同发育阶段的胚胎对胚胎发育潜能的影响 试验中所得鉴定后可移植胚胎均为发育至第七天的质试验中所得鉴定后可移植胚胎均为发育至第七天的质量良好的致密桑椹胚和囊胚，但对经输卵管获得的量良好的致密桑椹胚和囊胚，但对经输卵管获得的816816细细胞的胚胎进行鉴定培养后
25、发现，胞的胚胎进行鉴定培养后发现，致密桑椹胚和囊胚阶段的致密桑椹胚和囊胚阶段的鉴定胚胎发育潜能比鉴定胚胎发育潜能比816816细胞的鉴定胚胎要好细胞的鉴定胚胎要好，由于羊胚，由于羊胚胎一般在致密桑椹胚和囊胚移植，实验结果证实胚胎性别胎一般在致密桑椹胚和囊胚移植，实验结果证实胚胎性别鉴定最好在此阶段进行鉴定。鉴定最好在此阶段进行鉴定。6.结果 6.36.36.36.3 胚胎冷冻对鉴定后胚胎发育能力的影响胚胎冷冻对鉴定后胚胎发育能力的影响胚胎冷冻对鉴定后胚胎发育能力的影响胚胎冷冻对鉴定后胚胎发育能力的影响 试验采用了程序化冷冻方法对未鉴定胚胎和鉴定胚胎试验采用了程序化冷冻方法对未鉴定胚胎和鉴定胚胎
26、进行冷冻，结果表明，进行冷冻，结果表明，鉴定冻胚的发育能力比鲜胚鉴定后鉴定冻胚的发育能力比鲜胚鉴定后冷冻胚胎的发育能力高冷冻胚胎的发育能力高。这可能与冷冻损伤和取样损伤有。这可能与冷冻损伤和取样损伤有直接的关系。直接的关系。通过对鲜胚和冻胚鉴定后胚胎进行移植发现，鉴定鲜胚的移植效果较好，冻胚的移植妊娠率为37.5%，比Herr等（1991）年对牛的27枚胚胎进行冷冻-解冻后移植妊娠率63%要低，与国内高建明等冻胚鉴定移植44.4%比较差异不显著。小结 1.胚胎性别鉴定与控制的意义2.胚胎性别鉴定与控制原理3.性别鉴定与控制的方法4.胚胎性别鉴定的过程小结7.1 7.1 Hot Hot start start PCRPCR方方法法以以6-86-8个个取取样样细细胞胞进进行行PCRPCR鉴鉴定定结结果果较较好好，鉴鉴定定灵灵敏敏度度和和准准确确性性较较高高，是是适适合合杜杜泊泊羊羊早早期胚胎性别鉴定的一种方法。期胚胎性别鉴定的一种方法。7.27.2鉴定和冷冻对胚胎会造成损伤，且影响胚胎的后续发鉴定和冷冻对胚胎会造成损伤，且影响胚胎的后续发育。育。7.37.3鉴定鲜胚的发育潜能优于鉴定冻胚。鉴定鲜胚的发育潜能优于鉴定冻胚。谢谢大家!