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1、第五章第五章分子生物学基本研究法（上）分子生物学基本研究法（上）DNADNA、RNARNA及蛋白质操作技术及蛋白质操作技术 现现代代分分子子生生物物学学的的快快速速发发展展，得得益益于于上上个个世世纪纪中中叶叶以以来来研研究究方方法法、特特别别是是基基因因操操作作和基因工程技术的进步。和基因工程技术的进步。基基因因操操作作主主要要包包括括DNA分分子子的的切切割割与与连连接接、杂杂交交、电电泳泳、细细胞胞转转化化、核核酸酸序序列列分分析析以以及及基基因因人人工工合合成成、表表达达、定定点点突突变变和和PCR扩增扩增等，是分子生物学研究的核心技术。等，是分子生物学研究的核心技术。基因工程基因工程
2、是指在体外将核酸分子插入病毒、质粒或是指在体外将核酸分子插入病毒、质粒或其它载体分子，构成遗传物质的新组合，使之进入其它载体分子，构成遗传物质的新组合，使之进入原先没有这类分子的寄主细胞内并进行持续稳定的原先没有这类分子的寄主细胞内并进行持续稳定的繁殖和表达。繁殖和表达。基因工程技术基因工程技术是核酸操作技术的一部分，只不过它是核酸操作技术的一部分，只不过它强调了外源核酸分子在另一种不同的寄主细胞中的强调了外源核酸分子在另一种不同的寄主细胞中的繁衍与性状表达。繁衍与性状表达。事实上，这种跨越物种屏障、把来自其它生物的基事实上，这种跨越物种屏障、把来自其它生物的基因置于新的寄主生物细胞之中的能力
3、，是基因工程因置于新的寄主生物细胞之中的能力，是基因工程技术区别于其它技术的根本特征。技术区别于其它技术的根本特征。重组重组DNADNA技术发展史上的重大事件（三大成就）：技术发展史上的重大事件（三大成就）：一一、在在2020世世纪纪4040年年代代确确定定了了遗遗传传信信息息的的携携带带者者（即即基基因因的的分分子子载载体体是是DNADNA而而不不是是蛋蛋白白质质，解解决决了了遗遗传传的的物物质质基基础问题）；础问题）；二、二、5050年代提出了年代提出了DNADNA分子的双螺旋结构模型和半保留分子的双螺旋结构模型和半保留复制机制复制机制,解决了基因的自我复制和世代交替问题；解决了基因的自我
4、复制和世代交替问题；三、三、50年代末至年代末至60年代，相继提出了年代，相继提出了“中心法则中心法则”和操和操纵子学说纵子学说,成功地破译了遗传密码，阐明了遗传信息的成功地破译了遗传密码，阐明了遗传信息的流动与表达机制。流动与表达机制。5.15.1 基因操作的基本工具基因操作的基本工具5.25.2DNADNA操作技操作技术5.35.3RNARNA基本操作技基本操作技术5.45.4SNPSNP的理的理论与与应用用5.55.5 基因克隆（基因克隆（cloneclone）技）技术5.65.6 蛋白蛋白质与蛋白与蛋白质组学技学技术（一）（一）限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶能能够够识识别别DNA上上
5、的的特特定定碱碱基基序序列列并并从从这这个个位位点点切切开开DNA分子。分子。第第一一个个核核酸酸内内切切酶酶EcoRI是是Boyer实实验验室室在在1972年年发发现现的的，它它能能特特异异性性识识别别GAATTC序序列列，将将双双链链DNA分分子子在在这这个个位位点点切切开开并并产产生生具具有有粘粘性性末末端端（不不是是整整齐齐地地切切开开，即即在在两两条条链上的切开位点不对称）的小片段。链上的切开位点不对称）的小片段。5.1 基因操作的基本工具基因操作的基本工具图图5-1 几种主要几种主要DNA内切酶所识别的序列及其酶切位点内切酶所识别的序列及其酶切位点（二）基因克隆的载体（二）基因克隆
6、的载体基因克隆基因克隆即重组即重组DNA技术技术,指在体外对指在体外对DNA分子按照分子按照既定的目的和方案既定的目的和方案,采用酶学方法将不同来源的采用酶学方法将不同来源的DNA分子在体外剪切和重新连接分子在体外剪切和重新连接,组装成一个新的组装成一个新的DNA分分子。在此基础上子。在此基础上,将这个将这个DNA分子导入到一定的宿主分子导入到一定的宿主细胞细胞,使它能够在宿主细胞中扩增使它能够在宿主细胞中扩增,形成大量的子代分形成大量的子代分子子,此过程即称为基因克隆此过程即称为基因克隆.基因克隆包括四个基本技基因克隆包括四个基本技术环节术环节:目的基因和载体的获得;目的基因与载体连接,形成
7、重组分子;重组DNA分子导入宿主细胞;含有重组DNA分子的细胞的筛选和扩增；基因克隆又称为DNA重组技术,DNA克隆或分子克隆。基因克隆载体的三要素：基因克隆载体的三要素：自我复制能力；自我复制能力；携带外源基因片段大小；携带外源基因片段大小；插入位点多少；插入位点多少；易于鉴定识别程度。易于鉴定识别程度。大肠杆菌质粒载体大肠杆菌质粒载体:1、pSC101质粒载体质粒载体低低拷拷贝贝数数严严紧紧型型复复制制控控制制的的大大肠肠杆杆菌菌质质粒粒载载体体，平平均均每每个个寄寄主主细细胞仅有胞仅有12个拷贝。个拷贝。长长9.09kb，带带有有四四环环素素抗抗性性基基因因（tetr）及及 EcoRI、
8、HindIII、BamHI、SalI、XhoI、PvuII以以及及SmaI等等7种种限限制制性性核核酸酸内内切切酶酶的的 单单 酶酶 切切 位位 点点，在在 HindIII、BamHI和和SalI等等3个个位位点点插插入入外外源源基因，会导致基因，会导致tetr失活。失活。大大肠肠杆杆菌菌pSC101质质粒粒载体示意图。载体示意图。是第一个真核基因克隆载体。是第一个真核基因克隆载体。缺缺点点：它它是是一一种种严严紧紧型型复复制制控控制制（在寄主细胞内的复制除了受本身的复制机构的控制外，还受染色体的严紧控制，因此拷贝数较少，一般只有12个/每染色体。）的的低低拷拷贝贝质质粒粒，从从带带有有该该质
9、质粒粒的的寄寄主主细细胞胞中中提取提取pSC101 DNA，产量很低。，产量很低。2、ColE1质粒载体质粒载体松弛型复制控制的多拷贝质粒。松弛型复制控制的多拷贝质粒。一一般般情情况况下下，当当培培养养基基中中氨氨基基酸酸被被耗耗尽尽，或或是是在在细细胞胞培培养养物物中中加加入入氯氯霉霉素素以以抑抑制制蛋蛋白白质质的的合合成成，寄寄主主染染色色体体DNA的的复复制制便便被被抑抑制制，细胞的生长也随之停止。细胞的生长也随之停止。而而松松弛弛型型质质粒粒DNA却却继继续续复复制制数数小小时时，使使每每个个 寄寄 主主 细细 胞胞 中中 ColE1质质 粒粒 的的 拷拷 贝贝 数数 达达 到到100
10、03000个，占细胞总个，占细胞总DNA的的50%左右。左右。3、穿梭质粒载体（、穿梭质粒载体（shuttle plasmid vector）指指由由人人工工构构建建的的具具有有两两种种不不同同复复制制起起点点和和选选择择记记号号，可可在在两两种种不不同同的的寄寄主主细细胞胞中中存存活活和和复复制制的的质质粒粒载载体体。由由于于这这类类质质粒粒载载体体可可以以保保证证外外源源DNA序序列列在在不不同同物物种种的的细细胞胞之之间间得得到到扩扩增增，能能在在原原核核和和真真核核细细胞胞之之间间往往返返穿穿梭梭，具有广泛的用途。具有广泛的用途。5.2.1 核酸的凝胶电泳核酸的凝胶电泳自自 从从 琼琼
11、 脂脂 糖糖（agarose）和和 聚聚 丙丙 烯烯 酰酰 胺胺（polyacrylamide）凝凝胶胶被被引引入入核核酸酸研研究究以以来来，按按分分子子量量大大小小分分离离DNA的的凝凝胶胶电电泳泳技技术术，已已经经发发展展成成为为一一种种分分析析鉴鉴定定重重组组DNA分分子子及及蛋蛋白白质质与核酸相互作用的重要实验手段。与核酸相互作用的重要实验手段。5.2 DNA操作技术操作技术一一种种分分子子被被放放置置到到电电场场中中，它它就就会会以以一一定定的的速速度度移移向向适适当当的的电电极极。我我们们把把这这种种电电泳泳分分子子在在电电场场作作用用下下的的迁迁移移速速度度，叫叫做做电电泳泳的的
12、迁迁移移率率，它它与与电电场场强强度度和和电电泳泳分分子子本本身身所所携携带带的的净净电电荷荷数数成成正正比比，与与片段大小成反比。片段大小成反比。生生理理条条件件下下，核核酸酸分分子子中中的的磷磷酸酸基基团团呈呈离离子子化化状状态态，所所以以，DNA和和RNA又又被被称称为为多多聚聚阴阴离离子子（polyanions），在在电电场场中中向向正正电电极极的的方向迁移。方向迁移。由由于于糖糖-磷磷酸酸骨骨架架在在结结构构上上的的重重复复性性质质，相相同同数数量量的的双双链链DNA几几乎乎具具有有等等量量的的净净电电荷荷，因因此它们能此它们能以同样的速度向正电极方向迁移以同样的速度向正电极方向迁移
13、。琼脂糖凝胶分辨琼脂糖凝胶分辨DNA片段的范围为片段的范围为0.250kb之间。之间。聚丙烯酰胺凝胶的分辨范围为聚丙烯酰胺凝胶的分辨范围为1到到1000个碱基个碱基对之间。对之间。凝胶浓度的高低影响凝胶介质孔隙的大小，浓凝胶浓度的高低影响凝胶介质孔隙的大小，浓度越高，孔隙越小，其分辨能力就越强。度越高，孔隙越小，其分辨能力就越强。琼脂糖及聚丙烯酰胺凝胶分辨琼脂糖及聚丙烯酰胺凝胶分辨DNA片段的能力片段的能力 凝胶类型及浓度凝胶类型及浓度 分离分离DNA的大小范围（的大小范围（bp）0.3%琼脂糖琼脂糖 50 0001 000 0.7%琼脂糖琼脂糖 20 0001 000 1.4%琼脂糖琼脂糖
14、6 000300 4.0%聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺 1 000100 10.0%聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺 50025 20.0%聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺 501溴溴化化乙乙锭锭染染料料的的化化学学结结构构及及其其对对DNADNA分分子子的的插插入入作作用用。由由于于插插入入了了溴溴化化乙乙锭锭分分子子，在在紫紫外外光光照照射射下下，琼琼脂脂糖糖凝凝胶胶电电泳泳中中DNADNA的的条条带带便便呈呈现现出出橘橘黄黄色色荧荧光光，易易于于鉴鉴定定。（溴溴化化乙乙锭锭是是高高度度灵灵敏敏的的荧荧光光染染色色剂剂，具具有有高高致致癌癌性性!普普通通浅浅黄黄色色乳乳胶胶手手套套不不能能很很好好的的阻阻挡挡，最最好好用
15、用蓝蓝色色实实验验用手套。）用手套。）DNA脉冲电场凝胶电泳（脉冲电场凝胶电泳（PFGE pulsed-field gel electrophoresis）示意图示意图 在脉冲电场中，DNA分子的迁移方向随着电场方向的周期性变化而不断改变。在标准的PFGE中，第一个脉冲的电场方向在另一侧成45夹角。由于琼脂糖凝胶的电场方向、电流大小及作用时间都在交替变化，使得DNA分子能够随时调整其游动方向，以适应凝胶孔隙的无规则变化。5.2.2 细菌转化与目标细菌转化与目标DNA分子的增殖分子的增殖通过细菌转化方法将体外构建好的杂种通过细菌转化方法将体外构建好的杂种DNA分分子导入宿主细胞中。外源子导入宿主
16、细胞中。外源DNA通过自身载体上通过自身载体上的复制起始点进行复制增殖，能在宿主细胞中的复制起始点进行复制增殖，能在宿主细胞中长期保存下来，并能以完整的形式从细胞中被长期保存下来，并能以完整的形式从细胞中被分离纯化出来。分离纯化出来。细菌转化细菌转化（transformation），是指一种细菌菌），是指一种细菌菌株由于捕获了来自供体菌株的株由于捕获了来自供体菌株的DNA而导致性状而导致性状特征发生遗传改变的过程。特征发生遗传改变的过程。提供转化提供转化DNA的菌的菌株叫作株叫作供体菌株供体菌株，接受转化，接受转化DNA的细菌菌株则的细菌菌株则被称为被称为受体菌株受体菌株。细菌转化及蓝白斑筛选
17、细菌转化及蓝白斑筛选 为提高效率，可对受体菌进行物理或化学处理，增加其获取为提高效率，可对受体菌进行物理或化学处理，增加其获取DNA的能的能力。经过这种处理的细胞被称作感受态细胞（力。经过这种处理的细胞被称作感受态细胞（competent cells）。）。蓝白斑筛选蓝白斑筛选原理图原理图两种增强转化的处理方法：两种增强转化的处理方法：CaCl2法法将将快快速速生生长长期期大大肠肠杆杆菌菌置置于于经经0预预处处理理的的低低渗渗CaCl2溶溶液液中中，细胞膨胀，膜通透性改变，易与外源细胞膨胀，膜通透性改变，易与外源DNA相粘附。相粘附。将将该该体体系系转转移移到到42下下做做短短暂暂的的热热刺刺
18、激激，外外源源DNA就就可可能能被被细细胞胞吸吸收收。将将经经过过转转化化后后的的细细胞胞置置于于选选择择性性培培养养基基上上，筛筛选选阳阳性克隆。性克隆。转转化化效效率率可可达达到到51062107个个转转化化子子/g超超螺螺旋旋质质粒粒DNA（转化后的受体菌称为转化子转化后的受体菌称为转化子transformant）。）。电击法电击法电脉冲电脉冲（电场强度、方向或电流的周期性变化）可（电场强度、方向或电流的周期性变化）可以在细胞膜上造成小凹陷，形成疏水孔洞。随着跨以在细胞膜上造成小凹陷，形成疏水孔洞。随着跨膜电压增加，大疏水性孔洞会转变为亲水性孔洞，膜电压增加，大疏水性孔洞会转变为亲水性孔
19、洞，介质中的介质中的DNA易于进入细胞质。易于进入细胞质。电电脉脉冲冲处处理理的的具具体体方方法法：将将生生长长至至对对数数中中期期的的E.coli菌菌液液冷冷却却至至4后后离离心心，洗洗菌菌后后用用10%的的甘甘油油悬悬浮浮，将将高高密密度度菌菌液液（21010/ml）置置于于特特制制的的电电极极杯中进行电击。杯中进行电击。获获得得最最大大转转化化效效率率时时场场强强一一般般为为12.515kV/cm，时间跨度一般为，时间跨度一般为4.55.5毫秒毫秒。电电击击转转化化与与温温度度有有关关，一一般般在在04进进行行。由由于于转转化化载载体体上上常常带带有有LacZ基基因因（大大肠肠杆杆菌菌乳
20、乳糖糖操操纵纵子子中中的的一一个个基基因因），多多用用带带有有不不同同抗抗生生素素（常常用用的的抗抗生生素素包包括括氨氨苄苄青青霉霉素素、卡卡那那霉霉素素和和四四环环素素等等）的的选选择择性性培培养养基基结结合合蓝蓝白白斑斑筛筛选选法法鉴鉴定定转转化化细胞。细胞。5.2.3聚合酶链式反应（聚合酶链式反应（PCR）技术）技术聚聚合合酶酶链链式式反反应应是是快快速速扩扩增增DNA序序列列最最常常用用的方法。的方法。PCR反反应应的的模模板板DNA若若是是基基因因组组上上的的某某个个片片段段，就就称称为为genomic PCR，若若是是mRNA反反转转录产生的录产生的cDNA，就称为，就称为RT-P
21、CR。PCR技术的原理：技术的原理：首首先先将将双双链链DNA分分子子在在临临近近沸沸点点的的温温度度下下加加热热分分离离成成两两条条单单链链DNA分分子子，DNA聚聚合合酶酶以以单单链链DNA为为模模板板并并利利用用反反应应混混合合物物中中的的四四种种脱脱氧氧核苷三磷酸合成新生的核苷三磷酸合成新生的DNA互补链。互补链。步骤（三步）：步骤（三步）：DNA解链（变性）解链（变性）引物与模板引物与模板DNA相结合（退火）相结合（退火）DNA合成（链的延伸）合成（链的延伸）经经不不断断重重复复循循环环之之后后，反反应应混混合合物物中中所所含含有有的的双双链链DNA分分子子数数（两两条条引引物物结结
22、合合位位点点之之间间的的DNA区区段段的的拷拷贝贝数数），理理论论上上的的最最高高值值应应是是2n,实实得得1.8n（n：循环次数）。：循环次数）。聚合酶链式反应（聚合酶链式反应（PCR）技术）技术 PCR指指数数扩扩增增时时循循环环次次数数与与DNA产物数量的比较产物数量的比较DNA解链（解链（PCR的第一步）：高温处理的第一步）：高温处理将将含含有有待待扩扩增增DNA样样品品的的反反应应混混合合物物放放置置在在高高温温（94）环环境境下下加加热热1分分钟钟，使使双双链链DNA变变性，形成单链模板性，形成单链模板DNA。94加热，淬火加热，淬火引物与模板引物与模板DNA相结合相结合（第二步）
23、：退火（第二步）：退火降降低低反反应应温温度度（退退火火，约约50），约约1分分钟钟，使使寡寡核核苷苷酸酸引引物物与与两两条条单单链链模模板板DNA结结合合在在靶靶DNA区段两端的互补序列位置上。区段两端的互补序列位置上。5060，退火，退火引物与模板引物与模板DNA相相结合结合DNA合成（第三步）：合成（第三步）：将将反反应应混混合合物物的的温温度度上上升升到到72左左右右保保温温1-数数分分钟钟，在在DNA聚聚合合酶酶的的作作用用下下，从从引引物物的的3-端端加加入入脱脱氧氧核核苷苷三三磷磷酸酸，并并沿沿着着模模板板分分子子按按53方方向向延延伸伸，合合成成新新生生DNA互补链。互补链。P
24、CR扩增，扩增，72左右左右,按按每每分钟分钟1000个碱基对设计个碱基对设计循环往复循环往复常规常规PCR技术能扩增两引物之间的技术能扩增两引物之间的DNA区段，然而，有时我们也希望扩增位于靶区段，然而，有时我们也希望扩增位于靶DNA区段之外的未知区段之外的未知DNA序列，这就需序列，这就需要应用要应用反向反向PCR（reverse PCR）技术）技术。先用一种在靶先用一种在靶DNA区段上没有识别位点区段上没有识别位点的核酸限制内切酶，从距靶的核酸限制内切酶，从距靶DNA区段有一定区段有一定距离的两侧位置切割距离的两侧位置切割DNA分子，然后将这些分子，然后将这些片段作片段作分子内连接分子内
25、连接成环形。根据已知的靶成环形。根据已知的靶DNA序列按序列按向外延伸向外延伸的要求设计一对向外引的要求设计一对向外引物，保证被扩增的是位于靶物，保证被扩增的是位于靶DNA区段两侧的区段两侧的未知未知DNA序列。序列。反反向向PCR的的基基本本操操作作程程序序。波波纹纹线线表表示示靶靶DNA区区段段，箭箭头头表表示示限限制制性性内内切切酶酶位位点点，分分 别别 用用 方方 框框 表表 示示 靶靶DNA区区段段的的左左侧侧和和右右侧序列。侧序列。用用一一种种在在靶靶序序列列上上没没有有酶酶切切位位点点的的核核酸酸限限制制性性内内切酶消化切酶消化DNA；产产生生大大小小不不同同的的线线性性DNA片
26、片段段群群体体，其其中中靶靶DNA区区段段的的DNA分分子子长长度度不不超超过过23kb，经经连连接接后后重重新新环化；环化；按按靶靶序序列列设设计计的的一一对对引引物物与与互互补补序序列列退退火火结结合合，其延伸方向如箭头所指；其延伸方向如箭头所指；经经PCR扩扩增增产产生生的的主主要要是是线线性性双双链链DNA分分子子，它它是是由由左左侧侧序序列列和和右右侧侧序序列列首首尾尾连连接接而而成成，其其接接点点是是所用限制性内切酶的识别位点。所用限制性内切酶的识别位点。5.2.4 实时定量实时定量PCR（real time quantitative PCR，Q-PCR）由由于于PCR敏敏感感性性
27、高高（在在几几个个小小时时内内将将特特异异的的一一段段DNA序序列列扩扩增增到到数数百百万万倍倍以以上上），扩扩增增产产物物总总量量变变异异系系数数大大，定定量量不不准准确确。90年年代代末末期期出出现现了了Q-PCR，利利用用荧荧光光检检测测PCR仪仪绘绘制制DNA扩扩增增过过程程中中的的累累积积速速率率动动态态变变化化图图，基基本本消消除除在在测测定定终终端端产产物物丰丰度度时时变异系数较大的问题。变异系数较大的问题。混混合合在在PCR反反应应液液中中的的荧荧光光探探针针只只有有与与大大片片段段DNA结合后，才能够被激发出荧光。结合后，才能够被激发出荧光。随随着着新新合合成成DNA片片段段
28、的的增增加加，由由于于结结合合到到DNA上上的的荧荧光光探探针针增增加加，被被激激发发产产生生的的荧荧光光相应增加。相应增加。非非序序列列特特异异性性荧荧光光染染料料SYBR Green I,激激发发光波长光波长520nm。SYBR Green I作作探探针针的的实实时时定定量量PCR实实验验过过程程示示意意图图（荧荧光光强强度度反反映映PCR产产物物的的量）量）Han P.,Li Q.,and Zhu Y.X.(2008)The Plant Cell 20:1482-1493.（野生型拟南芥）（野生型拟南芥）（野生型拟南芥的突变体）（野生型拟南芥的突变体）P169为为确确保保荧荧光光检检测测
29、的的确确实实是是靶靶DNA，又又设设计计了了仅能仅能与目的与目的DNA特异结合的荧光探针特异结合的荧光探针。TaqMan探探针针是是一一段段与与靶靶DNA序序列列中中间间部部位位结结合合的的单单链链DNA，长长50bp-150bp，该该DNA的的5和和3端端带带有有短短波波长长和和长长波波长长两两个个不不同同荧荧光光基基团团，由由于于彼彼此此距距离离靠靠近近，在在荧荧光光共共振振能能量量转转移移（FRET）作作用用下下发发生生荧荧光光淬淬灭灭，因因而检测不到荧光。而检测不到荧光。随随着着PCR反反应应的的进进行行，TaqMan 探探针针结结合合到到目目的的DNA序序列列上上，并并且且会会被被具
30、具有有外外切切酶酶活活性性的的Taq DNA聚聚合合酶酶逐逐个个切切除除而而降降解解。切切下下来来的的荧荧光光基基团团解解除除了了荧荧光光淬淬灭灭的的束束缚缚，会会在在激激发发光光下下发发出出荧荧光光，因因此此，产产生生的的荧荧光光强强度度直直接反映了所扩增靶接反映了所扩增靶DNA的总量。的总量。TaqMan探探针针实实时时定定量量PCR技术技术 TaqMan探针具有三个要素。（见P168）在此状态下两个荧光基团十分接近，不发荧光。Ct值值是是产产物物荧荧光光强强度度首首次次超超过过设设定定阈阈值值时时，PCR反反应应所所需需的的循循环环数数。利利用用标标准准曲曲线线，可可以以确定样品中待检测
31、靶确定样品中待检测靶DNA的绝对含量。的绝对含量。用实时定量用实时定量PCR法分析未知样品靶基因的绝对法分析未知样品靶基因的绝对表达量。（表达量。（P169）5.2.5 基因组基因组DNA文库构建文库构建把把某某种种生生物物的的基基因因组组DNA切切成成适适当当大大小小，分分别别与与载载体体组组合合，导导入入微微生生物物细细胞胞，形形成成克克隆隆。汇汇集集包包含含基基因因组组中中所所有有DNA序序列列的的克克隆隆（理理论论上上每每个个序序列列至至少少有有一一个个代代表表），这这样样的的克克隆片段的总汇，称为基因组隆片段的总汇，称为基因组DNA文库。文库。Clark和和Carbon于于1975年
32、提出公式：年提出公式：N=ln(1-p)/ln(1-f)式式中中：N表表示示一一个个基基因因组组文文库库所所应应该该包包含含的的重重组组克克隆隆数数目目；p表表示示所所期期望望的的靶靶基基因因在在文文库库中中出出现现的的概概率率；f表表示示重重组组克克隆隆平平均均插插入入片片段的长度与基因组段的长度与基因组DNA总长的比值。总长的比值。为为获获得得整整个个基基因因簇簇或或一一个个基基因因及及其其两两翼翼延延伸伸序序列列，基基因因组组文文库库中中的的DNA片片段段常常大大于于20kb。以以 人人 为为 例例，其其 基基 因因 组组 大大 小小 为为 3109bp若若p=99%，平平均均插插入入片
33、片段段大大小小为为20kb，则则N=6.9105。构构建建基基因因组组文文库库最最常常用用的的是是噬噬菌菌体体载载体体（克克隆隆能能力力约约1520kb）和和限限制制性性内内切切酶酶部部分分消消化化法法。例例如如用用识识别别4个个核核苷苷酸酸的的核核酸酸限限制制性性内内切切酶酶Sau3A，与与BamHI是是一一对对同同尾尾酶酶消消化化DNA，由由Sau3A酶酶切切产产生生的的DNA片片段段可可插插入入到到经经BamHI消化的消化的噬菌体载体上。噬菌体载体上。用用Sau3A限限制制性性核核酸酸内内切切酶酶消消化化真真核核生生物物基基因因组组DNA并并利利用用 噬噬菌菌体体载载体体构构建建基基因因
34、组组文文库库的的过程图示。过程图示。噬噬菌菌体体作作为为克克隆隆载体载体此此外外，还还有有很很多多大大容容量量克克隆隆载载体体，如如柯柯斯斯质质粒粒、细细菌菌人人工工染染色色体体（BAC）、P1源源人人工工染染色色体体（PAC）、酵酵母母人人工工染染色色体体（YAC）等等都都可可用用于基因组文库的构建。于基因组文库的构建。它它们们的的优优点点是是可可以以插插入入更更大大片片段段DNA，但但是是稳稳定定性性一一般般较较差差，在在大大量量复复制制的的过过程程中中容容易易出出现现缺失现象。操作也相对较困难。缺失现象。操作也相对较困难。5.3 RNA基本操作技术基本操作技术真真核核生生物物基基因因组组
35、DNA庞庞大大，有有大大量量重重复复序序列列，很很难难直直接接分分离离得得到到靶靶基基因因片片段段。而而cDNA来来自自反反转转录录的的mRNA，无无冗冗余余序序列列，通通过过筛筛选选cDNA文文库库，可可较较快快地地分分离离到到相相关关基因。基因。细细胞胞中中的的总总RNA包包括括mRNA，rRNA，tRNA以以及一些小及一些小RNA（sRNA）。）。一个典型的动物细胞约含一个典型的动物细胞约含10-5g RNA，其中：，其中：80%-85%为为rRNA15%-20%为为tRNA及及sRNAmRNA约占总约占总RNA 的的1%-5%rRNA分子具有确定的大小和核苷酸序列，特分子具有确定的大小
36、和核苷酸序列，特别是别是28S和和18S特征性条带是电泳鉴定总特征性条带是电泳鉴定总RNA纯度和完整性的重要参数。纯度和完整性的重要参数。Li Q et al.(2006)J.Integr.Plant Biol.48:114-120.图图5-14 PolyATtract mRNA的分离纯的分离纯化过程简图。化过程简图。RNA的的浓浓度度和和纯纯度度可可以以通通过过测测定定其其OD260和和OD280 来来 判判 断断。OD260为为 1时时 相相 当当 于于 浓浓 度度 为为40g/ml，而而OD260/OD280的的比比值值如如果果在在之之间间，表表示示所所提提取取的的RNA纯纯度度较较好好
37、，如如果果样样品品中中有有蛋蛋白白质质或或酚酚污污染染，则则OD260/OD280的的比比值值将将明明显显低于低于1.8。由由于于RNA分分子子敏敏感感脆脆弱弱，在在自自然然状状态态下下难难以以被被扩扩增增，为为了了研研究究mRNA所所包包含含的的功功能能基基因因信信息息，一一般般将将其其反反转转录录成成稳稳定定的的DNA双双螺螺旋旋（cDNA，complementary DNA），再再插插入入到到可可以以自自我复制的载体中。我复制的载体中。图图5-15 cDNA合合成过程示意图。成过程示意图。图图5-16 定向定向cDNA 合成及分子修饰合成及分子修饰因因为为绝绝大大多多数数大大肠肠杆杆菌菌
38、细细胞胞都都会会切切除除带带有有5-甲甲基基胞胞嘧嘧啶啶的的外外源源DNA，所所以以实实验验中中常常选选用用mcrA-mcrB-菌株以防止菌株以防止cDNA被降解。被降解。cDNA文库的构建文库的构建cDNA的长度一般在的长度一般在0.5-8 kb之间，质粒载之间，质粒载体和噬菌体类载体都能满足要求。体和噬菌体类载体都能满足要求。cDNA文库常用文库常用Uni-zap XR（一种（一种噬菌粒噬菌粒载体）做载体，它具备噬菌体的高效性和质载体）做载体，它具备噬菌体的高效性和质粒载体系统利用蓝白斑筛选的便利，可容纳粒载体系统利用蓝白斑筛选的便利，可容纳0-10 kb DNA插入片段，含有插入片段，含
39、有pBluescript载载体的全部序列。体的全部序列。重组后可通过体内剪切反应（重组后可通过体内剪切反应（In Vivo Excision）将）将cDNA插入片段转移到质粒系插入片段转移到质粒系统中进行筛选、克隆和序列分析。统中进行筛选、克隆和序列分析。基因文库的筛选基因文库的筛选基基因因文文库库的的筛筛选选是是指指通通过过某某种种特特殊殊方方法法从从基基因因文文库库中中鉴鉴定定出出含含有有所所需需重重组组DNA分分子子的的特特定定克克隆隆的的过过程程。筛筛选选的的方方法法有有很很多多种种，如如核核酸杂交法，酸杂交法，PCR筛选法和免疫筛选法等。筛选法和免疫筛选法等。1、核酸杂交法：、核酸杂
40、交法：核核酸酸杂杂交交法法以以其其广广泛泛的的适适用用性性和和快快速速性性成成为为基基因因文文库库筛筛选选中中最最常常用用的的一一种种方方法法，用用放放射射性性标标记记的的特特异异DNA探探针针适适用用于于高高密密度度的的菌菌落落杂杂交筛选。交筛选。将将待待筛筛选选菌菌落落转转移移到到硝硝酸酸纤纤维维素素膜膜上上，适适当温育。同时保留原来的菌落平板作对照。当温育。同时保留原来的菌落平板作对照。取取出出已已经经长长有有菌菌落落的的膜膜，用用碱碱液液处处理理，使使菌菌落落发发生生裂裂解解，DNA随随之之变变性性。用用蛋蛋白白酶酶K处处理理硝硝酸酸纤纤维维素素膜膜去去除除蛋蛋白白质质，形形成成菌菌落
41、落DNA的印迹。的印迹。80烘烘烤烤滤滤膜膜，将将DNA固固定定在在膜膜上上。将将滤滤膜膜与与放放射射性性标标记记的的DNA或或RNA探探针针杂杂交交，通通过过放放射射性性自自显显影影显显示示杂杂交交结结果果。通通过过对对应应于于平平板上的位置找到相应克隆。板上的位置找到相应克隆。图图 5-17 5-17 通过核酸杂交筛选目的克隆流程图通过核酸杂交筛选目的克隆流程图2、PCR筛选法筛选法将将整整个个文文库库（以以质质粒粒的的形形式式或或者者细细菌菌的的形形式式均均可可）保保存存在在多多孔孔培培养养板板上上，用用设设计计好好的的目目的的基基因因探探针针对对每每个个孔孔进进行行PCR筛筛选选，鉴鉴
42、定定出出阳阳性性的的孔孔，把把每每个个阳阳性性孔孔中中的的克克隆隆再再稀稀释释到到次次级级多多孔孔板板中中进进行行PCR筛筛选选。重重复复以以上上程程序序，直直到到鉴鉴定定出与目的基因对应的单个克隆为止。出与目的基因对应的单个克隆为止。3、免疫筛选法、免疫筛选法该该法法仅仅适适用用于于对对表表达达文文库库的的筛筛选选。若若实实验验中中靶靶基基因因的的序序列列完完全全未未知知但但是是有有针针对对该该基基因因产产物物的的特异性抗体，就可以采用免疫筛选法。特异性抗体，就可以采用免疫筛选法。图图5-18 噬噬菌菌体体表表达达文文库库的的免免疫疫化化学学筛筛选选法法示意示意图图 5.4 SNP的理论与应
43、用的理论与应用SNP是是Single Nucleotide Polymorphism的的缩缩写写，即即单单核核苷苷酸酸多多态态性性，指指基基因因组组DNA序序列列中中由由于于单单个个核核苷苷酸酸（A，T，C和和G）的的突突变变而引起的多态性。而引起的多态性。SNP所表现的多态性只涉及到单个碱基的变异，这种变异可所表现的多态性只涉及到单个碱基的变异，这种变异可由单个碱基的转换由单个碱基的转换(transition)或颠换或颠换(transversion)所引所引起，也可由碱基的插入或缺失所致。但通常所说的起，也可由碱基的插入或缺失所致。但通常所说的SNP并不并不包括后两种情况。包括后两种情况。5
44、.4.1 SNP概述概述科科学学上上把把染染色色体体DNA同同一一位位置置上上的的每每个个碱碱基基类类型型叫叫做做一一个个等等位位位位点点。SNP是是基基因因组组中中最最简简单单最最常常见见的的多多态态性性形形式式，具具有有很很高高的的遗遗传传稳稳定定性性。SNP检检测测和和分分析析技技术术已已经经成成为为继继限限制制性性片片段段长长度度多多态态性性（RFLP）和和微微卫卫星星标标记记（SSR）之之后的第三代遗传标记。后的第三代遗传标记。染色体上共同染色体上共同遗传的的SNPSNP组合合图中图中SNP1和和SNP2在同一条染色体上而且距离很近，在同一条染色体上而且距离很近，SNP1有等位位点有
45、等位位点A和和G，SNP2有等位位点有等位位点G和和T。因。因此，染色体对有两种可能的此，染色体对有两种可能的SNP组合。组合。单倍倍型型基因基因型型外外显子子IV内含子内含子IV57130165232236H1H-4TTATTH-3TTATTH-1TTATTE-2TTATTB-73TTATTH2MO17CTACCB-1CTACCH3H60CCTTT玉米玉米globulin1不同单倍型和基因型之间的多态性比较不同单倍型和基因型之间的多态性比较据据估估计计，人人类类DNA中中每每300-1000个个碱碱基基对对就就有有一一个个SNP，因因此此，一一个个人人类类个个体体大大约约携携带带300万万-
46、1000万万个个SNPs。位位于于染染色色体体上上某某一一区区域域的的一一组组相相关关联联的的SNP等等位位位位点点被被称称作作单单倍倍型型（haplotype），相相邻邻SNPs的的等等位位位位点点倾向于以一个整体遗传给后代。倾向于以一个整体遗传给后代。根据根据SNP在基因组中的分布位置分为编码区在基因组中的分布位置分为编码区SNP（cSNP），调控区），调控区SNP（pSNP）和非）和非编码区编码区SNP（rSNP）三类。）三类。编码区内的变异率仅占周围序列的编码区内的变异率仅占周围序列的1/5，cSNP的总量显著少于其它两类的总量显著少于其它两类SNPs。cSNP分为同义分为同义cSNP
47、（synonymous cSNP），编码序列的改变不影响所翻译的氨），编码序列的改变不影响所翻译的氨基酸序列）和非同义基酸序列）和非同义cSNP（non-synonymous cSNP），碱基序列的改变使氨），碱基序列的改变使氨基酸序列发生改变，可能影响蛋白质的功能。基酸序列发生改变，可能影响蛋白质的功能。5.4.2 SNP的检测技术的检测技术通过通过DNA测序法获得新的测序法获得新的SNP。基基因因分分型型（genotyping）是是指指利利用用数数据据库库中中已已有有的的SNP进进行行特特定定人人群群的的序序列列和和发发生生频频率率的的研研究究，主主要要包包括括基基因因芯芯片片技技术术、T
48、aqman技技术术、分分子子信信标标（molecular beacons）技技术术和焦磷酸测序法（和焦磷酸测序法（pyrosequencing）等。）等。1基因芯片技术基因芯片技术通过优化芯片杂交程序，使探针只与完全互通过优化芯片杂交程序，使探针只与完全互补的序列杂交而不与含有单个错配碱基的序补的序列杂交而不与含有单个错配碱基的序列杂交。列杂交。优点是高通量，一次可对多个优点是高通量，一次可对多个SNP进行规模进行规模性筛选，被检起始材料也很少，操作步骤简性筛选，被检起始材料也很少，操作步骤简单。单。缺点是芯片设计成本高。而且，由于缺点是芯片设计成本高。而且，由于DNA样样品的复杂性，有些品的
49、复杂性，有些SNP不能被检测。不能被检测。2Taqman技术技术PCR反反应应系系统统中中加加入入2种种不不同同荧荧光光标标记记的的分分别别与与两两个个等等位位基基因因配配对对的的探探针针。随随着着PCR的的进进行行，与与模模板板完完全全配配对对的的探探针针逐逐步步被被Taq DNA聚聚合合酶酶的的53外外切切活活性性所所切切割割，荧荧光光基基团团与与3端端的的淬淬灭灭基基团团分分离离，荧荧光光基基团团被被激激活活。不不完完全全配配对对的的探探针针（代代表表另另一一种种等等位位基基因因）不不能能被被有有效效切切割，供体荧光基团依然被淬灭。割，供体荧光基团依然被淬灭。3分子信标（分子信标（mol
50、ecular beacon）技术）技术是是一一种种呈呈茎茎环环结结构构的的荧荧光光标标记记的的寡寡核核苷苷酸酸，环环状状区区与与靶靶序序列列特特异异性性结结合合，茎茎干干区区由由5-8个个碱碱基基对对组组成成，5端端带带有有荧荧光光发发生生基基团团，3端端带带有有荧荧光光淬淬灭灭基基团团。自自由由状状态态时时，分分子子信信标标呈呈发发卡卡式式结结构构，荧荧光光几几乎乎完完全全淬淬灭灭。与与靶靶分分子子相相结结合合时时，荧荧光光基基团团和和淬淬灭灭基基团团之之间间的的距距离离增大，分子信标的荧光恢复。增大，分子信标的荧光恢复。Taqman技技术（上）及（上）及分子信分子信标技技术（下）原（下）原