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1、第八章动物基因组学基础第八章动物基因组学基础1 1 基因组学概述基因组学概述2 2 基因组图谱的构建基因组图谱的构建3 3 基因组测序基因组测序4 4 基因定位方法基因定位方法5 5 功能基因组学功能基因组学第一节第一节 基因组学基因组学(genomics)(genomics)概述概述基因组（基因组（genomegenome）又称染色体组，又称染色体组，二倍体二倍体物种配子所含的染色体数目物种配子所含的染色体数目，物种全部遗，物种全部遗传信息的总和传信息的总和物种遗传信息的物种遗传信息的“总词典总词典”控制发育的控制发育的“总程序总程序”生物进化历史的生物进化历史的“总档案总档案”v基因组学基
2、因组学19861986年提出年提出基因组学强调的是基因组学强调的是以基因组为单位以基因组为单位，而不是，而不是以单个基因为单位作为研究对象以单个基因为单位作为研究对象v基因组学的重要组成部分是基因组计划基因组学的重要组成部分是基因组计划，如如人类、水稻基因组计划人类、水稻基因组计划人类基因组计划人类基因组计划19901990，美国国立卫生研究所和能源部投资，美国国立卫生研究所和能源部投资3030亿，启动了亿，启动了被誉为被誉为“人体阿波罗计划人体阿波罗计划”的的“人人类基因组计划类基因组计划”(”(human genome projecthuman genome project，HGP)HGP
3、)，预计，预计1515年时间完成人类基因组全部序列的测年时间完成人类基因组全部序列的测定定在美国提出人类基因组计划后，英、法、日、在美国提出人类基因组计划后，英、法、日、前苏联、中等，也相继启动了类似的研究项目前苏联、中等，也相继启动了类似的研究项目20002000，完成草图，完成草图20022002，完成测序工作，完成测序工作基因组计划大体可分为基因组计划大体可分为：v构建基因组的遗传图谱构建基因组的遗传图谱v构建基因组的物理图谱构建基因组的物理图谱v测定基因组测定基因组DNADNA的全部序列的全部序列v构建基因组的转录本图谱构建基因组的转录本图谱v分析基因组的功能分析基因组的功能基因组学的
4、研究内容基因组学的研究内容q 结构基因组学结构基因组学（structural genomicsstructural genomics）基因定位、基因定位、基因组作图、基因组作图、测定核苷酸序列测定核苷酸序列q 功能基因组学功能基因组学（functional genomicsfunctional genomics），又称后基），又称后基因组学（因组学（postgenomicspostgenomics)基因的识别、鉴定、克隆基因的识别、鉴定、克隆基因结构、功能及其相互关系基因结构、功能及其相互关系基因表达调控的研究基因表达调控的研究q 蛋白质组学蛋白质组学（proteomicsproteomics
5、）鉴定蛋白质的产生过程、结构、功能和相互作用方式鉴定蛋白质的产生过程、结构、功能和相互作用方式第二节第二节 基因组图谱的构建基因组图谱的构建基因组计划的主要任务是获得全基因组序列基因组计划的主要任务是获得全基因组序列但是，现在的测序方法每次只能测但是，现在的测序方法每次只能测8008001000bp1000bp大量的测序片段要拼接大量的测序片段要拼接要知道序列在染色体上的位置才能正确拼接要知道序列在染色体上的位置才能正确拼接基因组计划的第一个环节：基因组计划的第一个环节：构建基因图谱构建基因图谱基因组图谱基因组图谱基因组图谱：描述基因位点在染色体的线性排列基因组图谱：描述基因位点在染色体的线性
6、排列顺序及它们之间的相对距离顺序及它们之间的相对距离遗传图谱（遗传图谱（genetic mapgenetic map）物理图谱（物理图谱（physical mapphysical map）一、一、遗传遗传图图谱谱遗传图谱遗传图谱（genetic mapgenetic map）：根据遗传性：根据遗传性状状（如已知基因位点、功能未知的（如已知基因位点、功能未知的DNADNA标记、标记、可鉴别的表型性状）可鉴别的表型性状）的分离比例的分离比例将其定位在将其定位在基因组中，构建相应的连锁图谱基因组中，构建相应的连锁图谱。通常以交换。通常以交换过程中的分离频率厘摩过程中的分离频率厘摩（cMcM）来表示）
7、来表示。cMcM值越值越大，两者之间距离越远大，两者之间距离越远（一）（一）遗传标记遗传标记 图谱构建中需要可以鉴别的标记图谱构建中需要可以鉴别的标记(marker)(marker)q遗传标记（遗传标记（Genetic MarkersGenetic Markers）：是指能够用）：是指能够用以区别生物个体或群体及其特定基因型，并能以区别生物个体或群体及其特定基因型，并能稳定遗传的物质标志稳定遗传的物质标志基因标记：基因标记：用基因作为标记，分析各基因间的用基因作为标记，分析各基因间的连锁关系及遗传距离，绘制出连锁遗传图谱连锁关系及遗传距离，绘制出连锁遗传图谱DNADNA标记：标记：RFLPRF
8、LP、SSLPSSLP、SNPsSNPs等等包括形态标记、细胞学标记、生化标记、包括形态标记、细胞学标记、生化标记、DNADNA分子标记分子标记形态标记形态标记形态性状：株高、颜色、白化症等形态性状：株高、颜色、白化症等又称表型标记又称表型标记数量少数量少很多突变是致死的很多突变是致死的受环境、生育期等因素的影响受环境、生育期等因素的影响q最早建立的果蝇连锁图，最早建立的果蝇连锁图，就是利用控制果蝇眼睛就是利用控制果蝇眼睛的形状、颜色，躯体的的形状、颜色，躯体的颜色、翅膀的形状等形颜色、翅膀的形状等形态性状作为标记，分析态性状作为标记，分析它们连锁关系及遗传距它们连锁关系及遗传距离，绘制而成的
9、离，绘制而成的q控制性状的其实是基因，控制性状的其实是基因，所以形态标记实质上就所以形态标记实质上就是基因标记是基因标记果蝇连锁图果蝇连锁图细胞学标记细胞学标记v明确显示遗传多态性的明确显示遗传多态性的染色体结构特征染色体结构特征和数量特征和数量特征 染色体的核型染色体的核型 染色体的带型染色体的带型 染色体的结构变异染色体的结构变异 染色体的数目变异染色体的数目变异v优点：不受环境影响优点：不受环境影响v缺点：数量少、费力、费时、对生物体缺点：数量少、费力、费时、对生物体的生长发育不利的生长发育不利生化标记生化标记v又称蛋白质标记又称蛋白质标记，就是利用蛋白质的，就是利用蛋白质的多态性作为遗
10、传标记多态性作为遗传标记 如：同工酶、等位酶如：同工酶、等位酶v优点：数量较多，受环境影响小优点：数量较多，受环境影响小v缺点：受发育时间的影响、有组织特缺点：受发育时间的影响、有组织特异性、只反映基因编码区的信息异性、只反映基因编码区的信息DNADNA分子标记分子标记简称分子标记，以简称分子标记，以DNADNA序列的多态性作为遗序列的多态性作为遗传标记传标记优点：优点：v 不受时间和环境的限制不受时间和环境的限制v 遍布整个基因组，数量无限遍布整个基因组，数量无限v 不影响性状表达不影响性状表达v 自然存在的变异丰富，多态性好自然存在的变异丰富，多态性好v 共显性，能鉴别纯合体和杂合体共显性
11、，能鉴别纯合体和杂合体理想的分子遗传标记应具备的特点理想的分子遗传标记应具备的特点vv遗传多态性高遗传多态性高vv检测手段简单快捷检测手段简单快捷vv易于实现自动化易于实现自动化vv遗传共显性遗传共显性1.1.限制性片段长度多态性限制性片段长度多态性-第一代第一代DNADNA遗传标记遗传标记（restriction fragment length polymorphismrestriction fragment length polymorphism，RFLPRFLP）vv最早的最早的最早的最早的DNADNADNADNA标记标记标记标记vv限制性酶切位点：被特定的内切酶所识别的限制性酶切位点：
12、被特定的内切酶所识别的限制性酶切位点：被特定的内切酶所识别的限制性酶切位点：被特定的内切酶所识别的4 4 4 4个个个个或更多个碱基组成的特异性序列或更多个碱基组成的特异性序列或更多个碱基组成的特异性序列或更多个碱基组成的特异性序列vDNADNA序序列列能能或或不不能能被被某某一一酶酶酶酶切切，相相当当于于一一对对等等位基因的差异位基因的差异v可将可将RFLPRFLP作为标记，定位在基因组中某一位置上作为标记，定位在基因组中某一位置上v人人类类基基因因组组中中有有10105 5个个RFLPRFLP位位点点，每每一一位位点点只只有有两两个等位基因个等位基因RFLP RFLP 分析过程分析过程RF
13、LP RFLP 分析结果分析结果RFLP RFLP 标记的特点标记的特点vv可靠可靠可靠可靠重现性好重现性好重现性好重现性好 vv目的序列已知时才能检测目的序列已知时才能检测目的序列已知时才能检测目的序列已知时才能检测vv操作复杂操作复杂操作复杂操作复杂自动化程度低自动化程度低自动化程度低自动化程度低vv耗时长耗时长耗时长耗时长至少需要至少需要至少需要至少需要2 2 2 2天，通常天，通常天，通常天，通常3-73-73-73-7天天天天vv多态信息含量低多态信息含量低多态信息含量低多态信息含量低PCR-RFLPPCR-RFLP PCR PCR 电电 泳泳 酶酶 切切 基因型基因型2.VNTR2
14、.VNTR v基因组中存在大量重复序列基因组中存在大量重复序列重重复复单单位位长长度度在在15-6515-65个个核核苷苷酸酸左左右右的的小小卫卫星星DNADNAvv在酶切片段里边核心序列重复次数不同导致在酶切片段里边核心序列重复次数不同导致在酶切片段里边核心序列重复次数不同导致在酶切片段里边核心序列重复次数不同导致酶切片段长度的差异酶切片段长度的差异酶切片段长度的差异酶切片段长度的差异vv又称为又称为又称为又称为DNADNADNADNA指纹指纹指纹指纹 vv与与与与 RFLP RFLP RFLP RFLP 分析方法类似，利用探针杂交检测分析方法类似，利用探针杂交检测分析方法类似，利用探针杂交
15、检测分析方法类似，利用探针杂交检测vv区别在于酶切位点不在可变重复区，而在侧区别在于酶切位点不在可变重复区，而在侧区别在于酶切位点不在可变重复区，而在侧区别在于酶切位点不在可变重复区，而在侧翼区翼区翼区翼区VNTR VNTR 分析过程分析过程VNTR VNTR 检测结果检测结果 VNTR VNTR 标记的特点标记的特点vv多态性检测率高多态性检测率高一个探针可以检测出一个探针可以检测出十几个甚至几十个位点的多态信息十几个甚至几十个位点的多态信息vv位点呈共显性遗传位点呈共显性遗传vv个体具有高度特异性个体具有高度特异性vv技术复杂，实验成本高技术复杂，实验成本高vv有时谱带过于复杂，难于分辨有
16、时谱带过于复杂，难于分辨VNTR VNTR 应用应用v计算遗传距离计算遗传距离v杂种优势预测杂种优势预测v亲子鉴定亲子鉴定-1/10000(99.99%likely)-1/10000(99.99%likely)v法医鉴定法医鉴定-1/10,000,000-1/10,000,0003.3.微卫星微卫星-第二代第二代DNADNA遗传标记遗传标记 （short tandem repeatshort tandem repeat,STRSTR）重重复复单单位位长长度度在在2-62-6个个核核苷苷酸酸之之间间的的微微卫卫星星DNADNA（microsatellitemicrosatellite DNADN
17、A），又又称称为为简简短短串串联联重重复复（SSRSSR、STRPSTRP或或SSLPSSLP，short short sequence sequence repeat repeat polymorphismpolymorphism或或者者simple simple sequence sequence length polymorphismlength polymorphism）vSTRSTR有有两两个个最最突突出出的的优优点点，即即作作为为遗遗传传标标记记的的“多态性多态性”与与“高频率高频率”v如一条染色体如一条染色体TCTTCTGAGAGAGAGAGAGAGACGCCGC 另一染色体另一
18、染色体TCTTCTGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGACGCCGC，就构成了多态性就构成了多态性STR STR 标记检测方法标记检测方法vv需要根据保守的侧翼序列需要根据保守的侧翼序列需要根据保守的侧翼序列需要根据保守的侧翼序列设计特异性扩增引物设计特异性扩增引物设计特异性扩增引物设计特异性扩增引物vvPCR PCR PCR PCR 反应扩增反应扩增反应扩增反应扩增 STR STR STR STR 区域区域区域区域vvPCRPCRPCRPCR产物用变性聚丙烯酰产物用变性聚丙烯酰产物用变性聚丙烯酰产物用变性聚丙烯酰胺胶分离胺胶分离胺胶分离胺胶分离vv不同的核心序列重复
19、数导不同的核心序列重复数导不同的核心序列重复数导不同的核心序列重复数导致不同长度的致不同长度的致不同长度的致不同长度的PCRPCRPCRPCR产物产物产物产物STR STR 标记特点标记特点 vv核心重复单位为核心重复单位为核心重复单位为核心重复单位为 2-6 2-6 2-6 2-6 个碱基个碱基个碱基个碱基vv在基因组中分布更加广泛均匀在基因组中分布更加广泛均匀在基因组中分布更加广泛均匀在基因组中分布更加广泛均匀vv多态信息含量丰富多态信息含量丰富多态信息含量丰富多态信息含量丰富vv呈共显性遗传呈共显性遗传呈共显性遗传呈共显性遗传vv稳定性好，分析技术易于自动化稳定性好，分析技术易于自动化稳
20、定性好，分析技术易于自动化稳定性好，分析技术易于自动化vv比比比比SouthernSouthern杂法更快捷杂法更快捷杂法更快捷杂法更快捷vvDNADNA用量少用量少用量少用量少 vv甚至部分降解的样品也可用于检测甚至部分降解的样品也可用于检测甚至部分降解的样品也可用于检测甚至部分降解的样品也可用于检测vv易受基因组污染的影响易受基因组污染的影响易受基因组污染的影响易受基因组污染的影响vv必须事先了解侧翼序列才能设计引物必须事先了解侧翼序列才能设计引物必须事先了解侧翼序列才能设计引物必须事先了解侧翼序列才能设计引物vv标记开发成本较高标记开发成本较高标记开发成本较高标记开发成本较高4.RAPD
21、4.RAPD-随机扩增多态性随机扩增多态性DNADNAvv应用应用应用应用10bp 10bp 10bp 10bp 的引物进行的引物进行的引物进行的引物进行PCRPCRPCRPCRvv每个反应只设单条引物每个反应只设单条引物每个反应只设单条引物每个反应只设单条引物vv短的引物随机结合在染色体上短的引物随机结合在染色体上短的引物随机结合在染色体上短的引物随机结合在染色体上vv当引物结合在双链当引物结合在双链当引物结合在双链当引物结合在双链1000bp1000bp1000bp1000bp左右左右左右左右的区域时，该片段被扩增的区域时，该片段被扩增的区域时，该片段被扩增的区域时，该片段被扩增RAPD
22、RAPD 检测结果检测结果 RAPD RAPD 标记特点标记特点vvPCRPCRPCRPCR反应产物通过电泳分离：不同样品间可能存在差异反应产物通过电泳分离：不同样品间可能存在差异反应产物通过电泳分离：不同样品间可能存在差异反应产物通过电泳分离：不同样品间可能存在差异vv主要用于分析群体间的遗传距离主要用于分析群体间的遗传距离主要用于分析群体间的遗传距离主要用于分析群体间的遗传距离vv引物短，不同生物基因组可以共用一套引物引物短，不同生物基因组可以共用一套引物引物短，不同生物基因组可以共用一套引物引物短，不同生物基因组可以共用一套引物vv实验快速简便，成本低，实验快速简便，成本低，实验快速简便
23、，成本低，实验快速简便，成本低，无需预先了解基因组无需预先了解基因组无需预先了解基因组无需预先了解基因组DNADNADNADNA序列序列序列序列vv退火温度低，实验退火温度低，实验退火温度低，实验退火温度低，实验重复性差重复性差重复性差重复性差，可比性不强，可比性不强，可比性不强，可比性不强vv标记呈标记呈标记呈标记呈显隐性遗传显隐性遗传显隐性遗传显隐性遗传，无法判定杂合子和显性纯合子，无法判定杂合子和显性纯合子，无法判定杂合子和显性纯合子，无法判定杂合子和显性纯合子 5.AFLP5.AFLPvv基于基于基于基于PCRPCRPCRPCR技术扩增基因组技术扩增基因组技术扩增基因组技术扩增基因组D
24、NADNADNADNA的限制性片段的限制性片段的限制性片段的限制性片段vv结合了结合了结合了结合了RFLPRFLPRFLPRFLP和和和和PCRPCRPCRPCR技术特点，技术特点，技术特点，技术特点，具有具有具有具有RFLPRFLPRFLPRFLP技术的可靠技术的可靠技术的可靠技术的可靠性和性和性和性和PCRPCRPCRPCR技术的高效性技术的高效性技术的高效性技术的高效性vv基因组基因组基因组基因组DNADNADNADNA先用限制性内切酶切割，然后将双链接先用限制性内切酶切割，然后将双链接先用限制性内切酶切割，然后将双链接先用限制性内切酶切割，然后将双链接头连接到头连接到头连接到头连接到D
25、NADNADNADNA片段的末端，接头序列和相邻的限制片段的末端，接头序列和相邻的限制片段的末端，接头序列和相邻的限制片段的末端，接头序列和相邻的限制性位点序列，作为引物结合位点，进行扩增性位点序列，作为引物结合位点，进行扩增性位点序列，作为引物结合位点，进行扩增性位点序列，作为引物结合位点，进行扩增vvAFLPAFLPAFLPAFLP可在一次单个反应中检测到大量的片段。所可在一次单个反应中检测到大量的片段。所可在一次单个反应中检测到大量的片段。所可在一次单个反应中检测到大量的片段。所以是一种新的而且有很大功能的以是一种新的而且有很大功能的以是一种新的而且有很大功能的以是一种新的而且有很大功能
26、的DNADNADNADNA指纹技术指纹技术指纹技术指纹技术 是指染色体上的某个位点存在单个碱基的变化是指染色体上的某个位点存在单个碱基的变化SNPSNP不再以不再以DNADNA片段的长度变化作为检测手段，直接片段的长度变化作为检测手段，直接以序列变异作为标记以序列变异作为标记。SNPSNP遗传标记分析完全屏弃了经典的凝胶电泳，代以遗传标记分析完全屏弃了经典的凝胶电泳，代以最新的最新的DNADNA芯片技术，是人类基因组芯片技术，是人类基因组“遗传图遗传图”发展发展方向方向6.6.单核苷酸的多态性单核苷酸的多态性-第三代第三代DNADNA遗传标记遗传标记 （single nucleotide po
27、lymorphismsingle nucleotide polymorphism，SNPSNP）SNPsSNPs 标记特点标记特点 高密度高密度1000bp1000bp左右出现左右出现1 1个个SNPSNP代表性代表性存在存在cSNPcSNP易于自动化易于自动化测序、基因芯片等方法测序、基因芯片等方法（二）遗传图谱的构建（二）遗传图谱的构建v 理论基础理论基础:连锁与交换连锁与交换v 基本方法基本方法:两点测验法和三点测验法两点测验法和三点测验法连锁分析连锁分析 进行连锁分析的三个要件进行连锁分析的三个要件 用于基因定位的用于基因定位的作图群体作图群体 广泛分布的广泛分布的多态性遗传标记多态性
28、遗传标记 适宜的定位分析方法和软件适宜的定位分析方法和软件1.1.参考家系参考家系v用于连锁分析的动物群体，也称为作图群体用于连锁分析的动物群体，也称为作图群体v可以是：回交群体、可以是：回交群体、F2F2群体、半同胞家系群体、半同胞家系 标记间的连锁分析标记间的连锁分析v利用在两个亲本间有多态性的标记分析利用在两个亲本间有多态性的标记分析分离群体中所有个体的基因型分离群体中所有个体的基因型v根据连锁交换的情况，确定标记之间的根据连锁交换的情况，确定标记之间的连锁关系和遗传距离连锁关系和遗传距离v有计算机软件可以应用有计算机软件可以应用人类遗传图谱的构建人类遗传图谱的构建v 不可能根据需要选择
29、亲本，设计杂交组合，不可能根据需要选择亲本，设计杂交组合，构建分离群体构建分离群体v 只能检测现存家庭连续几代成员的基因型只能检测现存家庭连续几代成员的基因型v 家系分析法家系分析法v 资料有限、必须借助于统计学方法资料有限、必须借助于统计学方法现有的人类遗传图谱现有的人类遗传图谱v 1 12222号染色体号染色体v 8 8个家系个家系134134个成员个成员v X X染色体，染色体，1212个家系个家系170170个成员个成员v 5364 5364个个SSRSSR标记标记v 2335 2335个位点个位点v 标记间的平均距离标记间的平均距离599kb599kb二、物理图谱二、物理图谱（phy
30、sical mapphysical map）v用分子生物学方法用分子生物学方法直接检测直接检测DNADNA标记在染色标记在染色体上的实际位置绘制成的图谱称为物理图谱体上的实际位置绘制成的图谱称为物理图谱v以碱基对以碱基对（bpbp，kbkb，MbMb）作为基本测量单位作为基本测量单位（图距）的基因组图（图距）的基因组图v 有遗传图谱为什么还要构建物理图谱？有遗传图谱为什么还要构建物理图谱？遗传图谱的缺陷遗传图谱的缺陷v分辨率有限分辨率有限人类只能研究少数减数分裂事件，不能获得大量子人类只能研究少数减数分裂事件，不能获得大量子代个体代个体测序要求每个标记的间隔小于测序要求每个标记的间隔小于100
31、kb100kb，实际是，实际是599kb599kbv精确性不够精确性不够经典遗传学认为，交换是随机发生的经典遗传学认为，交换是随机发生的基因组中有些区域是重组热点基因组中有些区域是重组热点倒位、重复等染色体结构变异会限制交换重组倒位、重复等染色体结构变异会限制交换重组物理作图的方法物理作图的方法v基因组物理图谱的构建主要有三种途径：基因组物理图谱的构建主要有三种途径：限制性酶图谱限制性酶图谱荧光原位杂交技术荧光原位杂交技术(FISH)(FISH)序列标签位点序列标签位点(STS)(STS)如表达的序列标签如表达的序列标签(EST)(EST)，来自，来自cDNAcDNA限制酶作图限制酶作图（re
32、striction mapping）p描述染色体上限制性内切酶切割描述染色体上限制性内切酶切割位点之间距离和顺序的图谱位点之间距离和顺序的图谱p识别位点较多的内切酶：如识别位点较多的内切酶：如NotNot，其，其8 8个核苷酸出现的频率为个核苷酸出现的频率为1/41/48 8=1/65536bp=1/65536bp，而识别位点为，而识别位点为6 6个个核苷酸的出现频率为核苷酸的出现频率为1/41/46 6=1/4094bp=1/4094bp2 2）荧光原位杂交）荧光原位杂交（Fluorescent in situ hybridization,Fluorescent in situ hybrid
33、ization,FISHFISH)v通过荧光标记的探针与通过荧光标记的探针与DNADNA分子杂交，杂交信号即探分子杂交，杂交信号即探针针DNADNA在染色体上的图谱位点在染色体上的图谱位点v步骤：取处于有丝分裂中期的细胞制片，将染色体步骤：取处于有丝分裂中期的细胞制片，将染色体变性成单链，再将标记的变性成单链，再将标记的DNADNA探针变性后杂交到染色探针变性后杂交到染色体上，保温处理后，显微镜下直接观察体上，保温处理后，显微镜下直接观察3 3）序列标签位点序列标签位点(sequenc-tagged sitesequenc-tagged site，STSSTS)vSTSSTS是一段短的是一段短
34、的DNADNA序列（序列（100500100500）bpbpv每个基因组只有一个拷贝每个基因组只有一个拷贝v通过通过PCRPCR或分子杂交将小段或分子杂交将小段DNADNA定位在基因组定位在基因组的的DNADNA区段中区段中STSSTS作图原理：作图原理：v当两个片段含有同一当两个片段含有同一STSSTS时，可确认这两个时，可确认这两个片段重叠片段重叠v两个不同的两个不同的STSSTS出现在出现在同一片段的机会取决于同一片段的机会取决于它们在基因组中的位置，它们在基因组中的位置，彼此接近，同时出现在彼此接近，同时出现在同一片段的机会就大，同一片段的机会就大，反之则小反之则小v两个标记间的图距根
35、据两个标记间的图距根据分离频率来计算分离频率来计算图图 用用STS标签技术制作基因组的物理图标签技术制作基因组的物理图常用的两大类型：常用的两大类型：v表达的序列标签（表达的序列标签（expressed sequence expressed sequence tag,EST),tag,EST),该序列来自该序列来自cDNA.DNAcDNA.DNA随机片段测随机片段测序后经比较分析，其非重复序列可作为序后经比较分析，其非重复序列可作为STS STS DNADNA片段片段v辐射杂交系：啮齿类动物细胞中含有另一个辐射杂交系：啮齿类动物细胞中含有另一个生物染色体片段的细胞株生物染色体片段的细胞株人类基
36、因组物理图人类基因组物理图v 1987 1987年，年，RFLPRFLP图谱，图谱，403403个标记，个标记，10Mb10Mbv 1994 1994年，年，58005800个标记，个标记，0.7Mb0.7Mbv 1996 1996年，年，1700017000多个标记，多个标记，100kb100kbv 完全适应全基因组测序的要求完全适应全基因组测序的要求遗传图与物理图的整合遗传图与物理图的整合v有些标记既是遗传标有些标记既是遗传标记，又是物理标记记，又是物理标记 RFLPRFLP标记标记 SSR SSR标记标记 某些基因序列某些基因序列v借助这些标记可以将借助这些标记可以将遗传图和物理图整合遗
37、传图和物理图整合起来起来酵酵母母遗遗传传图图与与物物理理图图比比较较A A 遗传图遗传图B B 物理图物理图三、转录图三、转录图v人类的基因转录图（人类的基因转录图（expression expression profilingprofiling）（）（cDNAcDNA图），或者基因的图），或者基因的cDNAcDNA片片段图，即表达序列标签图（段图，即表达序列标签图（ESTEST，expressed expressed sequence tagsequence tag）是人类基因组图的雏形）是人类基因组图的雏形v分离纯化分离纯化mRNAmRNA（或（或cDNAcDNA），就是抓住了基因），就是
38、抓住了基因组的主要成分（可转录部分）组的主要成分（可转录部分）v人类基因组中，只有人类基因组中，只有1%-5%1%-5%的序列编码了蛋白的序列编码了蛋白质，最多可能有质，最多可能有5-75-7万个蛋白质编码基因万个蛋白质编码基因四、人类基因组的序列图四、人类基因组的序列图v人类基因组的核苷酸序列图（人类基因组的核苷酸序列图（human genome human genome sequencesequence）是分子水平上最高层次的、最详）是分子水平上最高层次的、最详尽的物理图。由尽的物理图。由3030亿个核苷酸组成的全序列亿个核苷酸组成的全序列是人类基因组计划中最明确、最艰巨的任务是人类基因组
39、计划中最明确、最艰巨的任务五、基因组图谱的应用五、基因组图谱的应用v基因组序列测定基因组序列测定v基因定位基因定位 v基因组比较分析基因组比较分析v基因的克隆与分离基因的克隆与分离v分子标记辅助选择分子标记辅助选择标记辅助选择标记辅助选择（Marker-assisted Selection,Marker-assisted Selection,MASMAS）v对对特特定定的的主主效效基基因因（major major genegene）或或者者数数量量性性 状状 位位 点点（Quantitative Quantitative Trait Trait Loci,Loci,QTLQTL）在在遗遗传传标
40、标记记的的辅辅助助下下区区分分其其基基因因型型，并并在此基础上应用于家畜的育种实践在此基础上应用于家畜的育种实践第三节第三节 基因组测序基因组测序v有了高密度的基因组图谱，就可以开始全有了高密度的基因组图谱，就可以开始全基因组测序了基因组测序了v测序的技术飞速发展，现在可以全自动化测序的技术飞速发展，现在可以全自动化v测序的策略有两个：测序的策略有两个：鸟枪法鸟枪法 克隆重叠群法克隆重叠群法鸟枪法（鸟枪法（shotgun sequencing）鸟枪法的优缺点鸟枪法的优缺点v优点：优点：不需要高密度的图谱不需要高密度的图谱 速度快、简单、成本低速度快、简单、成本低v缺点：缺点：拼接组装困难，各个
41、片段重叠成一个连拼接组装困难，各个片段重叠成一个连续体的概率是续体的概率是2n2n2 2-2n-2n，尤其在重复序列多的区，尤其在重复序列多的区域，导致判断失误域，导致判断失误v主要用于重复序列少、相对简单的原核生物基主要用于重复序列少、相对简单的原核生物基因组因组克隆重叠群法（克隆重叠群法（clone contigclone contig）v 将基因组将基因组DNADNA切割长度为切割长度为0.1Mb0.1Mb1Mb1Mb的的大片段，克隆到大片段，克隆到YACYAC或或BACBAC载体上载体上v 然后再进行亚克隆，分别测定单个亚克然后再进行亚克隆，分别测定单个亚克隆的序列隆的序列v 再装配、
42、连接成连续的再装配、连接成连续的DNADNA分子分子v 这是一种自上而下（这是一种自上而下（up to downup to down）的测）的测序策略序策略 v clone-by-clone method clone-by-clone method第四节第四节 基因定位方法基因定位方法v质量性状的基因定位质量性状的基因定位v数量性状的基因定位数量性状的基因定位一、质量性状的基因定位一、质量性状的基因定位二点测交二点测交二点测交二点测交三点测交三点测交三点测交三点测交连锁不平衡分析连锁不平衡分析连锁不平衡分析连锁不平衡分析vv遗传定位遗传定位vv物理定位物理定位原位杂交原位杂交原位杂交原位杂交体
43、细胞杂交定位体细胞杂交定位体细胞杂交定位体细胞杂交定位二、数量性状的基因定位二、数量性状的基因定位vv数量性状基因座位数量性状基因座位数量性状基因座位数量性状基因座位（quantitative trait locus,quantitative trait locus,QTLQTL）：）：）：）：具有相同或相关功能的基因往往分布在某一染色体区具有相同或相关功能的基因往往分布在某一染色体区具有相同或相关功能的基因往往分布在某一染色体区具有相同或相关功能的基因往往分布在某一染色体区域内，从而形成基因群。域内，从而形成基因群。域内，从而形成基因群。域内，从而形成基因群。控制同一性状的微效基因可控制同一
44、性状的微效基因可控制同一性状的微效基因可控制同一性状的微效基因可能存在于有限的几个基因群内，而一基因群占据染色能存在于有限的几个基因群内，而一基因群占据染色能存在于有限的几个基因群内，而一基因群占据染色能存在于有限的几个基因群内，而一基因群占据染色体的一定区域，称作体的一定区域，称作体的一定区域，称作体的一定区域，称作QTLQTLQTL定位的概念定位的概念确定一个数量性状受到多少个确定一个数量性状受到多少个QTL作用的控制，作用的控制，确定它们在染色体上的位置，并估计出它们对数确定它们在染色体上的位置，并估计出它们对数量性状的效应大小及其互作效应，该过程称为量性状的效应大小及其互作效应，该过程
45、称为 QTL定位定位(QTL mapping)。QTLQTL作图原理作图原理 v利用特定遗传分离群体中的遗传标记及相应利用特定遗传分离群体中的遗传标记及相应的数量性状观察值，分析遗传标记与性状之的数量性状观察值，分析遗传标记与性状之间的连锁关系。如果证明遗传标记与性状连间的连锁关系。如果证明遗传标记与性状连锁，则可认定标记附近存在一个或几个锁，则可认定标记附近存在一个或几个QTLQTL 利用利用QTL与遗传标记之间的连锁关系，在一个大与遗传标记之间的连锁关系，在一个大群体中进行标记基因型和被测数量性状表型值记录，群体中进行标记基因型和被测数量性状表型值记录，通过统计方法进行连锁分析，确定连锁关
46、系。通过统计方法进行连锁分析，确定连锁关系。用于用于QTL定位的定位的遗传标记遗传标记是是DNA分子标记，目前分子标记，目前常用的有：常用的有：RFLP、RAPD、AFLP、SSR、SSCP以及以及DSCP等。等。QTL定位的策略定位的策略（1）选择适宜的遗传标记；）选择适宜的遗传标记；（2）选择在所研究数量性状上处于分离状态的纯系）选择在所研究数量性状上处于分离状态的纯系或高度近交系；或高度近交系；（3）进行系间杂交获得分离世代的）进行系间杂交获得分离世代的F2个体或者进行个体或者进行回交获得回交获得BC个体；个体；（4）检测各世代群个体的标记基因型并记录其数量）检测各世代群个体的标记基因型
47、并记录其数量性状表型值；性状表型值；（5）分析标记基因型与数量性状表型值之间是否存）分析标记基因型与数量性状表型值之间是否存在连锁关系，确定在连锁关系，确定QTL连锁群，估计连锁群，估计QTL效应。效应。QTL定位的基本步骤定位的基本步骤定位定位QTLQTL主要主要有两种有两种方法方法v基因组扫描基因组扫描利用遗传上差异较大的品种利用遗传上差异较大的品种进行杂交，跟踪性状和染色体上的标记在多进行杂交，跟踪性状和染色体上的标记在多世代家系中的分离情况世代家系中的分离情况v候选基因法候选基因法不需特定品种的杂交，只要不需特定品种的杂交，只要发现一个候选基因位点上存在多态性，便可发现一个候选基因位点
48、上存在多态性，便可直接在商业品系中研究该多态性与目标性状直接在商业品系中研究该多态性与目标性状之间的相关性之间的相关性数量性状基因定位分析方法数量性状基因定位分析方法v统计：回归分析、最大似然分析、广统计：回归分析、最大似然分析、广义最小二乘分析、贝叶斯方法义最小二乘分析、贝叶斯方法v软件：软件：MultiMapMultiMap MAPMAKER MAPMAKER新基因的克隆新基因的克隆vv主要克隆方法：主要克隆方法：主要克隆方法：主要克隆方法：位置克隆位置克隆（positional cloningpositional cloning）功能克隆（功能克隆（functional cloningf
49、unctional cloning）候选克隆（候选克隆（candidate approachcandidate approach）位置候选克隆（位置候选克隆（positional candidate positional candidate cloningcloning）位置克隆位置克隆gene功能克隆功能克隆vv蛋白质蛋白质RNAcDNARNAcDNAvv差异显示技术，克隆差异带差异显示技术，克隆差异带候选克隆候选克隆vv生理代谢途径生理代谢途径推测候选基因推测候选基因 结合性状表型结合性状表型性状与基因的相关性状与基因的相关vv问题：许多相关候选基因尚未克隆问题：许多相关候选基因尚未克隆Q
50、TL定位的意义定位的意义 可以利用分子遗传标记对数量性状基因型进行标记可以利用分子遗传标记对数量性状基因型进行标记辅助选择（辅助选择（MAS）来提高家畜育种的效率，特别是对）来提高家畜育种的效率，特别是对低遗传力性状和限性性状而言；低遗传力性状和限性性状而言；将转基因技术用于数量性状的遗传操作；将转基因技术用于数量性状的遗传操作；能够鉴别由多因素引起的遗传疾病，为基因治疗和能够鉴别由多因素引起的遗传疾病，为基因治疗和改进预防措施提供依据；改进预防措施提供依据；对这些对这些QTL基因的数目和特性有所了解后，可以使基因的数目和特性有所了解后，可以使数量遗传学理论建立在更加完善的基础上，对家畜育数量