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1、 细 胞 培 养 Cell Culture 第四章第四章 细胞培养的基本技术细胞培养的基本技术4.1 4.1 基本操作技术和要求基本操作技术和要求 uu培养前准备uu制订试验计划和操作程序制订试验计划和操作程序uu准备各种器材物品准备各种器材物品uu培养室和超净台的消毒uu0.2%0.2%新洁尔灭托洗地面新洁尔灭托洗地面uu紫外灯照射紫外灯照射30-6030-60分钟分钟uu以以75%75%乙醇擦拭无菌操作台面乙醇擦拭无菌操作台面培养室内的无菌操作培养室内的无菌操作uu洗手和着装洗手和着装uu彻底洗手彻底洗手uu以以75%75%乙醇消毒手和前臂乙醇消毒手和前臂uu可穿经紫外线照射可穿经紫外线照
2、射30min30min的一般清洁工作服。的一般清洁工作服。uu无菌培养操作无菌培养操作uu一切操作都应在火焰近处并经过灼烧进行。一切操作都应在火焰近处并经过灼烧进行。uu小心取用无菌之实验物品，避免造成污染。勿碰小心取用无菌之实验物品，避免造成污染。勿碰触吸管尖头部或是容器瓶口，亦不要在打开之容触吸管尖头部或是容器瓶口，亦不要在打开之容器正上方操作实验。容器打开后，以手夹住瓶盖器正上方操作实验。容器打开后，以手夹住瓶盖并握住瓶身，倾斜约并握住瓶身，倾斜约4545角取用，尽量勿将瓶盖角取用，尽量勿将瓶盖盖口朝上放置桌面。盖口朝上放置桌面。培养室内的无菌操作培养室内的无菌操作无菌操作中常犯的错误吸
3、管、剪刀等碰到其他器皿无菌操作中常犯的错误正确的拿管姿势错误的拿管姿势拿吸管时手碰到无菌区！拿吸管时手碰到无菌区！无菌操作中常犯的错误培养基浸湿吸管底部的棉花4.2 4.2 原代培养原代培养 将取得的组织细胞接入培养瓶或培养板中的过程称将取得的组织细胞接入培养瓶或培养板中的过程称为培养。如系组织块培养，则直接将组织块接入培养器为培养。如系组织块培养，则直接将组织块接入培养器皿底部，几个小时后组织块可贴牢在底部，再加入培养皿底部，几个小时后组织块可贴牢在底部，再加入培养基。如系细胞培养，一般应在接入培养器皿之前进行细基。如系细胞培养，一般应在接入培养器皿之前进行细胞计数，按要求以一定的量（以每毫
4、升细胞数表示）接胞计数，按要求以一定的量（以每毫升细胞数表示）接入培养器皿并直接加入培养基。细胞进入培养器皿后，入培养器皿并直接加入培养基。细胞进入培养器皿后，立即放入培养箱中，使细胞尽早进入生长状态。立即放入培养箱中，使细胞尽早进入生长状态。细细 胞胞 和和 组组 织织 培培 养养 计 数 细 胞细胞数/ml=计数16格稀释倍数 104原理：原理：（1 1）计算细胞数目可用血球计数盘或是）计算细胞数目可用血球计数盘或是CoultercounterCoultercounter粒子计数器自动计粒子计数器自动计数。数。（2 2）血球计数盘一般有二个）血球计数盘一般有二个chamberschambe
5、rs，每个，每个chamberchamber中细刻中细刻9 9个个1mm1mm2 2大正方大正方形，其中形，其中4 4个角落之正方形再细刻个角落之正方形再细刻1616个小格，深度均为个小格，深度均为0.1mm0.1mm。当。当chamberchamber上方盖上盖玻片后，每个大正方形之体积为上方盖上盖玻片后，每个大正方形之体积为1mm1mm2 20.1mm=1.0 x100.1mm=1.0 x10-4-4mlml。使。使用时，计数每个大正方形内之细胞数目，乘以稀释倍数，再乘以用时，计数每个大正方形内之细胞数目，乘以稀释倍数，再乘以10104 4，即，即为每为每mlml中之细胞数目。中之细胞数目
6、。（3 3）存活测试之步骤为）存活测试之步骤为dye exclusiondye exclusion（染料排除），利用染料会渗入死细（染料排除），利用染料会渗入死细胞中而呈色，而活细胞因细胞膜完整，染料无法渗入而不会呈色。一般胞中而呈色，而活细胞因细胞膜完整，染料无法渗入而不会呈色。一般使用蓝色之使用蓝色之trypan bluetrypan blue染料，如果细胞不易吸收染料，如果细胞不易吸收trypan bluetrypan blue，则用红，则用红色之色之Erythrosin bluishErythrosin bluish。计算细胞活率：活细胞数。计算细胞活率：活细胞数/（活细胞数（活细胞数
7、+死细胞死细胞数）数）100%100%。计数应在台盼兰染色后数分钟内完成，随时间延长，部分。计数应在台盼兰染色后数分钟内完成，随时间延长，部分活细胞也开始摄取染料；因为台盼兰对蛋白质有很强的亲和力，用不含活细胞也开始摄取染料；因为台盼兰对蛋白质有很强的亲和力，用不含血清的稀释液，可以使染色计数更为准确。血清的稀释液，可以使染色计数更为准确。两 个 概 念 uu原代培养原代培养uu直接从体内取出的细胞、组织和器官进行的第一次直接从体内取出的细胞、组织和器官进行的第一次的培养物。一旦已进行传代培养（的培养物。一旦已进行传代培养（SubcultureSubculture）的）的细胞，便不再称为原代培
8、养，而改称为细胞系。细胞，便不再称为原代培养，而改称为细胞系。uu传代培养传代培养uu细胞长满瓶底后要进行传代培养，将一瓶中的细胞细胞长满瓶底后要进行传代培养，将一瓶中的细胞消化悬浮后分至两到三瓶继续培养。每传代一次称消化悬浮后分至两到三瓶继续培养。每传代一次称为为“一代一代”。二倍体细胞一般只能传几十代，而转。二倍体细胞一般只能传几十代，而转化细胞系或细胞株则可无限地传代下去。化细胞系或细胞株则可无限地传代下去。培养细胞的取材 理论上讲各种动物和人体内的所有组织都可理论上讲各种动物和人体内的所有组织都可以用于培养，实际上幼体组织（尤其是胚胎组织）以用于培养，实际上幼体组织（尤其是胚胎组织）比
9、成年个体的组织容易培养，分化程度低的组织比成年个体的组织容易培养，分化程度低的组织比分化高的容易培养，肿瘤组织比正常组织容易比分化高的容易培养，肿瘤组织比正常组织容易培养。培养。组 织 块 培 养 法 新鲜取材的组织中新鲜取材的组织中 细胞仍具有分裂增殖的能力。将组织细胞仍具有分裂增殖的能力。将组织切成小块培养在模拟体内的环境中，小块组织的细胞可以游切成小块培养在模拟体内的环境中，小块组织的细胞可以游离出来，从培养液中吸取营养，继续分裂生长。离出来，从培养液中吸取营养，继续分裂生长。组织块培养法适用范围广，常用于肝脏、皮肤、角膜、组织块培养法适用范围广，常用于肝脏、皮肤、角膜、骨骼、韧带、血管
10、、神经、心脏等器官和组织的培养。骨骼、韧带、血管、神经、心脏等器官和组织的培养。58培培 养养 要要 点点uu材料新鲜材料新鲜材料新鲜材料新鲜uu严格无菌操作严格无菌操作严格无菌操作严格无菌操作uu剔除脂肪等附着组织剔除脂肪等附着组织剔除脂肪等附着组织剔除脂肪等附着组织uu组织块剪小（直径组织块剪小（直径组织块剪小（直径组织块剪小（直径1mm1mm1mm1mm）uu摆放开（间距摆放开（间距摆放开（间距摆放开（间距5mm5mm5mm5mm）常常 犯犯 的的 错错 误误 uu操作中不换器械操作中不换器械操作中不换器械操作中不换器械uu冲洗次数不够冲洗次数不够冲洗次数不够冲洗次数不够uu组织碎片太大
11、组织碎片太大组织碎片太大组织碎片太大uu组织块摆放太密组织块摆放太密组织块摆放太密组织块摆放太密uu培养液加入太多培养液加入太多培养液加入太多培养液加入太多消 化 培 养 法uu消化培养法所用的酶有多种，目前应用最广的是胰蛋白酶。消化培养法所用的酶有多种，目前应用最广的是胰蛋白酶。它是一种内切酶，可专一水解有精胺酸或赖氨酸的羧基形成它是一种内切酶，可专一水解有精胺酸或赖氨酸的羧基形成的肽键。从而消除妨碍细胞生长的细胞间质，包括基质、纤的肽键。从而消除妨碍细胞生长的细胞间质，包括基质、纤维等，使细胞分散，易于贴壁并从外界吸收养分和排除代谢维等，使细胞分散，易于贴壁并从外界吸收养分和排除代谢物物
12、uu消化法适用于组织量大的原代培养。胰蛋白酶液适用于消化消化法适用于组织量大的原代培养。胰蛋白酶液适用于消化间质少的组织，如羊膜、胚胎、上皮、肝和肾等组织及传代间质少的组织，如羊膜、胚胎、上皮、肝和肾等组织及传代细胞。细胞。5955切成1-2mm3小块20-60min培 养 要 点uu3636合适的胰蛋白酶浓度（通常为合适的胰蛋白酶浓度（通常为0.25%0.25%）uu合适的消化时间：消化时，待组织块变得较疏松，颜合适的消化时间：消化时，待组织块变得较疏松，颜色略白为止（通常为色略白为止（通常为3737，20-4020-40分钟）分钟）常 犯 的 错 误 水浴锅未预热组织块太大胰蛋白酶消化不足
13、或过度吹打用力过重常 犯 的 错 误 4.3 4.3 传代培养和细胞系的维持传代培养和细胞系的维持 传 代 细 胞 培 养 细胞在原培养瓶内分离稀释后传到新的培养瓶的操作细胞在原培养瓶内分离稀释后传到新的培养瓶的操作叫传代。为获得稳定的细胞株，或大量的同种细胞，当培叫传代。为获得稳定的细胞株，或大量的同种细胞，当培养细胞形成致密的单层后需进行传代培养。养细胞形成致密的单层后需进行传代培养。63首次传代注意事项uu细胞没有生长到足以覆盖瓶底壁的大部分表面以前（80%），不要急于传代。uu传代时不同的细胞有不同的消化时间，因而要根据需要注意观察及时处理。uu首次传代时细胞接种数量要多一些，使细胞能
14、尽快适应新环境而利于细胞生存和增殖。63细细 胞胞 传传 代代 方方 法法根据细胞生长的特点，传代方法有根据细胞生长的特点，传代方法有根据细胞生长的特点，传代方法有根据细胞生长的特点，传代方法有3 3 3 3种种种种uu悬浮生长细胞传代悬浮生长细胞传代悬浮生长细胞传代悬浮生长细胞传代uu离心法传代：离心（离心法传代：离心（离心法传代：离心（离心法传代：离心（1000100010001000转转转转/分分分分）去上清，沉淀物加新培养液后）去上清，沉淀物加新培养液后）去上清，沉淀物加新培养液后）去上清，沉淀物加新培养液后再混匀传代再混匀传代再混匀传代再混匀传代uu直接传代法：悬浮细胞沉淀在瓶壁时，
15、将上清培养液去除直接传代法：悬浮细胞沉淀在瓶壁时，将上清培养液去除直接传代法：悬浮细胞沉淀在瓶壁时，将上清培养液去除直接传代法：悬浮细胞沉淀在瓶壁时，将上清培养液去除l/2l/2l/2l/22/32/32/32/3，然后用吸管直接吹打形成细胞悬液再传代，然后用吸管直接吹打形成细胞悬液再传代，然后用吸管直接吹打形成细胞悬液再传代，然后用吸管直接吹打形成细胞悬液再传代uu半悬浮生长细胞传代半悬浮生长细胞传代半悬浮生长细胞传代半悬浮生长细胞传代uu此类细胞部分呈现贴壁生长现象，但贴壁不牢，可用直接吹打此类细胞部分呈现贴壁生长现象，但贴壁不牢，可用直接吹打此类细胞部分呈现贴壁生长现象，但贴壁不牢，可用
16、直接吹打此类细胞部分呈现贴壁生长现象，但贴壁不牢，可用直接吹打法使细胞从瓶壁脱落下来，进行传代法使细胞从瓶壁脱落下来，进行传代法使细胞从瓶壁脱落下来，进行传代法使细胞从瓶壁脱落下来，进行传代uu贴壁生长细胞传代贴壁生长细胞传代贴壁生长细胞传代贴壁生长细胞传代uu采用酶消化法传代。常用的消化液有采用酶消化法传代。常用的消化液有采用酶消化法传代。常用的消化液有采用酶消化法传代。常用的消化液有0.250.250.250.25的胰蛋白酶液的胰蛋白酶液的胰蛋白酶液的胰蛋白酶液64贴壁生长细胞传代方法贴壁生长细胞传代方法uu吸光培养瓶中的培养液吸光培养瓶中的培养液吸光培养瓶中的培养液吸光培养瓶中的培养液u
17、uPBSPBSPBSPBS洗一次洗一次洗一次洗一次uu加入加入加入加入1 1 1 12 ml 0.252 ml 0.252 ml 0.252 ml 0.25的胰蛋白酶液的胰蛋白酶液的胰蛋白酶液的胰蛋白酶液(以消化液能覆盖以消化液能覆盖以消化液能覆盖以消化液能覆盖整个瓶底为准）整个瓶底为准）整个瓶底为准）整个瓶底为准）uu静置静置静置静置2 2 2 210 min10 min10 min10 min（显微镜下动态监测）（显微镜下动态监测）（显微镜下动态监测）（显微镜下动态监测）uu吸去胰蛋白酶液，加入培养液吸去胰蛋白酶液，加入培养液吸去胰蛋白酶液，加入培养液吸去胰蛋白酶液，加入培养液uu用吸管吸
18、取瓶内培养液，反复吹打瓶壁细胞，形成用吸管吸取瓶内培养液，反复吹打瓶壁细胞，形成用吸管吸取瓶内培养液，反复吹打瓶壁细胞，形成用吸管吸取瓶内培养液，反复吹打瓶壁细胞，形成细胞悬液细胞悬液细胞悬液细胞悬液uu吸取吸取吸取吸取1/101/101/101/101/401/401/401/40细胞悬液，接种于新的培养瓶内细胞悬液，接种于新的培养瓶内细胞悬液，接种于新的培养瓶内细胞悬液，接种于新的培养瓶内uu加适量新鲜培养液于接种了细胞悬液的新培养瓶内加适量新鲜培养液于接种了细胞悬液的新培养瓶内加适量新鲜培养液于接种了细胞悬液的新培养瓶内加适量新鲜培养液于接种了细胞悬液的新培养瓶内uu将后者放入培养箱中培
19、养将后者放入培养箱中培养将后者放入培养箱中培养将后者放入培养箱中培养Trypsin消化细胞消化细胞未消化细胞未消化细胞细胞消化过程细胞消化过程培培 养养 要要 点点uu严格的无菌操作严格的无菌操作严格的无菌操作严格的无菌操作uu适度消化适度消化适度消化适度消化细胞培养中需要注意的问题细胞培养中需要注意的问题uu培培培培养养养养液液液液和和和和培培培培养养养养物物物物的的的的比比比比例例例例：一一一一定定定定浓浓浓浓度度度度的的的的培培培培养养养养液液液液仅仅仅仅能能能能支支支支持持持持一一一一定定定定数数数数量量量量的的的的细细细细胞胞胞胞生生生生长长长长，不不不不能能能能盲盲盲盲目目目目增增
20、增增加加加加每每每每单单单单位位位位体体体体积积积积的的的的细细细细胞浓度胞浓度胞浓度胞浓度uuPHPHPHPH：初培养：初培养：初培养：初培养pHpHpHpH应为应为应为应为7.47.47.47.4，培养过程应不低于，培养过程应不低于，培养过程应不低于，培养过程应不低于7.07.07.07.0uu培培培培养养养养瓶瓶瓶瓶内内内内的的的的空空空空间间间间：一一一一般般般般培培培培养养养养瓶瓶瓶瓶内内内内培培培培养养养养液液液液与与与与液液液液面面面面上上上上的的的的空空空空间体积之比为间体积之比为间体积之比为间体积之比为1:101:101:101:10细胞培养中需要注意的问题细胞培养中需要注意
21、的问题uu容容容容积积积积、深深深深度度度度、表表表表面面面面面面面面积积积积：培培培培养养养养液液液液体体体体积积积积与与与与表表表表面面面面面面面面积积积积的的的的比比比比例例例例为为为为0.20.20.20.20.5ml/cm0.5ml/cm0.5ml/cm0.5ml/cm2 2 2 2。需需需需高高高高浓浓浓浓度度度度氧氧氧氧的的的的，在在在在浅浅浅浅的的的的培培培培养养养养液液液液（2mm2mm2mm2mm）中中中中生生生生长长长长较较较较好好好好；需需需需要要要要低低低低浓浓浓浓度度度度氧氧氧氧的的的的,在在在在深深深深的的的的培养液（培养液（培养液（培养液（5mm5mm5mm5m
22、m）中生长较好。）中生长较好。）中生长较好。）中生长较好。uu去除死细胞去除死细胞去除死细胞去除死细胞uu温温温温度度度度控控控控制制制制：动动动动物物物物细细细细胞胞胞胞培培培培养养养养对对对对温温温温度度度度波波波波动动动动的的的的敏敏敏敏感感感感性性性性很很很很大大大大。温温温温度度度度低低低低于于于于36.536.536.536.5，细细细细胞胞胞胞生生生生长长长长缓缓缓缓慢慢慢慢；温温温温度度度度高高高高于于于于37.537.537.537.5，细胞存活力降低，细胞存活力降低，细胞存活力降低，细胞存活力降低细胞系的维持uu细胞系档案要记录好；uu细胞系的传代、换液一般都有自身的规律性
23、，在维持传代时要注意保持其稳定的规律性；uu多种细胞系维持传代，要严格操作程序，以防细胞之间交叉污染；uu每一种细胞系都应有充足的冻存储备。65培养细胞的纯化uu自然纯化uu人工纯化 酶消化法酶消化法机械刮除法机械刮除法反复贴壁法反复贴壁法克隆法克隆法培养基限定方法培养基限定方法流式细胞仪分离法流式细胞仪分离法 654.4 4.4 培养细胞生长状况的观察培养细胞生长状况的观察 培养细胞的常规观察培养细胞的常规观察 培养液培养液 细胞生长概况细胞生长概况 细胞形态变化细胞形态变化 微生物污染微生物污染68活细胞的观察 培养细胞相差显微镜观察 培养细胞的动态观察69细胞生长状况的观察l l细胞计数l l细胞生长曲线l l细胞分裂指数l l细胞贴壁率l l细胞周期71