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1、l l概念概念l l离子化过程离子化过程l l产生的分产生的分子子离子离子3.离子化技术快原子轰击法快原子轰击法(FAB,Fast Atom Bombardment)液体二次离子化法液体二次离子化法(LSI,Liquid Secondary Ionization）l l概念概念 快原子轰击电离法是，用高速原子（离子）快原子轰击电离法是，用高速原子（离子）枪射枪射 出的数出的数kV的高速中性原子（的高速中性原子（Ar,Xe or Cs+离子）束对溶解在底物中的样品溶液进行离子）束对溶解在底物中的样品溶液进行轰击，产生轰击，产生 M+H+or M+等离子的电离法。等离子的电离法。3.离子化技术快原
2、子轰击法快原子轰击法 FAB法的关键之一是选择适当的（基质）法的关键之一是选择适当的（基质）底物，底物，从而从而,可以进行从低极性到较高极性可以进行从低极性到较高极性的范围较广的有机化合物测定，是目前应的范围较广的有机化合物测定，是目前应用比较广的电离技术。用比较广的电离技术。3.离子化技术快原子轰击法快原子轰击法l 概概念念 当高速中性原子轰击底物溶液后，在发生当高速中性原子轰击底物溶液后，在发生爆发性爆发性汽化的同时，发生分子间冲突，离汽化的同时，发生分子间冲突，离子子分子反应，从而，产生（解离性）氢质分子反应，从而，产生（解离性）氢质子转移反应子转移反应11和和22式及式及33式，与（电
3、子轰式，与（电子轰击法相似）的轰击离子化反应击法相似）的轰击离子化反应44等等.3.离子化技术快原子轰击法快原子轰击法l l 离子化过程离子化过程 (M+B)+Afast M+H+B-H-+A 1 (M+B)+Afast M-H-+B+H+A 2 M+B+H+M+H+B 3 (M+B)+Afast M+B+A+e-4 M：样品分子：样品分子 B：底物分子：底物分子 Afast:高速原子（离子）高速原子（离子）3.离子化技术快原子轰击法快原子轰击法l l 离子化过程离子化过程 由上述四个主要反应可以看出，反应由上述四个主要反应可以看出，反应1、2、4亦是由于高轰击能量产生的，生成亦是由于高轰击能
4、量产生的，生成的离子具有高内部能量（甚至有些分子如的离子具有高内部能量（甚至有些分子如C60分子可能有分子可能有100ev），从而提供大量碎片信息。），从而提供大量碎片信息。则有人研究认为产生的谱与则有人研究认为产生的谱与EI相似，即相似，即EI-like，只有，只有3式是相似于式是相似于CI的的软电离软电离过过程，即产生的谱图为程，即产生的谱图为CI-like谱。因此，谱。因此，近近来有人认为来有人认为FAB法不属于法不属于软电离软电离技术。技术。3.离子化技术快原子轰击法快原子轰击法l l 离子化过程离子化过程3.离子化技术快原子轰击法快原子轰击法l l 离子化过程离子化过程 FAB法的离
5、子化原理比较复杂。目前认为，法的离子化原理比较复杂。目前认为，根据样品的性质，由溶液根据样品的性质，由溶液1、2、4支配的支配的过过 程和由气相程和由气相3支配的过程，二个不同过程发生支配的过程，二个不同过程发生 电离。能提供高弹性轰击率的电离。能提供高弹性轰击率的Xe，一般提供最，一般提供最 高离子收量。高离子收量。3.离子化技术快原子轰击法快原子轰击法l l 产生的分子离子产生的分子离子u一般常见的一般常见的M+H+u根据底物脱氢以及分解反应产生的根据底物脱氢以及分解反应产生的M-H+u容易提供电子的芳烃化合物产生容易提供电子的芳烃化合物产生M+u甾类化合物、氨基霉素等还产生甾类化合物、氨
6、基霉素等还产生M+NH4+u糖甙、聚醚等一般可（产生）观察到糖甙、聚醚等一般可（产生）观察到M+Na+。uu由底物与粒子轰击（碰撞）诱导发生还原由底物与粒子轰击（碰撞）诱导发生还原反应来产生反应来产生M+nH+(n 1),二聚体（双分子）二聚体（双分子）M+H+M+及及M+H+B+等等3.离子化技术快原子轰击法快原子轰击法l 产生的分子离子产生的分子离子因此，进行谱图解析时，要考虑底物和化合物因此，进行谱图解析时，要考虑底物和化合物的性质，盐类的混入等进行综合判断。的性质，盐类的混入等进行综合判断。l l 概述概述l l 概念概念l l 产生的离子产生的离子l l 离子化过程离子化过程l l
7、主要特点主要特点3.离子化技术电喷雾离子化法电喷雾离子化法（ESI，Electrospray Ionization）大气压电离技术（大气压电离技术（atmospheric pressure ionization,API）顾名思义是一种常压电离技）顾名思义是一种常压电离技术，由于它不需要真空，减少了许多设备，术，由于它不需要真空，减少了许多设备，使用方便。而且常压操作便于和其它分离技使用方便。而且常压操作便于和其它分离技术如液相色谱和毛细管电泳联用，因而在近术如液相色谱和毛细管电泳联用，因而在近年来得到了迅速的发展，大大扩展了质谱仪年来得到了迅速的发展，大大扩展了质谱仪分析化合物的范围，特别是在
8、化学、生物、分析化合物的范围，特别是在化学、生物、医学、药学、环境分析等领域获得了日益广医学、药学、环境分析等领域获得了日益广泛的应用，是当今质谱界最为活跃的领域。泛的应用，是当今质谱界最为活跃的领域。3.离子化技术电喷雾离子化法电喷雾离子化法l l概述概述 API技术包括电喷雾（技术包括电喷雾（ESI）和大气压化学电）和大气压化学电离（离（atmospheric pressure chemical ionization,APCI）两种离子化技术。）两种离子化技术。本节重点介绍本节重点介绍ESI技术技术3.离子化技术电喷雾离子化法电喷雾离子化法l l 概述概述ESIESI是一种是一种软软电离技
9、术，电喷雾原理的最早电离技术，电喷雾原理的最早发现可以追溯到发现可以追溯到19171917年，而应用在质谱上是年，而应用在质谱上是19841984年以后，年以后，8080年代末开始逐渐被广泛重视。年代末开始逐渐被广泛重视。ESIESI技技术不仅在上述几大领域发挥着极大作用，在常规术不仅在上述几大领域发挥着极大作用，在常规化学、合成及天然药物分析方面也得到了广泛的化学、合成及天然药物分析方面也得到了广泛的作用，尤其是解决了液相色谱与质谱离子源的接作用，尤其是解决了液相色谱与质谱离子源的接口问题，从而口问题，从而真正真正实现了实现了LC-MSLC-MS或或LC-MS/MSLC-MS/MS的联用技术
10、。的联用技术。3.离子化技术电喷雾离子化法电喷雾离子化法l l概述概述l l 概念概念 ESI是在液滴通过逐渐是在液滴通过逐渐蒸发蒸发产生离子发射产生离子发射的过的过 程中形成的，这种过程也称为程中形成的，这种过程也称为“离子蒸发离子蒸发”。当。当 样品溶液由泵输送从毛细管流出的瞬间，样品溶液由泵输送从毛细管流出的瞬间，在雾在雾 化气（化气（N2）、强电场（）、强电场（25kV）和近于）和近于大气压的干燥气体（大气压的干燥气体（N2）的作用下，溶剂在毛）的作用下，溶剂在毛细管端口发生喷雾，产生高电荷的液体微粒（细管端口发生喷雾，产生高电荷的液体微粒（液液 滴），所以称之为滴），所以称之为电喷雾
11、电喷雾。3.离子化技术电喷雾离子化法电喷雾离子化法l l 概念概念 随着液滴中溶剂的挥发液滴逐渐缩小，当电荷随着液滴中溶剂的挥发液滴逐渐缩小，当电荷间的斥力克服了液滴的内聚力时，发生间的斥力克服了液滴的内聚力时，发生“库仑库仑爆炸爆炸”（Coulomic explosion）。较小的液滴）。较小的液滴继续蒸发，电场增强，离子向表面移动，表面继续蒸发，电场增强，离子向表面移动，表面的离子密度越来越大，最终导致离子从表面蒸的离子密度越来越大，最终导致离子从表面蒸发，产生单电荷或多电荷离子发，产生单电荷或多电荷离子。3.离子化技术电喷雾离子化法电喷雾离子化法l l 产生的离子产生的离子uu当用正电场
12、时，在当用正电场时，在ESI温和的条件下样品分子温和的条件下样品分子通常带上质子、碱金属离子或铵离子生成正离通常带上质子、碱金属离子或铵离子生成正离子的加合离子。子的加合离子。uu当用负喷雾电场时，通过除去质子或其它阳离当用负喷雾电场时，通过除去质子或其它阳离子而生成负离子。子而生成负离子。uu所带电荷的多少取决于所得的带正电荷或负电所带电荷的多少取决于所得的带正电荷或负电荷的分子中酸性或碱性基团的体积和数量。荷的分子中酸性或碱性基团的体积和数量。uu通常小分子得到通常小分子得到M+H+或或M-H-单电荷离子。单电荷离子。而生物大分子产生而生物大分子产生z1的多电荷离子。的多电荷离子。3.离子
13、化技术电喷雾离子化法电喷雾离子化法 由于质谱仪测量的是质量电荷比（质荷比由于质谱仪测量的是质量电荷比（质荷比m/z），因此质量范围只有几千质量数的质），因此质量范围只有几千质量数的质谱仪，利用谱仪，利用ESI法能够检测质量数十几万的法能够检测质量数十几万的生物大分子。生物大分子。3.离子化技术电喷雾离子化法电喷雾离子化法 （1）在溶液中形成正负离子对）在溶液中形成正负离子对 溶液中溶液中m个溶剂分子（个溶剂分子（B）与样品分子（）与样品分子（M）在）在溶溶 剂和剂和作用下，通过相对质子接受能力大小，以及作用下，通过相对质子接受能力大小，以及 对应于对应于 M的的n个碱性部位或者酸性部位，可形成
14、个碱性部位或者酸性部位，可形成 以下正负离子对：以下正负离子对：mB+M (m-n)B +n(B-H)-/(M+nH)n+(1)mB+M (m-n)B +n(B+H)+/(M-nH)n-(2)内表示离子对，内表示离子对，（1）式表示溶剂为酸性、式表示溶剂为酸性、（2）式溶剂为碱性作用。式溶剂为碱性作用。3.离子化技术电喷雾离子化法电喷雾离子化法l l 离子化过程离子化过程（2）溶液在毛细管端口高电场作用下正负离子对分）溶液在毛细管端口高电场作用下正负离子对分离离 溶液由泵输送从毛细管流出的瞬间，在端口溶液由泵输送从毛细管流出的瞬间，在端口高电场高电场（25kV）作用下发生电荷分离，从而在溶液中
15、成）作用下发生电荷分离，从而在溶液中成正离子富有部分和负离子富有部分正离子富有部分和负离子富有部分:n(B-H)-/(M+nH)n+n(B-H)-/(M+nH)n+(3)n(B+H)+/(M-nH)n-n(B+H)+/(M-nH)n-(4)/表示正负离子在溶液中被分离表示正负离子在溶液中被分离。3.离子化技术电喷雾离子化法电喷雾离子化法l l 离子化过程离子化过程 这时通过对抗电极的库仑引力作用，溶液从毛细这时通过对抗电极的库仑引力作用，溶液从毛细管端口被引出，在同轴方向的管端口被引出，在同轴方向的气压流气压流作用下发生作用下发生雾化。如果施加正电场时，可以发生以下的雾化雾化。如果施加正电场时
16、，可以发生以下的雾化 n(B-H)-/(M+nH)n+/(M+nH)n+/(5)n(B+H)+/(M-nH)n-/n(B+H)+/(6)/()+/表示富有正离子的微小液滴表示富有正离子的微小液滴。3.离子化技术电喷雾离子化法电喷雾离子化法l l 离子化过程离子化过程 随后，如上所述，在具有一定温度的随后，如上所述，在具有一定温度的气氛气氛环境下从液滴表面溶剂逐渐蒸发，最终产生环境下从液滴表面溶剂逐渐蒸发，最终产生单电荷或多电荷离子。总之，单电荷或多电荷离子。总之，ESI的原理可以的原理可以概括为在高电场作用下溶液中的正负离子分离概括为在高电场作用下溶液中的正负离子分离和通过喷雾自发性的离子和通
17、过喷雾自发性的离子蒸发蒸发过程。过程。3.离子化技术电喷雾离子化法电喷雾离子化法l l 离子化过程离子化过程uu它是最软的电离技术，通常只产生分子离子它是最软的电离技术，通常只产生分子离子 峰，峰，因此可以测定不稳定的极性化合物，并可因此可以测定不稳定的极性化合物，并可直接测定混合物。直接测定混合物。uu多电荷离子的形成，可以分析大分子，如蛋白多电荷离子的形成，可以分析大分子，如蛋白质和寡核苷酸等。质和寡核苷酸等。uu通过调节离子源参数（改变取样锥体电压），通过调节离子源参数（改变取样锥体电压），可以控制离子在离子源内的断裂，从而给出结可以控制离子在离子源内的断裂，从而给出结构信息（源内构信息
18、（源内CID）。）。3.离子化技术电喷雾离子化法电喷雾离子化法l l 主要特点主要特点l l 概述概述l l 概念概念l l 影响因素影响因素l l 离子化过程离子化过程l l 产生的离子种类产生的离子种类l l 适用范围适用范围3.离子化技术基质辅助激光解吸离子化法基质辅助激光解吸离子化法MALDIMALDI（Matrix-Assisted Laser Desorption IonizationMatrix-Assisted Laser Desorption Ionization）虽然，激光解吸（虽然，激光解吸（laser desorption,LD）质）质 谱法（谱法（1963年）早已用于
19、难挥发、热不稳年）早已用于难挥发、热不稳 定化合物的分析，但是，定化合物的分析，但是，LD法至到采用基法至到采用基 质辅助之后，才开始被广泛重视。质辅助之后，才开始被广泛重视。MALDI法是法是1987年以后被正式确立的一种年以后被正式确立的一种 新型软电离技术。新型软电离技术。目前，目前，MALDI-TofMS已经广泛地应用于多已经广泛地应用于多 肽及蛋白质等大分子的分析肽及蛋白质等大分子的分析。3.离子化技术基质辅助激光解吸离子化法基质辅助激光解吸离子化法l l 概述概述 MALDI技术是将大分子样品溶于适宜的溶剂技术是将大分子样品溶于适宜的溶剂中，与大量的基质相混合，其目的是限制激光中，
20、与大量的基质相混合，其目的是限制激光直接照射样品，以防止样品被破坏。基质（小直接照射样品，以防止样品被破坏。基质（小分子有机物）必须是强烈吸收入射激光辐射的分子有机物）必须是强烈吸收入射激光辐射的分子，基质分子吸收辐射后，吸收的能量在基分子，基质分子吸收辐射后，吸收的能量在基质中诱发冲击波，从而释放出完整的大分子的质中诱发冲击波，从而释放出完整的大分子的气相分子离子。气相分子离子。MALDI中离子的形成，通常中离子的形成，通常认为包括质子化、碱金属离子的加合和光离子认为包括质子化、碱金属离子的加合和光离子化等化等。3.离子化技术基质辅助激光解吸离子化法基质辅助激光解吸离子化法l l 概念概念在
21、在MALDI法中，影响离子化过程以及法中，影响离子化过程以及 质谱结质谱结果的主要有三大因素：果的主要有三大因素：uu基质基质 uu激光能量激光能量uu样品制备样品制备3.离子化技术基质辅助激光解吸离子化法基质辅助激光解吸离子化法l l 影响因素影响因素 基质的选择主要取决于所采用的激光波长基质的选择主要取决于所采用的激光波长（能量）以及被分析样品的性质。其主要作（能量）以及被分析样品的性质。其主要作用是作为把能量从激光束传递给样品的中间用是作为把能量从激光束传递给样品的中间体，并通过大量过量的基质使样品得以有效体，并通过大量过量的基质使样品得以有效分散，在防止样品被破坏的同时，可减少被分散，
22、在防止样品被破坏的同时，可减少被分析样品分子之间的相互作用。一般，常用分析样品分子之间的相互作用。一般，常用有机酸以及甘油等。有机酸以及甘油等。3.离子化技术基质辅助激光解吸离子化法基质辅助激光解吸离子化法l l 影响因素影响因素uu 基质基质 例如，作为蛋白质等大分子的基质所需要的例如，作为蛋白质等大分子的基质所需要的选择基准是（用基质分子选择基准是（用基质分子B的离子种类强度比的离子种类强度比值）：以值）：以B+/(B+H)+1为为不适。不适。3.离子化技术基质辅助激光解吸离子化法基质辅助激光解吸离子化法l l 影响因素影响因素uu 基质基质 uu激光能量激光能量 选择适当波长的激光很重要
23、，它是决定离子选择适当波长的激光很重要，它是决定离子化与样品被分解界限的重要制约因素。化与样品被分解界限的重要制约因素。MALDI使用脉冲激光，其脉冲宽度为使用脉冲激光，其脉冲宽度为1 200nm。常用的有氮激光器（。常用的有氮激光器（337nm）；）；Nd-YAG激光器（激光器（355nm,266nm）等。）等。3.离子化技术基质辅助激光解吸离子化法基质辅助激光解吸离子化法l l 影响因素影响因素 高灵敏度是高灵敏度是MALDI法的一个显著优点，一般法的一个显著优点，一般所需要的样品量为所需要的样品量为1 pmol甚至更少。但是，甚至更少。但是，关键是需要将样品分子溶入周围的基质分子关键是需
24、要将样品分子溶入周围的基质分子群中，必须制备成均匀的固溶体。群中，必须制备成均匀的固溶体。3.离子化技术基质辅助激光解吸离子化法基质辅助激光解吸离子化法l l 影响因素影响因素uu 样品制备样品制备 其次是浓度问题。如果浓度过高，则必须进行其次是浓度问题。如果浓度过高，则必须进行更广结晶范围的激发，从而使为引起爆发汽化更广结晶范围的激发，从而使为引起爆发汽化的临界值激光能量变高，并且基质对样品的隔的临界值激光能量变高，并且基质对样品的隔离作用会受到影响，导致信号强度下降。反之，离作用会受到影响，导致信号强度下降。反之，如果浓度过稀，为了将形成的基质结晶破坏，如果浓度过稀，为了将形成的基质结晶破
25、坏，则仍需要提高临界值。因此，为了避免样品分则仍需要提高临界值。因此，为了避免样品分子的破坏，则需要制备出能在最小临界值下引子的破坏，则需要制备出能在最小临界值下引起爆发汽化的样品浓度。起爆发汽化的样品浓度。3.离子化技术基质辅助激光解吸离子化法基质辅助激光解吸离子化法l l 影响因素影响因素uu 样品制备样品制备 根据所选择的基质，基质与样品的根据所选择的基质，基质与样品的mol比值比值为，基质：样品为，基质：样品=1000：1 10000：1 。另外，理想的质谱结果还依存于体系的另外，理想的质谱结果还依存于体系的PH 值及组成、以及所用的强制干燥或自然干值及组成、以及所用的强制干燥或自然干
26、 燥的结晶化过程等燥的结晶化过程等3.离子化技术基质辅助激光解吸离子化法基质辅助激光解吸离子化法l l 影响因素影响因素uu 样品制备样品制备uu被被n个基质分子（个基质分子（B）包围着的样品分子）包围着的样品分子（M）通过）通过m个光子个光子hv的脉冲激光照射后，形的脉冲激光照射后，形成成(nB+M)*激发集团被爆发，并移至结晶表面激发集团被爆发，并移至结晶表面附近附近（1）。uu同时，激光照射部位会发生断热性温度跳跃至同时，激光照射部位会发生断热性温度跳跃至1500K，使基质分子间形成的氢键迅速变弱，使基质分子间形成的氢键迅速变弱，则接着发生质子转移反应则接着发生质子转移反应（2）。nBn
27、B+M+m +M+m hvhv (nB+MnB+M)*(1)*(1)(nB+M)*(M+H)(nB+M)*(M+H)+(B-H)+(B-H)-+(n-1)B (2)+(n-1)B (2)3.离子化技术基质辅助激光解吸离子化法基质辅助激光解吸离子化法l l 离子化过程离子化过程uu(M+H)+或或(M-H)-（类似于（类似于FAB法中由质子转法中由质子转移反应移反应 得到的离子）得到的离子）uu(M+Na)+，正负多电荷离子，正负多电荷离子(M+nH)n+或或(M-nH)n-（由基质效应等因素产生）（由基质效应等因素产生）uu正负簇合物离子的正负簇合物离子的(nM+H)n+或或(nM-H)n-（
28、在（在结晶中容易形成）结晶中容易形成）uuM+（与与B+通过电荷交换反应得到的离子）通过电荷交换反应得到的离子）3.离子化技术基质辅助激光解吸离子化法基质辅助激光解吸离子化法l l 产生的离子种类产生的离子种类 MALDI-TofMS主要用于蛋白质等生物大分子的主要用于蛋白质等生物大分子的测定，分子量可达数十万至百万质量数，并可测定，分子量可达数十万至百万质量数，并可分析混合物。分析混合物。MALDI法的另外一个特点是对样法的另外一个特点是对样品的要求很低，可以允许样品中含有相对高浓品的要求很低，可以允许样品中含有相对高浓度（几百毫摩尔）的缓冲剂、盐及变性剂等非度（几百毫摩尔）的缓冲剂、盐及变性剂等非挥发性成分。因此，它特别适合于生物样品的挥发性成分。因此，它特别适合于生物样品的分析，避免了质谱分析前样品的复杂纯化过程。分析，避免了质谱分析前样品的复杂纯化过程。当然含有破坏样品结晶过程的成分（杂质）是当然含有破坏样品结晶过程的成分（杂质）是很不利的。很不利的。3.离子化技术基质辅助激光解吸离子化法基质辅助激光解吸离子化法l l 适用范围适用范围