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1、湖南省地方标准桑黄菌种质量鉴定技术规程编制说明湖南省微生物研究院2021年12月31日法的要求。人员要求应符合农业部2006年食用菌菌种管理办法 的要求。菌种送样时同一待鉴定菌种应不少于10瓶(袋)。将样品 分为A、B两份，每份5瓶(袋)以上，其中1份送检，另1份留 样备查。留样菌种应于4七6C下贮存。(3)质量指标包括感官指标应符合NY/T 1846的规定、杂菌及害虫检验应符合 NY/T 1284的规定。微生物学和理化指标。(4)鉴定方法主要包括菌丝体培养、基因组DNA提取、PCR扩增、电泳检测、 数据库比对、系统发育树的构建。(5)判定规则主要包括合格菌种、不合格菌种、适宜生产的菌种。(6
2、)档案管理建立完整的菌种质量检验档案。八、与有关现行法律、法规的关系本标准的制定顺应时势，在湖南省内为首次制定。本标准在编 制过程中，尽量直接引用的方式或修改引用相关国家标准、行业标准 主要技术内容，确保与相关国家标准、行业标准相协调、相符合，无 冲突。九、重大分歧意见的处理经过和依据本标准是起草单位项目组经过多年的科学研究、实践指导、科学 试验基础上，参考已经颁布实施的相关标准和规程，再广泛征求国内 有关科研专家、生产、管理人员的意见，逐步修改和完善而成的。因 此本标准在编制的过程中，相关人员没有提出重大分歧和意见。十、标准预计产生的经济、社会效益桑黄包括桑树桑黄、杨树桑黄、暴马桑黄、粗毛桑
3、黄等11个种， 其中只有杨树桑黄和粗毛桑黄实现了工厂化栽培，其他很多桑换难以 人工栽培，由于环境和气候等外界条件的变化会导致桑黄子囊果的形 状、大小、颜色的改变，甚至同一物种不同发育阶段，其形态特征都 有较大变化，加之用于区分物种的显微特征较有限，张冠李戴的名称 错用普遍，必须利用分子生物学技术才能进行准确的桑黄菌种鉴定。 桑黄菌种容易老化，连续多次继代培养会导致菌株老化，而老化菌株 用于生产栽培会严重降低子实体产量，在规模栽培之前对菌种老化进 行评价可以提高生产效率。为了避免桑黄栽培生产中出现减产甚至绝 收等问题，根据桑黄菌种质量鉴定技术规程对菌种进行预先筛选是桑 黄栽培成功的重要环节。本标
4、准的制定可使桑黄产量得到提升，品质 提高，缓解市场供不应求的现状，对进一步推动桑黄产业化发展和人 类健康具有重要的现实意义。一、任务来源根据湖南省市场监督管理局文件关于申报2022年地方标准制 修订项目计划的通知流程进行申报，2022年4月经湖南省市场监 督管理局批准，桑黄菌种质量鉴定技术规程列入2022年度湖南 省地方标准制修订项目立项计划，该标准制定由湖南省微生物研究院、 长沙县综合检测中心、湖南湘蕈生物科技有限公司编写制定，湖南省 农业标准化技术委员会归口。二、制定标准的目的、意义桑黄(Sanghuangporus)是一类具有重要药用价值的珍稀大型真 菌，因其常生长在桑属植物上，黄棕色而
5、得名，其子实体富含多糖类、 苗类、三祐类、黄酮类、口比喃酮类、多酚类、香豆素类、生物碱、氨 基酸等生物活性物质，具有抗肿瘤、保肝、降血糖、抗血管生成、抗 炎症、抗氧化的功效，已引起国际科研部门、医药界和保健品行业的 广泛关注。桑黄是目前国际公认的生物抗癌效果最好的药用真菌，产 品供不应求，国内野生的桑黄新鲜子实体价格达到2000元/kg,有“森 林黄金”之美称。但野生桑黄为多年生，资源稀缺，无法满足市场需 求，也阻碍了桑黄的进一步研究开发，利用野生桑黄子实体进行分离、 驯化后，进行人工栽培，获得的子实体可用于用于研制桑黄抗肿瘤新 药、抗癌治疗的辅助治疗剂及相关保健品，因此具有广阔的市场前景。近
6、年来桑黄栽培进入商业化高速发展阶段，2020年全国桑黄栽 培袋达到8万袋，子实体产量突破3万公斤，桑黄主要种植范围由吉 林、山东、新疆等地逐渐向陕西、河北、湖北、湖南等地区扩展。尽 管桑黄人工栽培技术不断优化，仍存在菌种质量不稳定的问题，导致 子实体产量不稳定，菌种质量一旦出现问题将会给企业带来严重的经 济损失，所以桑黄菌种质量越来越受到重视。桑黄菌种质量检验主要包括菌种鉴定、菌株活力分析和基因检 测3个方面。研究报道目前桑黄包括桑树桑黄、杨树桑黄、暴马桑黄、 粗毛桑黄等9个种，其中只有杨树桑黄和粗毛桑黄实现了工厂化栽培, 其他很多桑换难以人工栽培，由于环境和气候等外界条件的变化会导 致桑黄子
7、囊果的形状、大小、颜色的改变，甚至同一物种不同发育阶 段，其形态特征都有较大变化，加之用于区分物种的显微特征较有限， 张冠李戴的名称错用普遍，必须利用分子生物学技术才能进行准确的 桑黄菌种鉴定。桑黄菌种容易老化，连续多次继代培养会导致菌株老 化，而老化菌株用于生产栽培会严重降低子实体产量，在规模栽培之 前对菌种老化进行评价可以提高生产效率。为了避免桑黄栽培生产中 出现减产甚至绝收等问题，根据桑黄菌种质量鉴定技术规程对菌种进 行预先筛选是桑黄栽培成功的重要环节。本标准拟规定桑黄菌种质量鉴定的术语和定义、质量指标、鉴 定方法、鉴定规则及标签、标志、包装、贮运。本标准适用于湖南省 桑黄菌种的质量鉴定
8、，可使桑黄产量得到提升，品质提高，缓解市场 供不应求的现状，对进一步推动桑黄产业化发展和人类健康具有重要 的现实意义。三、制定标准的原则编写格式按中华人民共和国国家标准GB/T 1. 1-2020标准化工作导则 第1部分：标准的结构和编写规则。标准各项技术指标合规、 安全、科学、可操作性强。1、合规的原则制定本标准遵循国家有关法律、法规的要求，符合国家、省政 府有关农业和标准化方面的政策规定。2、安全的原则制定本标准遵循确保质量安全的原则，标准中有关质量安全控 制按绿色农产品相关要求确定。3、科学的原则制定本标准遵循生态、环保、科学的原则，标准的内容要求科 学可靠。4、可操作的原则本标准所确定
9、的术语和定义、各项要求符合湖南省农业生产的 特点特色，方便实际操作。四、项目参加单位和人员分工项目参加单位为湖南省微生物研究院、长沙县综合检测中心、 湖南湘蕈生物科技有限公司，项目组成员具有多年从事桑黄科研、推 广、基地建设和管理工作的经验。2022年3月成立编制组，制定了 工作计划，确定了项目主要内容和技术路线，明确了参加人员的分工。表1项目主要参加人员与分工序号姓名职务/职称学历项目任务分工所在单位1唐少军助理研究员硕士项目主持湖南省微生物研究院2邱华丽工程师硕士质量检测长沙县综合检测中心3钟文涛副主任/工程师博士桑黄菌种质量判定湖南省产商品质量监督检验研究院4许隽科长/副研究员博士收集资
10、料湖南省微生物研究院5喻桃生高级农艺师本科出菇试验湖南湘蕈生物科技有限公司6杨祎农艺师本科标准初稿撰写湖南省微生物研究院7邵晨霞高级农艺师硕士标准检索湖南省微生物研究院8任锐助理研究员硕士菌种分子生物学鉴定湖南省微生物研究院9朱华理助理研究员博士感官鉴定湖南省微生物研究院10靳磊高级农艺师本科ITS序列分析湖南省微生物研究院11吴胜莲高级农艺师本科杂菌检测湖南省微生物研究院12贺月林研究员硕士基地实地调研考察湖南省微生物研究院五、标准制定的过程1、前期研究基础项目组多年一直从事桑黄相关研究工作，对桑黄的研究进展和动 态具有较全面的认识，持续开展了羊肚菌的生物学特性研究工作，已制定完成湖南省地方
11、标准3个。本标准是项目组在多次试验基础上筛选获得的桑黄菌种质量鉴定技术。2、株的形态鉴定该菌株子实体采摘于活杨树的主干上，子实体呈平伏状，木栓质, 长13cm,宽8cm,厚3clii,上部分为青色褶皱状，无粗毛，子实体边 缘有褐色粗毛，下部分为金黄色并生长有粗毛，粗毛间有孔隙。菌株IH3在固体PDA培养基上能正常生长菌丝，以接种块为中心呈辐射状 扩张生长，菌丝呈绒毛状，生长前期为白色，后期菌丝变为金黄色, 在棉蓝试剂中不变色，在液体培养基中，菌丝呈黄色球型，可贴壁生 长，显微镜下菌丝直径约为5um,极少分枝，有不明显的分隔。担 抱子呈椭圆形，表面光滑，平均大小为长8.8 口m,宽6. lum,
12、形态 特征与中国真菌志粗毛纤孔菌相似。图1菌株川3的形态鉴定A：固体培养菌丝形态；B:液体培养菌丝形态；C:显微镜下抱子形态；D：显微镜下菌丝形态 3、分离菌株的分子鉴定通过PCR扩增分离菌株的ITS序列，将PCR产物双向测序后进行 拼接，发现ITS序列的长度为810bp,将其在NCBI数据库中进行Blast 比对，发现与粗毛桑黄I. hispidus genes (AB811856)的ITS序列 最为接近，相似度为94%,结合形态分析确定IH3菌株为粗毛桑黄。 从NCBI选取与分离菌株IH3同源性最接近的3个粗毛桑黄菌株、纤 孔菌属的5个模式菌种、在分类上易与粗毛桑黄混淆的针层孔菌属和 桑黄
13、菌属的模式种的ITS序列，用邻接法(N-J)构建系统发育树。由 图2可见，系统发育树明显分为3个类群，Group 1为桑黄孔菌属， Group2为针层孔菌属，Group3为纤层孔菌属。分离菌株IH3在进化 树的纤孔菌属(Group3),与粗毛桑黄 I. hispidus genes(AB811856)的亲缘关系最接近，与粗毛桑黄的3个菌株的遗传距离最小，结合形 态特征以及BLAST比对可以确定IH3为粗毛桑黄，但该菌株在进化树 上形成独立的分支，且与最接近的菌株的相似度为94%,有可能是粗 毛桑黄新的亚种。将IH3菌株的ITS序列提交NCBI,得到登录号为： KX575646o76MG2098
14、21 A_Sanghuangporus sanghuang99JQ86031 QAJnonotus sanghuang产 HM584806.1_/. linteus57-JN642591 AJ.vaniniiJQ860308.1_l. lonicericola87JN642569.1_/. baumiiJQ860306.1 J.zonatusAY340052.1_P/7e/nus parmastoiGU903009.1_P. igniarius ioo一KU139132.1 P.tremulae56一JQ828885.1 P. monticola63 一一IGQ383783.1P. tuber
15、culosusso JQ828926.1_R orientoasiaticusJN169789.1. subdryophila一 KC312697.1. obliquus9085ioo HM362906.1_/. rickiiAY072024.1_/. patouillardii9996KX881608.1_/. hispidus strain MK15：EU282482.1_/. hispidus strain S45IH379 42AB8118561 _/. hispidus genesKF446600.1_/. krawtzewii97AM269781.1_/. andersonii65
16、 KJ575523.1 J. sp0.02图2根据ITS基因序列构建IH3菌株的系统发育树4、桑黄菌种品种鉴定通过购买、交换、分离等方式获取已发表并保藏的菌种资源，通 过野外实地调查收集野生桑黄子实体，获取标本并进行菌种分离，构 建桑黄菌种资源库。对获取到的菌种资源结合形态学和分子系统学的方法，构建了其多基因组合发育图谱，阐明了桑黄及其近似种各组间的系统学关系，确定各分类单元的地位，减少日后研究的分歧。桑树桑黄环区桑鲍姆桑黄忍冬桑黄图3桑黄的分类鉴定2、编制标准征求意见稿2022年4月-5月调查、收集我省桑黄菌种的相关数据，与食用 菌菌种企业进行面对面的意见交流。2022年6月-9月收集和借鉴
17、国 内外有关桑黄菌种鉴定相关技术文献、标准，结合多年来在桑黄菌种 的研究成果与成功经验，完成标准文本各章节的起草。2022年11月 根据地方标准编写格式，形成了桑黄菌种质量鉴定技术规程地方 标准的征求意见稿，撰写了编制说明。3、编制标准送审稿2022年11月书面咨询10家食用菌菌种相关单位的专家意见， 并在在湖南省市场监管局官方网站公开征求意见。对专家的意见汇总 后进行逐项修改和完善(见附件1),形成了标准送审稿。4、编制标准报批稿2022年12月邀请有关专家召开标准审查会，对标准进行审查并 提出修改建议，形成标准报批稿，送湖南省市场监管局报批。六、标准结构框架本标准文本的主要章节内容如下：1范围、2规范性引用文件、 3术语和定义、4鉴定要求、5质量指标、6鉴定方法、7判定规则、 8档案管理。七、标准的主要内容说明1、标准的适用范围本标准适用于湖南省内桑黄原种和栽培种的质量鉴定。2、标准正文主要内容说明根据本标准的内容，正文部分包括了 “术语和定义”、“鉴定 要求”、“质量指标”、“鉴定方法”、“判定规则”、“档案管理” 6个部分。(1)术语和定义为便于本标准的编制和使用，对适用于本标准的专有术语“桑 黄”进行了定义。(2)鉴定要求包括包括资质要求应符合农业部2006年食用菌菌种管理办