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1、精选优质文档-倾情为你奉上编号：课题 ：蛋白质的提取和分离 课时： 主编人：王富娇审核人：赵长敏审批人：刘伟日期班组：姓名：组评：师评：学习目标：1.尝试从血液中提取和分离血红蛋白2.了解色谱法、电泳法等分离生物大分子的基本原理学习重、难点：1.凝胶色谱法的原理和方法2.样品的预处理；色谱柱填料的处理和色谱柱的装填第一学习时间 自 主 预 习 不看不讲& 基础知识梳理（系统形象化）知识回顾：血液由 和 组成，其中红细胞最多。红细胞具有 的特点。红细胞中有一种非常重要的蛋白质 ，其作用是 ，血红蛋白有 个肽链组成，包括 ，其中每条肽链环绕一个 ，磁基团可携带 。血红蛋白因含有 呈现红色。 思考1
2、：你认为鸟类血液和哺乳动物血液中，最好哪种血液来提取血红蛋白？为什么？ 思考2：与其它真核细胞相比，红细胞有什么特点？这一特点对你进行蛋白质的分离有什么意义？基础知识一、实验原理蛋白质的物化理性质：形状、大小、电荷性质和多少、溶解度、吸附性质、亲和力等千差万别，由此提取和分离各种蛋白质。2、 实验步骤可分为四大步：样品处理、粗分离、纯化和纯度鉴定。1样品处理 （1）红细胞的洗涤目的：去除 杂质蛋白 方法：低速短时间离心（速度越高和时间越长会使白细胞和淋巴细胞等一同沉淀达不到分离的效果），然后用胶头吸管吸出上层透明的 黄色血浆，将下层暗红色的的红细胞液体倒入烧杯再加入用 五倍的 体积质量分数为0
3、9的氯化钠溶液洗涤。低速离心（低速短时间）重复4、5步骤 三 次，直至上清液中已没有 黄色 ，表明洗涤干净。利于后续血红蛋白的分离纯化，不可洗涤次数过少。（2）血红蛋白的释放在蒸馏水和40%甲苯作用下，搅拌10min,红细胞破裂释放出血红蛋白。注：加入蒸馏水后红细胞液体积与原血液体积要相同。 加入甲苯的目的是溶解细胞膜，有利于血红蛋白的释放和分离。细胞结构不同，破碎的方法不同，常用有： 2. 粗分离分离血红蛋白溶液 将搅拌好的混合溶液离心后，试管中的溶液分为4层。第1层为无色透明的甲苯层，第2层为白色薄层固体，是脂溶性物质的沉淀层，第3层是红色透明液体，这是血红蛋白的水溶液，第4层是其他杂质沉
4、淀物(暗红色)。将试管中的液体用滤纸过滤，除去之溶性沉淀层，于分液漏斗中静置片刻后，分出下层的红色透明液体。透析 取1mL的血红蛋白溶液装入透析袋中，将透析袋放入盛有300mL的物质的量的浓度为20mmol/L的磷酸缓冲液中，透析12h。目的：可以去除样品中分子量较小的杂质，或用于更换样品的缓冲液。3 纯化（一般采用凝胶色谱法对血红蛋白进行分离和纯化）纯化主要是根据蛋白质之间以及 与其他物质之间在分子大小、 、 、 等方面纯在的差异进行的。常用的方法有： （其原理见名师P38）4. SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定判断 的蛋白质是否达到要求，需要进行蛋白质纯度的鉴定。SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定血
5、红蛋白纯度SDS电泳的成功关键之一是电泳过程中，蛋白质与SDS的结合程度。思考：是否所有种类的蛋白质的提取和分离都是这样的？为什么？ 第二学习时间 新 知 学 习 不议不讲& 重难点合作探究（技能系统化）一凝胶色谱法（原理）凝胶色谱法也称做 ，是根据 分离蛋白质的有效方法。凝胶实际上是一些由 构成的多孔球体，在小球体内部有许多贯穿的通道，相对分子质量不同的蛋白质分子通过凝胶时速度不同，相对分子质量较小的蛋白质 进入凝胶内部的通道，路程 ，移动速度 ；而相对分子质量 的蛋白质无法进入凝胶内部的通道，只能在 移动，路程 ，移动速度 。相对分子质量不同的蛋白质分子因此得以分离。具体过程：凝胶颗粒相对
6、分子质量较小的蛋白质相对分子质量较大的蛋白质（1）（2）（3）（4）（5）BA多孔板A 的蛋白质由于 作用进入凝胶颗粒内部而被滞留； 的蛋白质被排阻在凝胶颗粒外面，在了里之间迅速通过。B1） 混合物上柱；2）洗脱开始， 的蛋白质扩散进入凝胶颗粒内； 的蛋白质被排阻于凝胶颗粒之外；3） 的蛋白质被滞留； 的蛋白质被向下移动。4） 不同的蛋白质分子完全分开；5） 的蛋白质行程较短，已从 中洗脱出来， 的蛋白质还在行进中。2缓冲溶液缓冲溶液的作用是 。缓冲溶液通常由 溶解于水中配制而成的。生物体内进行的各种生物化学反应都是在一定的pH下进行的，例如：血浆的pH是 ，要在实验条件下准确模拟生物体内的过
7、程，必须保持体外的pH与体内的基本一致。思考：说出人体血液中缓冲对？ 思考：在血红蛋白整个实验室中用的缓冲液是什么？它的目的是什么？3凝胶色谱操作第一步要制作 ，第二步要 ，因为 ，所以装柱前需要根据色谱柱的内体积计算所需要的凝胶量。在装填凝胶柱时，不得有 存在。因为气泡会 ，降低分离效果。第三步是 。用凝胶色谱法分离蛋白质时，分子量大的蛋白质 （ ）A路程较长，移动速度较慢 B路程较长，移动速度较快C路程较短，移动速度较慢 D路程较短，移动速度较快二、电泳（1）概念：电泳是指 。（2）原理：许多重要的生物大分子，如 等都具有 。 在 下，这些基团会带上 。在电场的作用下，这些带电分子会向着与
8、其 移动。电泳利用了待分离样品中各种分子 以及分子本身 、 的不同使带电分子产生不同的 ，从而实现样品中各种分子的分离。两种常用的电泳方法是 和 ，在测定蛋白质分子量时通常使用 。蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率取决于 以及 等因素。（3）泳动特点：带电颗粒直径越小，越接近于球形，所带近电荷 ， 在电场中泳动速度就 ，反之，则慢。三、注意事项1. 电泳技术电泳技术就是在电场的作用下，利用待分离样品中各种分子带电性质以及分子本身大小、形状等性质的差异，使带电分子产生不同的迁移速度，从而达到对样品进行分离、鉴定或提纯的目的。2加入柠檬酸钠有何目的？为什么要低速、短时离心？为什么要缓慢搅拌？防止血液
9、凝固；防止白细胞沉淀；防止红细胞破裂释放出血红蛋白。3与其他真核细胞相比，红细胞的特点及这一特点对进行蛋白质的分离的意义？哺乳动物及人的成熟的红细胞是双面凹圆饼状，没有细胞核和细胞器。其含有的血红蛋白是有色蛋白，因此在凝胶色谱分离时可以通过观察颜色来判断什么时候应该收集脱液。这使血红蛋白的分离过程非常直观，大大简化了实验操作。4. 红细胞的洗涤如果分层不明显，可能是洗涤次数少、未能除去血浆蛋白的原因。此外，离心速度过高和时间过长，会使白细胞和淋巴细胞一同沉淀，也得不到纯净的红细胞，影响后续血红蛋白的提取纯度。5如何检测凝胶色谱柱的装填是否成功由于凝胶是一种半透明的介质，因此可以在凝胶柱旁放一支
10、与凝胶柱垂直的日光灯，检查凝胶是否装填得均匀。此外，还可以加入大分子的有色物质，观察色带移动的情况。如果色带均匀、狭窄、平整，说明凝胶色谱柱的性能良好。如果色谱柱出现纹路或是气泡，轻轻敲打柱体以消除气泡，消除不了时要重新装柱。6为什么凝胶的装填要紧密、均匀？如果凝胶装填得不够紧密、均匀，就会在色谱柱内形成无效的空隙，使本该进入凝胶内部的样品分子从这些空隙中通过，搅乱洗脱液的流动次序，影响分离的效果。7沸水浴处理加入洗脱液的湿凝胶的目的？不但节约时间，还能除去凝胶中可能带有的微生物和排除凝胶内的空气。8G-75的含义？“G”代表凝胶的交联程度，膨胀程度及分离范围，75表示凝胶得水值，即每克凝胶膨
11、胀时吸水7.5g。9装填完后，立即用洗脱液洗脱的目的：使凝胶装填紧密10如何检测血红蛋白的分离是否成功？如果凝胶色谱柱装填得很成功、分离操作也正确的话，能清楚地看到血红蛋白的红色区带均匀、狭窄、平整，随着洗脱液缓慢流出；如果红色区带歪曲、散乱、变宽，说明分离的效果不好，这与凝胶色谱柱的装填有关。11. 如何测定蛋白质的分子量？使用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质的分子量时，可选用一组已知分子量的标准蛋白同时进行电泳，根据已知分子量的标准蛋白的电泳区带位置，用电泳迁移率和分子量的对数作标准曲线，可以测定未知蛋白质的分子量。【课堂总结】血红蛋白的取和分离凝胶色谱法原理分离过程凝胶电泳法缓冲溶液组
12、成作用蛋白质的提取分离样品处理粗分离纯化纯度鉴定血红蛋白的提取和离蛋白质分子的差异性蛋白质分子的差异性凝胶色谱法原理分离过程凝胶电泳法凝胶色谱法原理分离过程凝胶电泳法缓冲溶液组成作用缓冲溶液组成作用蛋白质的提取分离样品处理粗分离纯化纯度鉴定蛋白质的提取分离样品处理粗分离纯化纯度鉴定第三学习时间 课 程 训 练 不练不讲! 自我检测（能力具体化，练习层次化）一、非选择题1、细胞含有大量的血红蛋白，红细胞的机能主要是由血红蛋白完成，血红蛋白的主要功能是携带氧气或二氧化碳，我们可以选用猪、牛、羊或其他脊椎动物的血液进行实验，来提取和分离血红蛋白，请回答下列有关问题： （1）血红蛋白提取和分离的程度可
13、分为四步：_、_、_和_。（2）实验前取新鲜的血液，要切记在采血容器中预先加入柠檬酸钠，取血回来，马上进行离心，收集血红蛋白溶液。 加入柠檬酸钠的目的是_。 以上所述的过程即是样品处理，它包括_、_、收集血红蛋白溶液。（3）收集的血红蛋白溶液在透析袋中可以经过透析，这就是样品的粗分离。 透析的目的是_。 透析的原理是_。（4）然后通过凝胶色谱法将样品进一步纯化，最后经SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳进行纯度鉴定。 样品纯化的目的是_。 血红蛋白有什么特点？_。这一特点对进行蛋白质的分离有什么意义？_。2、下面是凝胶色谱法分离血红蛋白时样品的加入(图I)和洗脱(图)示意图，请据图回答下列问题。(1)在加
14、样示意图中，正确的加样顺序是 。(2)用吸管加样时，应注意正确操作，分别是 。贴着管壁加样、 。(3)等样品 。时，才加入缓冲液 。待 接近色谱柱底端时，用试管收集流出液，每 mL收集一管，连续收集。3、凝胶色谱技术是一种快速而又简单的分离技术，由于设备简单、操作方便，不需要有机溶剂，对高分子物质有很高的分离效果，目前已经被生物化学、分子生物学、生物工程学、分子免疫学以及医学等有关领域广泛应用，不但应用于科学实验研究，而且，已经大规模地用于工业生产。据图回答问题：（1）a、b均为蛋白质分子，其中先从层析柱中洗脱出来的是 ，原因是 。（2）自己制作凝胶色谱柱时，在色谱柱底部d位置相当于多孔板的结
15、构可由 替代。（3）装填凝胶色谱柱时，色谱柱内不能有气泡存在，原因是 。（4）洗脱用的液体应尽量与浸泡凝胶所用的液体 (填“相同”或“不同”)，洗脱时，对洗脱液的流速要求是 。49早在上世纪六十年代，在美国的黄石国家森林公园发现了一种嗜热细菌，从这种细菌中分离提取了一种酶，称为TaqDNA聚合酶。实验得知PCR反应变性时温度为950C，经50个循环后TaqDNA聚合酶仍有65%的活性； TaqDNA聚合酶表现为Mg2+依赖，浓度在20mmol/L的MgCl2能最大限度地激活TaqDNA聚合酶的活性 ； （1）若要培养嗜热细菌，培养基中应有水、碳源、 、 等营养物质。在此基础上，培养该菌时需先将培养基 。（2）若将培养细菌的培养基用于植物组织培养，还应加入 。（3）TaqDNA聚合酶可用于PCR，原因是该酶有 ，因此在PCR扩增时可以 加入。（4）请将下列实验流程图补充完整：（5）凝胶色谱法和凝胶电泳法是分离蛋白质的两种常用方法，据此回答问题。凝胶色谱法分离蛋白质的原理是根据不同大小的蛋白质分子在凝胶柱中的 不同而实现分离的：使用电泳法分离蛋白质是利用了待分离样品中各种分子的 差异，以及分子本身的 、形状的不同。专心-专注-专业