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1、实验六实验六微生物细胞的大小测量和显微计数微生物细胞的大小测量和显微计数主 讲:徐尔尼生命科学学院生物技术系一、目的与要求 学学学学习习习习测测测测微微微微尺尺尺尺测测测测定定定定微微微微生生生生物物物物细细细细胞胞胞胞大大大大小小小小，以以以以及及及及血血血血球球球球计计计计数数数数板板板板计算微生物细胞数目的原理。计算微生物细胞数目的原理。计算微生物细胞数目的原理。计算微生物细胞数目的原理。掌掌掌掌握握握握使使使使用用用用测测测测微微微微尺尺尺尺和和和和血血血血球球球球计计计计数数数数板板板板对对对对微微微微生生生生物物物物细细细细胞胞胞胞进进进进行行行行大大大大小测量和细胞计数的方法。小
2、测量和细胞计数的方法。小测量和细胞计数的方法。小测量和细胞计数的方法。增强微生物细胞大小的感性认识。增强微生物细胞大小的感性认识。增强微生物细胞大小的感性认识。增强微生物细胞大小的感性认识。二、基本原理基本原理1 1、微生物细胞大小的测量、微生物细胞大小的测量 微微微微生生生生物物物物细细细细胞胞胞胞的的的的大大大大小小小小是是是是微微微微生生生生物物物物基基基基本本本本的的的的形形形形态态态态特特特特征征征征，也也也也是是是是分分分分类类类类鉴鉴鉴鉴定定定定的的的的依依依依据据据据之之之之一一一一。微微微微生生生生物物物物大大大大小小小小的的的的测测测测定定定定，需需需需要要要要在在在在显显
3、显显微微微微镜镜镜镜下下下下，借借借借助助助助特特特特殊殊殊殊测测测测量量量量工工工工具具具具测测测测微微微微尺尺尺尺（包包包包括括括括镜台测微尺和目镜测微尺镜台测微尺和目镜测微尺镜台测微尺和目镜测微尺镜台测微尺和目镜测微尺）。）。）。）。测测测测微微微微尺尺尺尺原原原原理理理理：镜镜镜镜台台台台测测测测微微微微尺尺尺尺是是是是中中中中央央央央部部部部分分分分刻刻刻刻有有有有精精精精确确确确等等等等分分分分线线线线的的的的载载载载玻玻玻玻片片片片，一一一一般般般般是是是是将将将将1mm1mm等等等等分分分分为为为为100100格格格格，每每每每格格格格长长长长0.01mm(0.01mm(即即即
4、即10m)10m)。镜镜镜镜台台台台测测测测微微微微尺尺尺尺并并并并不不不不直直直直接接接接用用用用来来来来测测测测量量量量细细细细胞胞胞胞的的的的大大大大小小小小，而而而而是是是是用用用用于于于于校校校校正正正正目目目目镜镜镜镜测测测测微微微微尺尺尺尺每每每每格格格格的的的的相相相相对对对对长长长长度，然后再用目镜测微尺测量微生物细胞的大小。度，然后再用目镜测微尺测量微生物细胞的大小。度，然后再用目镜测微尺测量微生物细胞的大小。度，然后再用目镜测微尺测量微生物细胞的大小。二、基本原理基本原理2 2、显微直接计数、显微直接计数 显显显显微微微微镜镜镜镜直直直直接接接接计计计计数数数数法法法法是
5、是是是将将将将小小小小量量量量待待待待测测测测样样样样品品品品的的的的悬悬悬悬浮浮浮浮液液液液置置置置于于于于一一一一种种种种特特特特别别别别的的的的具具具具有有有有确确确确定定定定面面面面积积积积和和和和容容容容积积积积的的的的载载载载玻玻玻玻片片片片上上上上（又又又又称称称称计计计计菌菌菌菌器器器器），于于于于显显显显微微微微镜镜镜镜下下下下直直直直接接接接计计计计数数数数的的的的一一一一种种种种简简简简便便便便、快速、直观的方法。快速、直观的方法。快速、直观的方法。快速、直观的方法。血血血血细细细细胞胞胞胞计计计计数数数数板板板板原原原原理理理理：计计计计数数数数板板板板是是是是一一一一
6、块块块块特特特特制制制制的的的的载载载载玻玻玻玻片片片片，其其其其上上上上由由由由四四四四条条条条槽槽槽槽构构构构成成成成三三三三个个个个平平平平台台台台，中中中中间间间间较较较较宽宽宽宽的的的的平平平平台台台台又又又又被被被被一一一一短短短短横横横横槽槽槽槽隔隔隔隔成成成成两两两两半半半半，每每每每一一一一边边边边的的的的平平平平台台台台上上上上各各各各该该该该有有有有一一一一个个个个方方方方格格格格网网网网，每每每每个个个个方方方方格格格格多多多多共共共共分分分分为为为为九九九九个个个个大大大大方方方方格格格格，中中中中间间间间的的的的大方格即为计数室。大方格即为计数室。大方格即为计数室。
7、大方格即为计数室。二、基本原理基本原理 每个计数室（大方格）边长为每个计数室（大方格）边长为1mm1mm，则每个大方，则每个大方格的面积为格的面积为1mm1mm2 2，盖上盖玻片后，盖玻片与载玻片之，盖上盖玻片后，盖玻片与载玻片之间的高度为间的高度为0.1mm0.1mm，所以计数室的容积为，所以计数室的容积为0.1mm0.1mm3 3（即（即万分之一毫升）。万分之一毫升）。每个计数室有每个计数室有2525或或1616个中方格。计数时，通常数个中方格。计数时，通常数五个中方格的总菌数，然后求得每个中方格的平均值，五个中方格的总菌数，然后求得每个中方格的平均值，再乘以再乘以2525或或1616，就
8、得出一个大方格的总菌数，然后换，就得出一个大方格的总菌数，然后换算成算成1ml1ml菌液中的总菌数。菌液中的总菌数。三、实验器材1 1、菌种：、菌种：、菌种：、菌种：酿酒酵母菌液酿酒酵母菌液酿酒酵母菌液酿酒酵母菌液、细菌三形片细菌三形片细菌三形片细菌三形片2 2 2 2、试剂：、试剂：、试剂：、试剂：无水乙醇、香柏油、二甲苯无水乙醇、香柏油、二甲苯无水乙醇、香柏油、二甲苯无水乙醇、香柏油、二甲苯3 3、仪器或其他用具：、仪器或其他用具：、仪器或其他用具：、仪器或其他用具：目镜测尺、镜台测微尺、血球目镜测尺、镜台测微尺、血球目镜测尺、镜台测微尺、血球目镜测尺、镜台测微尺、血球计数板、盖玻片、无菌
9、吸管、酒精灯、显微镜、擦计数板、盖玻片、无菌吸管、酒精灯、显微镜、擦计数板、盖玻片、无菌吸管、酒精灯、显微镜、擦计数板、盖玻片、无菌吸管、酒精灯、显微镜、擦镜纸、滤纸等镜纸、滤纸等镜纸、滤纸等镜纸、滤纸等四、操作步骤1 1、微生物细胞大小测量、微生物细胞大小测量1 1）目镜测微尺的校正：）目镜测微尺的校正：）目镜测微尺的校正：）目镜测微尺的校正：将将将将目目目目镜镜镜镜测测测测微微微微尺尺尺尺装装装装入入入入目目目目镜镜镜镜载载载载物物物物台台台台上上上上放放放放镜镜镜镜台台台台测测测测微微微微尺尺尺尺调调调调节节节节粗粗粗粗调调调调和和和和细细细细节节节节调调调调至至至至直直直直看看看看到到
10、到到镜镜镜镜台台台台测测测测微微微微尺尺尺尺的的的的刻刻刻刻度度度度 转转转转动动动动目目目目镜镜镜镜，推推推推动动动动镜镜镜镜台台台台测测测测微微微微尺尺尺尺，使使使使两两两两尺尺尺尺在在在在某某某某一一一一区区区区域域域域内内内内两两两两线线线线完完完完全全全全重重重重合合合合数数数数出出出出两两两两重重重重合合合合线线线线之之之之间间间间镜镜镜镜台台台台测测测测微微微微尺尺尺尺和和和和目目目目镜镜镜镜测测测测微微微微尺尺尺尺所所所所占占占占的的的的格格格格数数数数根根根根据据据据两测微尺重合格数，计算出目镜测微尺每格实际长度两测微尺重合格数，计算出目镜测微尺每格实际长度两测微尺重合格数，
11、计算出目镜测微尺每格实际长度两测微尺重合格数，计算出目镜测微尺每格实际长度 。按按按按上上上上述述述述步步步步骤骤骤骤分分分分别别别别校校校校正正正正低低低低倍倍倍倍镜镜镜镜、高高高高倍倍倍倍镜镜镜镜和和和和油油油油镜镜镜镜的的的的下下下下目目目目镜镜镜镜测测测测尺尺尺尺每每每每小小小小格格格格的的的的实实实实际长度。际长度。际长度。际长度。四、操作步骤2 2）菌体大小的测量：）菌体大小的测量：）菌体大小的测量：）菌体大小的测量：取下镜台测微尺取下镜台测微尺取下镜台测微尺取下镜台测微尺 将待测标本片放在载物台上将待测标本片放在载物台上将待测标本片放在载物台上将待测标本片放在载物台上 观观观观察
12、标本片中细胞所占目镜测微尺的格数察标本片中细胞所占目镜测微尺的格数察标本片中细胞所占目镜测微尺的格数察标本片中细胞所占目镜测微尺的格数 根据目镜测根据目镜测根据目镜测根据目镜测尺的实际长度算出细菌的大小尺的实际长度算出细菌的大小尺的实际长度算出细菌的大小尺的实际长度算出细菌的大小操作要点：操作要点：操作要点：操作要点：观察时光线不宜过强，否则难以找到镜台测微尺的刻度。观察时光线不宜过强，否则难以找到镜台测微尺的刻度。观察时光线不宜过强，否则难以找到镜台测微尺的刻度。观察时光线不宜过强，否则难以找到镜台测微尺的刻度。换高倍镜和油镜校正时，防止接物镜压坏镜台测微尺和损坏换高倍镜和油镜校正时，防止接
13、物镜压坏镜台测微尺和损坏换高倍镜和油镜校正时，防止接物镜压坏镜台测微尺和损坏换高倍镜和油镜校正时，防止接物镜压坏镜台测微尺和损坏镜头。镜头。镜头。镜头。四、操作步骤2 2、显微直接计数、显微直接计数1 1）血球计数室的观察和清洗）血球计数室的观察和清洗）血球计数室的观察和清洗）血球计数室的观察和清洗 取血球计数板置于载物台上取血球计数板置于载物台上取血球计数板置于载物台上取血球计数板置于载物台上 观察熟悉计数室的中观察熟悉计数室的中观察熟悉计数室的中观察熟悉计数室的中方格和小方格方格和小方格方格和小方格方格和小方格 取下血球计数板取下血球计数板取下血球计数板取下血球计数板用自来水冲洗计用自来水
14、冲洗计用自来水冲洗计用自来水冲洗计数室后，再用无水乙醇将血球计数室冲洗干净数室后，再用无水乙醇将血球计数室冲洗干净数室后，再用无水乙醇将血球计数室冲洗干净数室后，再用无水乙醇将血球计数室冲洗干净 置置置置干燥箱干燥干燥箱干燥干燥箱干燥干燥箱干燥 。2 2）样品中酵母菌细胞的直接计数：）样品中酵母菌细胞的直接计数：）样品中酵母菌细胞的直接计数：）样品中酵母菌细胞的直接计数：取取取取干干干干净净净净血血血血球球球球计计计计数数数数板板板板 在在在在计计计计数数数数室室室室上上上上方方方方盖盖盖盖上上上上盖盖盖盖玻玻玻玻片片片片 用用用用无无无无菌菌菌菌吸吸吸吸管管管管，吸吸吸吸取取取取摇摇摇摇匀匀
15、匀匀的的的的酵酵酵酵母母母母菌菌菌菌稀稀稀稀释释释释液液液液 在在在在盖盖盖盖玻玻玻玻片片片片边边边边缘缘缘缘沾沾沾沾一一一一下下下下，让让让让菌菌菌菌液液液液沿沿沿沿缝缝缝缝隙隙隙隙靠靠靠靠毛毛毛毛细细细细管管管管渗渗渗渗透透透透作作作作用用用用进进进进入入入入计计计计数数数数室室室室 静静静静置置置置5min 5min 低低低低倍倍倍倍镜镜镜镜或或或或高高高高倍倍倍倍镜镜镜镜计计计计算算算算每每每每个个个个中中中中方方方方格格格格内内内内的的的的细细细细胞胞胞胞数数数数 完毕后完毕后完毕后完毕后清洗血细胞计数板清洗血细胞计数板清洗血细胞计数板清洗血细胞计数板 冲洗、干燥冲洗、干燥冲洗、干燥
16、冲洗、干燥 计数规则：计数规则：1 1）要求每小格内约有要求每小格内约有要求每小格内约有要求每小格内约有5 5 5 510101010个菌体为宜；个菌体为宜；个菌体为宜；个菌体为宜；2 2 2 2）选计数室四个角的中方格和中央的一个中方格进行计数；）选计数室四个角的中方格和中央的一个中方格进行计数；）选计数室四个角的中方格和中央的一个中方格进行计数；）选计数室四个角的中方格和中央的一个中方格进行计数；3 3 3 3）当细胞位于方格的线上时，一般）当细胞位于方格的线上时，一般）当细胞位于方格的线上时，一般）当细胞位于方格的线上时，一般只数上方和右边线上的细胞只数上方和右边线上的细胞；4 4 4
17、4）酵酵酵酵母母母母出出出出芽芽芽芽，又又又又未未未未脱脱脱脱离离离离母母母母体体体体的的的的，只只只只有有有有当当当当芽芽芽芽体体体体大大大大小小小小达达达达到到到到母母母母细细细细胞胞胞胞的的的的一半时，即作为两个菌体计算一半时，即作为两个菌体计算一半时，即作为两个菌体计算一半时，即作为两个菌体计算；操作要点：操作要点：操作要点：操作要点：血球计数室要清洁。血球计数室要清洁。血球计数室要清洁。血球计数室要清洁。观察时光线不宜过强，否则难以找到计数室。观察时光线不宜过强，否则难以找到计数室。观察时光线不宜过强，否则难以找到计数室。观察时光线不宜过强，否则难以找到计数室。吸取菌液前菌液要充分摇
18、匀。吸取菌液前菌液要充分摇匀。吸取菌液前菌液要充分摇匀。吸取菌液前菌液要充分摇匀。血球计数室充满菌液后，要静置血球计数室充满菌液后，要静置血球计数室充满菌液后，要静置血球计数室充满菌液后，要静置5min5min5min5min。五、实验数据及处理结果五、实验数据及处理结果 1 1、大小测量、大小测量、大小测量、大小测量1 1 1 1）将目镜测微尺校正结果填入下表：）将目镜测微尺校正结果填入下表：）将目镜测微尺校正结果填入下表：）将目镜测微尺校正结果填入下表：接目镜放大倍数：接目镜放大倍数：接目镜放大倍数：接目镜放大倍数：2 2 2 2）将各菌测定结果填入下表）将各菌测定结果填入下表）将各菌测定
19、结果填入下表）将各菌测定结果填入下表接物镜接物镜接物镜接物镜接物镜倍数接物镜倍数接物镜倍数接物镜倍数目镜测微尺格数目镜测微尺格数目镜测微尺格数目镜测微尺格数镜台测微尺格数镜台测微尺格数镜台测微尺格数镜台测微尺格数目镜测微尺每格代表的长度目镜测微尺每格代表的长度目镜测微尺每格代表的长度目镜测微尺每格代表的长度（m）低倍镜低倍镜低倍镜低倍镜高倍镜高倍镜高倍镜高倍镜油镜油镜油镜油镜微生物类型微生物类型微生物类型微生物类型目镜测微目镜测微目镜测微目镜测微尺每格代尺每格代尺每格代尺每格代表的长度表的长度表的长度表的长度（m）宽宽宽宽长长长长菌体大小范菌体大小范菌体大小范菌体大小范围（围（围（围（m）宽宽
20、宽宽长长长长目镜测微尺目镜测微尺目镜测微尺目镜测微尺格数格数格数格数宽度（宽度（宽度（宽度（m）目镜测微尺目镜测微尺目镜测微尺目镜测微尺格数格数格数格数长度（长度（长度（长度（m）杆菌杆菌杆菌杆菌球菌球菌球菌球菌螺旋菌螺旋菌螺旋菌螺旋菌五、实验数据及处理结果五、实验数据及处理结果 2 2、显微计数、显微计数、显微计数、显微计数 将结果记录于下表中，将结果记录于下表中，将结果记录于下表中，将结果记录于下表中，A A A A表示五个中方格的总菌数，表示五个中方格的总菌数，表示五个中方格的总菌数，表示五个中方格的总菌数，B B B B表示菌液稀释倍数。表示菌液稀释倍数。表示菌液稀释倍数。表示菌液稀释
21、倍数。各中方格菌数各中方格菌数各中方格菌数各中方格菌数A AB B二室平均值二室平均值二室平均值二室平均值菌数菌数菌数菌数/ml/ml1 12 23 34 45 5第一室第一室第一室第一室第二室第二室第二室第二室六、思考与讨论思考与讨论1 1、根据你的体会，说明用血细胞计数板的误差主要、根据你的体会，说明用血细胞计数板的误差主要、根据你的体会，说明用血细胞计数板的误差主要、根据你的体会，说明用血细胞计数板的误差主要来自哪些方面？应如何尽量减少误差、力求准确？来自哪些方面？应如何尽量减少误差、力求准确？来自哪些方面？应如何尽量减少误差、力求准确？来自哪些方面？应如何尽量减少误差、力求准确？2 2
22、、某单位要求知道一种干酵母粉中的活菌存活率，、某单位要求知道一种干酵母粉中的活菌存活率，、某单位要求知道一种干酵母粉中的活菌存活率，、某单位要求知道一种干酵母粉中的活菌存活率，请设计请设计请设计请设计1-21-2种可行的检测方法。种可行的检测方法。种可行的检测方法。种可行的检测方法。下次实验项目：培养基的配制与高压蒸汽灭菌下次实验项目：培养基的配制与高压蒸汽灭菌下次实验项目：培养基的配制与高压蒸汽灭菌下次实验项目：培养基的配制与高压蒸汽灭菌 采用目镜测微尺测量经显微镜放大后的细胞物象，由于不采用目镜测微尺测量经显微镜放大后的细胞物象，由于不采用目镜测微尺测量经显微镜放大后的细胞物象，由于不采用
23、目镜测微尺测量经显微镜放大后的细胞物象，由于不同显微镜或不同的目镜和物镜组合放大倍数不同，目镜测微尺同显微镜或不同的目镜和物镜组合放大倍数不同，目镜测微尺同显微镜或不同的目镜和物镜组合放大倍数不同，目镜测微尺同显微镜或不同的目镜和物镜组合放大倍数不同，目镜测微尺每小格所代表的实际长度也不一样。因此在每小格所代表的实际长度也不一样。因此在每小格所代表的实际长度也不一样。因此在每小格所代表的实际长度也不一样。因此在测量前测量前测量前测量前要先对目镜要先对目镜要先对目镜要先对目镜测微尺进行测微尺进行测微尺进行测微尺进行校正校正校正校正。校正公式：校正公式：目镜测微尺每格长度目镜测微尺每格长度(m)(
24、m)两重合线间两重合线间镜台测微尺小格数镜台测微尺小格数10/10/两重合线间两重合线间目镜测微尺小格数目镜测微尺小格数10m10m计数室计数室计数室计数室16小方格小方格 25中方格计数室中方格计数室 25小方格小方格 16中方格计数室中方格计数室计数室的刻度有两种规格：计数室的刻度有两种规格：计算公式：计算公式：25个中方格计算公式：个中方格计算公式：总菌液中的总菌数（个总菌液中的总菌数（个/ml）A/525104B 50000AB16个中方格计算公式：个中方格计算公式：总菌液中的总菌数（个总菌液中的总菌数（个/ml）A/516104B 32000AB式中：式中：A为五个中方格的总菌数；为五个中方格的总菌数；B为菌液的稀释倍数；为菌液的稀释倍数；