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1、荧光定量PCRreal time-PCR定量定量PCR反应体系反应体系 actinachialyvlgstat actinachialyvlgstat模板cDNA4ulTag mixture10ul引物10.5ul引物20.5ulH205ul1模板2模板 443.45ng/ul686.75 ng/ul 17.738 ng/ul26.47 ng/ul定量与常规定量与常规PCR的差别的差别常规常规PCR技术：技术：对对PCR扩增反应扩增反应的的终产物终产物进行定进行定量及定性分析量及定性分析定量定量PCR技术技术：通过对通过对PCR扩增反扩增反应中应中每一个循环产每一个循环产物物荧光荧光信号的信号
2、的实时实时检测检测从而实现对从而实现对起起始模板始模板定量及定性定量及定性的分析的分析三个关键词：三个关键词：实时，定量，荧光实时，定量，荧光PCR分四个阶段如何定量？如何定量？Ct值的概念值的概念Ct值的定义是值的定义是PCR扩增过程中，荧光信号扩增过程中，荧光信号开始由本底进入指数增长阶段的阈值所对开始由本底进入指数增长阶段的阈值所对应的应的循环次数循环次数。定量原理定量原理确定初始模板的浓度确定初始模板的浓度q初始初始 DNADNA量越多量越多,荧光荧光达到某一值（域值）时达到某一值（域值）时所需要的循环数越少所需要的循环数越少qLogLog浓度与循环数呈线性浓度与循环数呈线性关系，根据
3、样品扩增达关系，根据样品扩增达到域值的循环数就可计到域值的循环数就可计算出样品中所含的模板算出样品中所含的模板量量起点定量与终点定量荧光化学荧光化学qSYBR Green 1q TaqManTaqManSYBR Green I 工作原理工作原理。SYBR Green 1 结合到双链DNA的小沟部位SYBR Green 1 染料只有和双链DNA结合后才发荧光GTTTGGCCCCCCCAAAGGGACTTGATAGCATCGTAAGTTTTTTGGGGCCCCCCCCAAAAATACCGGGGTTACGAACG GTAAT未结合SYBR Green 1 dye变性变性:无荧光信号无荧光信号无荧光信号无荧光信号SYBR Green I 应用范围应用范围起始模板浓度定量融解曲线分析-可区分单一产物、变异产物、多种产物和（或）引物二聚体基因型分析SYBR Green I 优点优点SYBR Green I 缺点缺点PCR程序指南UNG酶使用原理金牌Tag酶活性参比荧光：管家荧光ROXROX校正效果校正效果96孔板设置举例PCR曲线标准曲线