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1、学科名称作物学河南省高等学校青年骨干教师考核报告项目名称： 玉米灌浆速率相关基因Zm/G厂功能验证与分子机理解析起止时间： 2017.01 至 2020.12培养对象姓名：李卫华专业技术职务：副教授ABCKO+/-ehdl+/-图5等位性测验果穗表型A： K0(+/-)与ehd 1(+/-)等位性测验杂交果穗的分离情况；B：等位性测验WT与突变体籽粒性状比较(Bar=0.5 cm) ； C：等位性测验WT与突变籽粒发芽率(Pl并且显著值30.05的条件，利用DEGseq软件鉴定了 4760个基因为差异表 达基因（DEGs）,其中包括对或突变体而言，差异基因中有2208个基因上 调表达及2551
2、个基因下调表达。通过利用实时荧光定量PCR来确定RNA-seq的结果。 GRMZM2Go88273、GRMZM2G346897、6口乂2乂26067929 和6112126418119表达水平 与RNA-seq数据一致，在ehdl突变体中的低于野生型（图12）。而突变体ehd1中 GRMZM2G156877和GRMZM2G420988的表达量高于野生型，表明/ RNA-seq数据真实 可靠。涮招联斐典图12 RT-PCR验证IMM来文奥GO分析结果表明，4760个DEGs主要富集于应激反应(GO:. P=1.2e12) integral to membrane (GO:, P=lc-5)、in
3、tracellular membrane-bounded organelle (GO:, P = 0.0002)、液 泡(GO:, P = 0.0007)、淀粉代谢过程(GO:,P= 1.6e 5)和糖类代谢过程(GO:,P= 1.2e12) 等生物学过程(图13)。WEGO outputCellular Component Molecular FunctionBiological Process10014291532s u 6oQ)qEnN图13 GO分析在这些DEGs中与生长素介导信号途径(GO:,P=1.2e25)和生长素刺激响应(GO:,P = 2.1/)有关的基因包括生长素响应因子、
4、AUX/IAA转录因子、生长素上调小RNA(SAUR)、 【引味乙醛氧化的、生长素运输蛋白和输出载体。对其中的4个DEGs基因(GRMZM2Go82943、 GRMZM2G365188、6112N156809195 和61化126019799)进行实时荧光定量分析，发 现它们在ehdl突变体和野生型中均有显著的表达差异(图14)。上述结果表明ZmEHDl可 能影响玉米中生长素平衡。!如梁玄轻!如梁玄轻图14 RT-PCR验证（部分基因）2.2成果特色及创新点候选基因对于玉米生长发育十分重要ehdl突变体在籽粒方面的缺陷主要表现在弱势灌浆造成的籽粒皱缩，进而导致百粒重 严重降低，同时Md/突变体
5、胚的发育滞后。在营养生长阶段也表现出多种缺陷表型，如发 芽率低、初生根长度和侧根数目都显著低于野生型。这种多效性缺陷表型的产生基本都是由 于调控生长发育关键基因发生改变造成的。对&法基因进行Real Time RT-PCR定量分 析，发现该基因在玉米各组织中均有表达，并无明显的组织特异性，说明该基因在玉米各个 组织部位对玉米的生长发育都十分重要，这与突变体在营养生长阶段和籽粒发育过程 中出现多种缺陷表型一致。成功对候选基因进行了图位克隆由于突变籽粒发芽率极低，因此采用的是七分离群体。用群体的构建相对较为容易，但 艮群体存在杂合基因型，对于显性标记，当代无法识别显性纯合基因和显性杂合基因，因此
6、需要自交一代确定表型。直接从籽粒的形态特征鉴定该突变体的表型，但是显性纯合体和显 性杂合体的表型无法利用籽粒特征进行判断，需要对其自交后代的籽粒再次种植并进行自 交确定表型，从而保证其表型鉴定的准确性。目前在MaizeGDB ()中，已经公布了 2000多 对SSR的公共引物信息，因此可以以B73序列为参考，筛选出存在多态性的分子标记，从 而实现目的基因的初步定位和前期的精细定位。SNP属于单个碱基的变异，后期当定位区间 较小而且没有合适的SSR标记时，可以通过对正常亲本和突变体进行测序，寻找二者之间 的SNP位点，并进一步开发基于SNP位点的分子标记。在进行分子标记检测时，由于所涉及 的实验
7、数据较多，难以避免地会出现错误，为了提高实验结果的准确性，应该果断去除没有 把握的数据或者进行重新验证。在本研究中，对所有不确定的数据都进行了多次重到检测， 直至得到完全确信的数据。在数据处理过程中，对每个分子标记的各种基因型的数目进行考 察，结果都符合典型的孟德尔遗传分离比。本研究通过图位克隆的方法，最终将候选基因定 位在6Kb的区间内，这个区间包含两个ORFo经过序列分析发现，WT和突变体 GRMZM2G052740在编码区有8个SNP差异，其中三个造成氨基酸的变异，而区间内 GRIZ12(；032720的序列无差异。因此，将GRUZM2Go52740做为候选基因进行研究。成功阐明候选基因
8、功能网络蛋白介导的内吞作用是一个高度动态的过程，在此过程中，细胞表面蛋白和质膜成 分被内化到细胞质中在CUE过程中，从网络蛋白的募集和货物蛋白的分拣到膜弯曲和囊 泡分裂需要60多个功能不同的适配器和辅助蛋白。在这些蛋白质中，AP2复合物是第一个 被表征的CCV (clathrin-coatcd vesicle)适配器。在拟南芥中，AP2。广泛表达，主要分 布在质膜上，AP2。功能的缺失明显抑制网络蛋白介导的内吞作用，即2。突变体在胚胎发 育、子叶器官发生、营养生长和长角果发育过程中均受到损伤。突变体内吞作用受损，营养生长和籽粒发育均出现缺陷的表型与拟南芥叩2。突 变体表型相似，因此我们猜测Zm
9、EHDl是否通过与ZmAP2。亚基互作参与网络蛋白介导的 内吞作用过程。已有研究表明，在玉米发育过程中AP2。亚基广泛表达于各种组织中“峋， 为两者之间可能存在的互作提供物理基础。首先将玉米AP2。亚基通过农杆菌侵染花絮的 方法转到拟南芥ap2a突变体植株中，发现能够回补拟南芥ap2o突变体植株的表型，该 结果表明玉米AP2。亚基与拟南芥AP2。亚基具有相似的功能。随后，用荧光双分子互补 实验在烟草表皮细胞和玉米原生质体中证实ZmEHDl与ZmAP2。亚基互作，且ZmEHDl与 ZmAP2。亚基的互作主要发生在质膜上，而ZmEHDl,.，与ZmAP2。亚基的互作不仅发生在质学 校： 河南农业大
10、学填表日期： 2020. 11.27河南省教育厅制一、基本情况研姓名李卫华性别 女民族汉出生日期1979.08所在单位河南农业大学行政职务专业职务副教授研究专长玉米遗传育种学历研究生学位博士电子信箱电话项目名称玉米灌浆速率相关基因Zm/G尸的功能验证与分子机理解析膜，而是分布在整个细胞中。DUAL膜蛋白酵母双杂和pulldown实验进一步证实两者之间的 互作。该结果表明ZmEHDl通过与ZmAP2。亚基互作参与网络蛋白介导的内吞作用过程。CME过程可以在活细胞中使用FM4-64来追踪，FM染料被广泛应用于真核细胞内吞、囊 泡转运和细胞器组织的研究。用FM4-64标记野生型和突变体的根10分钟之
11、后，每隔 30分钟检测FM4-64的吸收情况发现野生型在标记30分钟后就可观察到荧光斑点，而ehdl 突变体则在标记60分钟后才可观察到荧光斑点，在转基因敲除植株中同样出现FM4-64吸 收延迟的现象，表明EHD1的突变，使玉米内吞作用受损。已有报道，拟南芥中含有两个EHD 蛋白，AtEHDl和AtEHD2。这两种蛋白都包含有两个EF钙结合的EH结构域,一个P环,一 个预测的ATP/GTP结合位点，一个双边NLS和一个卷曲螺旋结构域(coiled-coil domain), 以及一个N端发动蛋白基序。AtEHD 2的过表达对细胞内吞有抑制作用，而AtEHDl的下调 则导致内源性物质进入植物细胞
12、的阻滞。过表达AtEHD2或下调AtEHDl的转基因植株没有 可检测到的发育表型，其与CME连锁的机制也未被研究。本研究克隆到的玉米EHD1经过序 列比对，发现具有典型的EHi)家族结构特征，但其在玉米中发挥功能的作用方式与拟南芥 EHD蛋白并不相同。初步阐明候选基因作用机制当前的转录组研究结果显示助力突变体和WT中ARFs、37弹朵-乙酸氧化酶、生长素转 运蛋白和运输载体等于生长素相关的基因均有不同水平的表达；用UPLC-MS/MS方法测定籽 粒生长素含量发现ehdl突变体中【AA浓度低于WT；并且ehdl突变体和转基因敲除植株重 力响应均比其对照野生型延缓；WT中DR5的信号主要集中在根冠
13、，而在助力突变体中，DR5 的信号明显减弱。PINla-YFP信号在WT中主要集中在中心柱，与之相比，在突变体中，PINla- YFP的信号更加扩散；同时，外源施加1-NAA可以补救Md/突变体表型。这些结果表明ehdl 突变体生长缺陷表型是由生长素体内平衡丧失引起的。2. 3主要学术价值和应用价值玉米是世界上重要的食量之一，种植范围广泛。深入研究玉米产量形成的遗传机制，促 使玉米产量持续提高是玉米遗传育种的重大课题。籽粒性状是影响玉米产量的重要因素之 一，由多个基因控制，受环境，基因与环境互作的影响。研究玉米籽粒发育相关基因，能促使人们深入了解玉米籽粒发育的调控机制。课题组前期研究在育种材料
14、中发现了一个自然突变体，其穗部明显发生饱满籽粒与皱 缩籽粒为3:1的分离，且皱缩籽粒百粒重明显下降，生长发育受到影响。经遗传分析确定该 性状由隐性单基因控制，通过图位克隆的方法进行定位获得候选基因。通过CRISPR/Cas9技 术构建敲除植株并进行等位验证，确认该基因为EHD1.随后通过定量分析、亚细胞定位、 FM4-64处理、BFA处理、荧光双分子互补实验、酵母双杂、pulldown.转录组分析等一系列 实验从细胞学、分子生物学、转录组学等多方面深入解析了 EHD1基因的作用机理。证明 ZmEHDl通过与ZmAP2。亚基互作，参与网络蛋白介导的内吞过程，通过调控生长素的体内 平衡，ZmEHD
15、l参与的CME对玉米籽粒发育和营养生长起着至关重要的作用。该研究结果有助于深入了解玉米籽粒发育的调控机制，并作为功能基因进行分子标记 辅助育种和优异单倍型筛选，为选育濯浆好产量高的玉米新品种提供基因资源和材料支撑。3、在教学水平、科研能力、团队建设、社会服务等方面的完成情况；3. 1教学水平项目执行期间，担任作物育种学、种子学、作物育种学研究进展等本科专 业核心课程的授课工作，在课堂上注重互动式教学，根据学科前沿随时更新课件和讲课内 容，教学效果良好。自2017年起担任河南农业大学作物育种学课程负责人，负责协调 教学团队建设、课程分配、考试考评等工作，保证了教学工作的正常进行。参编十三五规划
16、教材2部（作物育种学，中国农业大学出版社，2019；作物育种技术，中国农业出版社， 2020）,代表学校参加国家精品在线开放课程建设项目1项（作物育种学，华中农业大学, 2019）,主持校级在线开放课程建设项目1项（2019）,目前已经完成一轮网上教学工作， 并于2020年被评为河南农业大学线上教学优秀课程二等奖。4. 2科研能力项目执行期间，主持河南省自然科学基金面上项目1项，省重大科技专项子课题1项 和重点实验室开放课题1项，完成省科技攻关项目1项。作为第2名承担国家自然基金1 项，郑州市重大专项1项，完成国家自然基金项目1项。协助科研团队负责人完成国家自然 基因基金和省市级重大科技专项等
17、项目的申报和验收工作，指导研究生6名。发表SCI论 文4篇，一级学报5篇（标注资助1篇）；申报专利3项，选育新品种3个。获得河南省优 秀科技论文奖4项。5. 3团队建设项目执行期间，担任河南农业大学作物育种学课程负责人，协调新增教学团队成员 9名，将教学团队建设为涵盖6个作物的专业教学团队，实现了科研与教学的一体化，收到 良好的教学效果。作为农业部黄淮海南部玉米生物学与遗传育种重点实验室副主任，承担重 点实验室的年报编报、日常行政、仪器管理以及建设项目申报和验收等工作，积极参加2011 验收、重点实验室考核、一流学科创建等工作，发挥了应有的作用。6. 4社会服务积极参加社会服务工作。作为三区人
18、才项目承担者积极服务联系对象，并在进行玉米新 品种的选育和推广工作中开展技术培训、成果推广等工作，和企业开展产学研联合研究，收 到了良好的效果。4、不足之处及努力方向。主持人在团队建设、社会服务方面参加程度不够，今后将更加主动积极的进行教学、科 研团队的建设工作，更加深入的参加社会服务，实现科研基础工作和玉米生产的结合，为保 障我省玉米生产贡献出更大的力量。培养对象签字：2020年11月27日三、培养期成果一览1、承担主要教学科研项目及获奖、获得专利情况（请注明项目名称、项目来源、项目经费、项目起讫时间、所有项目完成人姓名以及项目完成人排 序等。如成果获得相应科技奖励，请注明授奖单位、奖励名称
19、、级别及日期；如成果获得专利，请 注明获准专利国别、类别及专利号）科研项目：I河南省自然科学基金面上项目，E3泛素连接酶编码基因调控玉米穗粗的遗传机制研究（）， 2020-2022, 10万元，主持，在研。2河南省重大科技专项子课题，广适多抗玉米优异种质创制与新品种选育（0-0101）, 2016-2019, 135万元，主持，己结题。I3j河南省科技厅技攻关重点项目，高产宜机收玉米新品种选育（2） , 2015-2017, 50万元，主持， 已结题。4省部共建小麦玉米作物作物学国家重点实验室自主课题：玉米穗长主效QTL的精细定位与克 隆，2017-2020, 21万元，主持，在研。5河南省中
20、原学者项目,玉米籽粒发育和灌浆过程的分子机理研究（4） , 2017-2019, 100万元, 第2名，已结题。16郑州市重大科技创新专项，适宜机械化收获玉米新品种选育（188PCXZX803） , 2018-2020, 100 万元，第2名，在研。7国家自然科学基金项目，玉米穗长主效基因qELIO的克隆与功能分析（），2019-2021, 23万 元，第2名，在研。获得奖励：I Genetic analysis of arsenic accumulation in maize using QTL mapping.河南省优秀科技论文奖一 等奖，2019,豫教(2019)01827, 1,201
21、9 年 5 月2 Quantitative Trait Loci for Mercury Accumulation in Maize (Zea maysL.) Identified Using a RIL Population.河南省优秀科技论文奖一等奖，2017,豫教(2017) 4184, 1, 2017年5月31 Biological responses and proteomic Changes in maize seedlings under nitrogen deficiency. *可南省 优秀科技论文奖二等奖，2019,豫教(2019) 02167, 1,2019年5月4 Id
22、entification and characterization of maize microRNAs involved in developing ears,河南省优秀科 技论文奖二等奖,2019,豫教(2019 ) 02170, 2,2019年5月5河南农业大学本科论文优秀指导教师，20186河南农业大学线上教学优秀课程二等奖，2020专利品种1 丁冬,张雪海，李卫华,段海洋，马拴红,王琪月，汤继华.一种玉米种胁迫抗性基因ZmAsR2及其分 子内 SNP 标记与应用P. CNA,2020-03-20.2薛亚东，汤继华，付志远，丁冬，李卫华.玉米C型细胞质雄性不育育性恢复基因Rf4位点紧密
23、连锁 分子标记及其应用P.河南：CNA, 2018-09-14.3薛亚东，汤继华，丁冬，付志远，李卫华.玉米C型细胞质雄性不育核恢复基因及其应用P.河南： CNA, 2018-08-21. 玉米新品种豫单188 （第五选育人）5玉米新品种豫单1866 （第八选育人）6玉米新品种豫单138 （第八选育人）2、代表性著作、论文(请注明著作或论文名称、出版单位或发表刊物名称、期号、出版或发表时间、所有著、作者姓 名以及作者排序等)Xia Shi, Xuchai Zhang, Da kun Shi 1 Xianggc Zhang, VVeihua Li*, JihuaTang*. Dissecting
24、 Heterosis During the Ear Inflorescence Development Stage in Maize via a Metabolomics-based Analysis. Scientific Reports, 2019, 9:2121 Zhan Zhao, Zhongjun Fu, Yanan Lin Hao Chen, Kun liu. Xiaolong Xing, Zonghua Liu, Weihua Li*, Jihua Tang*. Genome-wide association analysis identifies loci governing
25、mercury accumulation in maize. Scientific Reports , 2017,7 (1) :2473刘坤，张雪海,孙高阳，闫鹏帅,郭海平，陈思远,薛亚东，郭战勇,谢惠玲，汤继华,李卫华.玉米株型相 关性状的全基因组关联分析J.中国农业科学,2018,51(05):821-834. 郭海平，孙高阳，张晓祥,闫鹏帅，刘坤，谢惠玲,汤继华，丁冬，李卫华.基于SSSL群体的玉米穗下节间 长 QTL 分析见作物学报,2018,44(04):522-532.5刘晓阳，卫晓轶，陈浩，刘坤，谢惠玲,郭战勇，付志远,李卫华.玉米主要植株性状的杂种优势位点分 析团.中国农业科学
26、,2017,50(07):1179-1188.6 Liu N, Zhang Z, Xue Y, Meng S, Huang Y, Li W, Huang J, Tang J*. Identification of Quantitative Trait Loci and Candidate Genes fbr Maize Starch Granule Size through Association Mapping. Sci Rep, 2018, 8(1):142367j Zhao Z, Zhang H, Fu Z, Chen H, Lin Y, Yan P, Li VV, Xie H, Guo
27、 Z, Zhang X, Tang J* Genctic-bascd dissection of arsenic accumulation in maize using a genome-wide association analysis method. Plant Biotechnol J, 2018(5):1085-1093李慧敏，李卫华,郭海平，刘坤，张向歌，张晓祥,谢惠玲，汤继华,冬.玉米穗卜.节间长的杂种优势位 点解析J.中国农业科学,2017,50(06):978-989.9李建新，席蒙慧，张嘉玮,席蒙娟，田丁，鲁懿哲，陈晓阳,李卫华，张雪海,汤继华.中国玉米品种及其 亲本系谱数据
28、库的创建与利用几中国农业科学,2020,53(16):3404-3411.(标注资助)10高等农林教育十三五规划教材，作物育种学，中国农业大学出版社，2019.(编写第十章)11普通高等教育十三五规划教材，作物育种技术，中国农业出版社，2020。(第二主编)四、资助项目决算表项目金额3万元列出经费使用方向，包括购实实验仪器设备、耗材、图书资料、学术交流等费用。支出测试费1.99万元，知识产权出版费1.00万元，共支出经费2. 99万元。五、考核结论主要内容包括：项目完成情况，在教学水平、科研能力、团队建设、社会服务等方面完成培券计 划情况，今后发展意见建议和努力方向。考核等次意见。李卫华同志在
29、项目执行期间，带领课题组成功对籽粒灌浆突变体候选基因进行了图位克隆和 功能验证，并初步明确其作用机制，完成了项目研究目标。发表论文9篇（标注资助1篇），申 请专利3项，选育玉米新品种3个，参编十三五教材2部，参加国家精品开放课程建设1项，主 持校级在线开放课程1项，主持科研项目4项，培养研究生6名。建议今后在团队建设和社会服 务方面投入更多。考核专家组长:六、鉴定专家名单七、学校意见姓名职称学科专业领域单位签字校长签名：公 章年 月 日究项目一级学科作物学学科门类农学研究类别山、基础2、应用3、教学类资助金额3万元学校配套金额万元成果形式A.著作B.论文C.教材结项种类A.正常B.提前YC.延
30、期获奖情况获河南省优秀科技论文奖一等奖2项，二等奖2项。主 要 参 加 人姓名单位职称承担任务薛亚东河南农业大学讲师遗传转化郭战勇河南农业大学副教授组学分析陈晓阳河南农业大学讲师功能验证王雅菲河南农业大学博士生机制解析时夏河南农业大学博士生图位克隆二、总结报告主要内容：项目预期计划执行情况；成果内容、特色及创新点，主要学术价值和应用价- 值；在教学水平、科研能力、团队建设、社会服务等方面的完成情况；不足之处及努力方 向。1、项目预期计划执行情况1.1 预期研究目标：前期育种群体中发现一个玉米灌浆速率的自然突变体(Incompletd grain filling mutant, IGF),通过授
31、粉后不同时期正常籽粒和突变籽粒的表型观察、扫描电镜分析和灌浆速率分 析，发现该灌浆速率突变体的性状与灌浆速率密切相关；与浚9058构建的F2群体中正常 籽粒和灌浆速率籽粒呈现3:1的分离比例，确定该性状由隐性单基因控制；利用4.5万株的 F2群体，将候选基因精细定位在4号染色体4. lObin上5863bp的物理距离内。通过生物信 息学分析，目标区段内含有2个可能的基因；利用包含100个自交系的自然群体进行关联 分析，确定其中1号基因为候选基因，命名为Zm/GF,该基因5，UTR区域在关联群体和突 变体中存在一个特定的SNP变异。本研究拟在前期研究的基础上，通过ZmIGF的遗传转化 及转基因后
32、代分析，深入研究ZmIGF的功能和作用机理：借助酵母双杂交寻找基因产物的 互作蛋白，利用转录组分析解析玉米灌浆速率关键基因的遗传调控网络，通过关联分析探明 目标基因优异等位变异，并开发基因内的功能标记。预期将完成如下研究目标：1)阐明 ZmIGF的功能、作用方式、有利等位变异或单倍型及利用途径；2)解析ZmIGF在籽粒灌 浆过程中的代谢调控网络和作用机制。1.2 项目预期计划执行情况项目执行期间，课题组对于玉米籽粒灌浆突变体进行了克隆和功能解析，并初步阐明其 遗传机理和作用机制。通过对突变体分析其具有C-terminal Epsl5 homology domain,遂改称 为突变体刈，通过遗传
33、分析、图位克隆、转基因功能验证、细胞学、生理生化等分析阐明 了该突变体产生的遗传机制。取得进展如下：利用包含53000个单株的F3群体将玉米籽粒灌浆突变体候选基因精细定位于玉米第4 号染色体的一段6Kb的物理区间内，该区间有两个蛋白编码基因(GRMZM2G052740和 GRMZM2G052720) ,对两个基因进行序列分析，发现GRMZM2Go52740基因在编码区有 3个非同义SNP,利用CRISPR/Cas9构建GRMZM2Go52740基因敲除突变株表现出与ehdl 相似的生长表型；等位测验结果显示突变的GRMZM2G052740不能互补ehdl突变体表型， 证实GRMZM2G0527
34、40是ehdl突变体的候选基因。GRMZM2G052740编码一种含有EHD 结构域的蛋白，亚细胞定位显示ZmEHDl主要在细胞膜上表达，而ZmEHDIm1H在细胞膜和 其它部位中均表达。该基因为组成型表达，胚乳中表达量较高，且在突变体中的表达量显著 高于野生型。用FM4-64处理Md/突变体、野生型、ZmEHDl敲除载体的转基因阳性植株及其对照， 发现突变体与敲除植株的内吞作用延迟；用BFA处理结果表明ZmEHDl参与内吞过程中囊 泡的运输。BiFC、酵母双杂和Pull down实验证实ZmEHDl与ZmAP2o （Adaptor Protein Complex 2）亚基互作。转录组测序结果
35、表明，ZmEHDl基因突变影响生长素合成、运输等过程相关基因的表 达。对野生型与突变体授粉后15天的籽粒进行生长素含量的UPLC-MS/MS分析，发现突 变体中的生长素含量较野生型下降了 30%,中胚轴-胚芽鞘重力性反应延迟，根中DR5信号 较野生型明显减弱，PINla的分布更加分散。对突变体和ZmE”。/基因敲除突变体植 株施加不同浓度的外源I-NAA,发现低浓度的I-NAA能够提高e/W/突变体和敲除株系籽 粒的发芽率。以上结果表明ZmEHDl基因的突变影响了玉米植株中生长素的体内平衡。项目执行期间，课题组成功对籽粒灌浆突变体候选基因进行了图位克隆和功能验证，并 初步明确其作用机制，完成了
36、项目研究目标。并发表论文4篇，一级学报5篇。中请专利2 项，选育玉米新品种2个，参编十三五教材1部，参加国家精品开放课程建设1项，主持校 级在线开放课程1项，主持科研项目3项，培养研究生6名。2、成果内容、特色及创新点，主要学术价值和应用价值2.1成果内容（1）玉米籽粒灌浆突变体助蜴基因的精细定位和克隆对约53000株的分离群体（F3代分离穗上的正常籽粒）切胚乳快速抽提DNA,根据初 步定位结果，利用目标基因两侧最近的分了标记bnlg589和RM1对各个单株进行筛选。共 筛选到1167株交换单株。随后将筛选的交换单株育苗并移栽到大田，苗期对这些交换单株 提取高质量DNA进行基因型验证和后续研究
37、，将这些单株全部自交授粉，观察穗部籽粒的 分离情况最终确认表型。借助玉米B73基因组序列开发目标区段内的分子标记，对交换单 株进行分析。将石，定位到约6Kb的区间，这个区间包含两个ORF （图1）。经过序列 分析发现，GRMZM2G052740的编码区在WT和突变体之间有8个SNP差异，其中三个造 成氨基酸的变异，而区间内GRMZM2Go52720只有一个外显子，且序列无差异。因此，将 GRMZM2Go52740作为候选基因进行研究。GRMZM2G052740的DNA序列长度约4.4Kb,包含16个外显子，1个转录本(图2), 编码547个氨基酸的蛋白，分子量约为61KDo利用GcnBank进
38、行BLASTP分析表明， GRMZM2Go52740与拟南芥EHD蛋白(AtEHDI和AtEHD2)高度同源。ZmEHDl蛋白含 有 EHD 家族的典型结构：一个有两个 calcium-binding EF-hands (15-39 aaand49-84 aa)组 成的 EH domain,一个 P-loop (GQYSTGKT) , dynamin-type guanine nucleotide-binding domain, 一个 coil-coil domaino图1 ZinEHDI的图位克隆A 300 bpA 300 bpT/C A/GC/T A/GC/G V/A K/K A/AM/V D/EG/AV/VT/C G/C D/D G/GB 100 aa an i : EH-domainP-