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1、紫外紫外-可见分光光度法可见分光光度法 紫外紫外-可见吸收光谱可见吸收光谱朗伯朗伯-比耳定律比耳定律紫外紫外-可见分光光度计可见分光光度计分析条件的选择分析条件的选择测定方法测定方法应用应用紫外紫外-可见分光光度法可见分光光度法(ultraviolet-visible spectrophotometry,UV-VIS)n 它是利用物质的分子或离子对200-800nm光谱区内辐射能的吸收，对物质进行定性分析定性分析、定量分析定量分析及结构分析的方法。结构分析的方法。所依据的光谱是分子或离子吸收入射光中特定波长的光而产生的吸收光谱。n精密称取B12样品25.0mg，用水溶液配成100ml。精密吸取
2、10.00ml，又置100ml容量瓶中，加水至刻度。取此溶液在1cm的吸收池中，于361nm处测定吸光度为0.507，求B12的百分含量？1.紫外紫外-可见吸收光谱可见吸收光谱 一、物质对光的选择性吸收 光与物质作用时，物质可对光产生不同程度的吸收，物质的结构决定了物质在吸收光时只能吸收某些特定波长的光，即 物质对光光的吸收是选择性选择性的，利用被测物质对某波长的光的吸收来了解物质的特性，这就是光谱法的基础光谱法的基础。400-450nm紫蓝450-480nm绿蓝480-490nm蓝绿490-500nm绿500-560nm580-600nm黄600-650nm橙650-780nm 红白KMnO
3、4 max=525nm1分子吸收光谱的产生由能级间的跃迁引起能级：电子能级、振动能级、转动能级跃迁：电子受激发，从低能级转移到高能级的过程若用一连续的电磁辐射照射样品分子，将照射前后的若用一连续的电磁辐射照射样品分子，将照射前后的光强度变化转变为电信号并记录下来，就可得到光强光强度变化转变为电信号并记录下来，就可得到光强度变化对波长的关系曲线，即为分子吸收光谱度变化对波长的关系曲线，即为分子吸收光谱续前续前2分子吸收光谱的分类：分子内运动涉及三种跃迁能级，所需能量大小顺序 3紫外-可见吸收光谱的产生 由于分子吸收紫外-可见光区的电磁辐射，分子中 价电子（或外层电子）的能级跃迁而产生 （吸收能量
4、=两个跃迁能级之差）图示吸收曲线或吸收光谱吸收曲线或吸收光谱通过测定被测物质对不同波长的光的吸收强度（吸光度），以波长为横坐标，吸光度为纵坐标作图，得出该物质在测定波长范围的吸收曲线或吸收光谱，它是吸收曲线或吸收光谱，它是进行分子进行分子结构分析的依据结构分析的依据。同一物质，当浓度相同时，吸收曲线是重叠同一物质，当浓度相同时，吸收曲线是重叠的。同一物质，不同浓度时，吸收曲线的形的。同一物质，不同浓度时，吸收曲线的形状不变，最大吸收峰位置不变，仅是峰高改状不变，最大吸收峰位置不变，仅是峰高改变。变。在吸收曲线中，通常选用在吸收曲线中，通常选用最大吸收波长最大吸收波长max进行物质含量的测定。进
5、行物质含量的测定。二、有机化合物的紫外-可见吸收光谱 与紫外与紫外-可见吸收光谱有关的电子有三种，即形成可见吸收光谱有关的电子有三种，即形成单键的单键的 电子、形成双键的电子、形成双键的 电子以及未参与成键的电子以及未参与成键的n n电电子。子。跃迁类型有：跃迁类型有：*、n n *、*、n n *四种。四种。1 1、有机化合物的电子跃迁有机化合物的电子跃迁 电子跃迁类型：电子跃迁类型：电子跃迁类型：电子跃迁类型：1.*跃迁：跃迁：饱和烃饱和烃（甲烷，乙烷）（甲烷，乙烷）E很高，很高，n *n*1，*跃迁跃迁 它需要的能量较高，一般发生在它需要的能量较高，一般发生在真空紫外光真空紫外光区。区。
6、饱和烃中的饱和烃中的cc键属于这类跃迁，例如乙烷的最大吸收波键属于这类跃迁，例如乙烷的最大吸收波长长 max为为135nm。2，n*跃迁跃迁 实现这类跃迁所需要的能量较高，其吸收光谱落实现这类跃迁所需要的能量较高，其吸收光谱落于远紫外光区和近紫外光区，如于远紫外光区和近紫外光区，如CH3OH和和CH3NH2的的n*跃迁跃迁光谱分别为光谱分别为183nm和和213nm。3，*跃迁跃迁 它需要的能量低于它需要的能量低于*跃迁，吸收峰一般处于近跃迁，吸收峰一般处于近紫外光区，在紫外光区，在200 nm左右，其特征是摩尔吸光系数大，一般左右，其特征是摩尔吸光系数大，一般 max 104，为强吸收带。如
7、乙烯（蒸气）的最大吸收波长，为强吸收带。如乙烯（蒸气）的最大吸收波长 max为为162 nm。max=104 共轭键愈长所需能量愈小共轭键愈长所需能量愈小.4，n*跃迁跃迁 这类跃迁发生在近紫外光区。它是简单的生色这类跃迁发生在近紫外光区。它是简单的生色团如羰基、硝基等中的孤对电子向反键轨道跃迁。其特点是谱团如羰基、硝基等中的孤对电子向反键轨道跃迁。其特点是谱带强度弱，摩尔吸光系数小，通常小于带强度弱，摩尔吸光系数小，通常小于100.共轭键愈长所需能量愈小共轭键愈长所需能量愈小常用术语常用术语生色团生色团：是指分子结构中含有是指分子结构中含有n*，*跃迁的跃迁的基团，即能在紫外可见区产生吸收的
8、原子团。基团，即能在紫外可见区产生吸收的原子团。助色团助色团：是指含有非键电子的杂原子饱合基团，如是指含有非键电子的杂原子饱合基团，如-OH、-OR、-NHR、-SH、-Cl、-Br、-I等，它们本身等，它们本身不能吸收大于不能吸收大于200nm的光，但是当它们与生色团相连的光，但是当它们与生色团相连时，会使生色团的吸收峰向长波方向移动，并且增加时，会使生色团的吸收峰向长波方向移动，并且增加其吸收强度。其吸收强度。某些常见生色团的吸收光谱红移和紫移红移和紫移 在有机化合物中，常常因取代基的变更或溶剂的改变，使其吸收带的最大吸收波长max发生移动。向长波方向移动称为红移，向短波方向移动称为紫移或
9、蓝移。2、有机化合物的吸收带吸收带吸收带(absorption band):absorption band):在紫外光谱中，吸收峰在光在紫外光谱中，吸收峰在光谱中的波带位置。根据电子及分子轨道的种类，可将吸谱中的波带位置。根据电子及分子轨道的种类，可将吸收带分为四种类型。收带分为四种类型。(1)R R吸收带吸收带 n*跃迁产生跃迁产生(2)K K吸收带吸收带 *跃迁产生跃迁产生(3)B B吸收带吸收带 芳香族化合物的主要特征吸收带芳香族化合物的主要特征吸收带(4)E E吸收带吸收带 苯环环形共轭系统的苯环环形共轭系统的*跃迁产生跃迁产生 1R带：带：由含杂原子的不饱和基团的由含杂原子的不饱和基
10、团的n*跃迁产生跃迁产生CO；CN；NN E小，小，max250400nm，max200nm，max104共轭体系增长，共轭体系增长，max红移，红移，max溶剂极性溶剂极性，对于，对于(CHCH)n max不变不变 对于对于CHCCO max红移红移续前3B带：带：由由*跃迁产生跃迁产生芳香族化合物的主要特征吸收带芳香族化合物的主要特征吸收带 max=254nm，宽带，具有精细结构；，宽带，具有精细结构；max=200极性溶剂中，或苯环连有取代基，其精细结构消失极性溶剂中，或苯环连有取代基，其精细结构消失4E带：带：由苯环环形共轭系统的由苯环环形共轭系统的*跃迁产生跃迁产生芳香族化合物的特征
11、吸收带芳香族化合物的特征吸收带 E1 180nm max104（常观察不到）（常观察不到）E2 200nm max=7000 强吸收强吸收苯环有发色团取代且与苯环共轭时，苯环有发色团取代且与苯环共轭时，E2带与带与K带合并带合并 一起红移（长移）一起红移（长移）图示图示3、影响紫外影响紫外-可见吸收光谱的因素可见吸收光谱的因素 物质的吸收光谱与测定条件有密切的关系。测定物质的吸收光谱与测定条件有密切的关系。测定条件（温度、溶剂极性、条件（温度、溶剂极性、pH等）不同，吸收光谱的形等）不同，吸收光谱的形状、吸收峰的位置、吸收强度等都可能发生变化。状、吸收峰的位置、吸收强度等都可能发生变化。（1）
12、温度）温度 在室温范围内，温度对吸收光谱的影响不大。在室温范围内，温度对吸收光谱的影响不大。续前（2）溶剂溶剂 溶剂的极性影响吸收峰的位置、光谱形状、吸收强度溶剂的极性影响吸收峰的位置、光谱形状、吸收强度u对对max影响：影响：n-*跃迁：溶剂极性跃迁：溶剂极性，max蓝移蓝移 -*跃迁：溶剂极性跃迁：溶剂极性，max红移红移对吸收光谱精细结构影响对吸收光谱精细结构影响 溶剂极性溶剂极性，苯环精细结构消失，苯环精细结构消失溶剂的选择溶剂的选择极性；纯度高；截止波长极性；纯度高；截止波长 主主成成分分吸吸收收与与纯纯品品比比较较，EE，光光谱谱变变形形续前2杂质限量的测定：例：肾上腺素中微量杂质
13、肾上腺酮含量计算 2mg/mL-0.05mol/L的HCL溶液，310nm下测定(规定 A3100.05 即符合要求的杂质限量0.06%)（3）结构分析）结构分析紫外紫外-可见吸收光谱一般不用于化合物的可见吸收光谱一般不用于化合物的结构分析，但利用紫外吸收光谱鉴定化合物中结构分析，但利用紫外吸收光谱鉴定化合物中的共轭结构和芳环结构还是有一定价值。的共轭结构和芳环结构还是有一定价值。例如，某化合物在近紫外区内无吸收，说明该例如，某化合物在近紫外区内无吸收，说明该物质无共轭结构和芳香结构物质无共轭结构和芳香结构。第二节第二节 基本原理基本原理一、Lamber-Beer定律 二、吸光系数和吸收光谱
14、三、偏离Beer定律的因素四、透光率的测量误差 朗伯朗伯-比尔定律比尔定律 设入射光强度为设入射光强度为I0，吸收光强度为吸收光强度为Ia,透射透射光强度为光强度为It，反射光强度为反射光强度为Ir，则则I0=Ia+It+Ir由于反射光强度基本相同，其影响可相互抵消，由于反射光强度基本相同，其影响可相互抵消，上式可简化为：上式可简化为：I0=Ia+It一、吸光度和透光度一、吸光度和透光度吸光度吸光度:absorbance 为透光度倒数的对数，用为透光度倒数的对数，用A表示：表示：即即 A=lg1/T=lgI0/ItA值越大，表明物质对光的吸收越大。值越大，表明物质对光的吸收越大。透光度：透光度
15、：transmittance为透过光的强度为透过光的强度It与入射光强与入射光强度度I0之比，用之比，用T表示：表示：即即T=It/I0T值越大，表示物质对光吸收的越小。值越大，表示物质对光吸收的越小。二、朗伯二、朗伯-比尔定律比尔定律朗伯朗伯-比尔定律：当一束平行单色光通过含有吸光物质比尔定律：当一束平行单色光通过含有吸光物质的稀溶液时，溶液的吸光度与吸光物质浓度、液层厚的稀溶液时，溶液的吸光度与吸光物质浓度、液层厚度乘积成正比，即度乘积成正比，即 A=cl 式中比例常数式中比例常数为为吸光系数，与吸光物质的本性，吸光系数，与吸光物质的本性，入射光波长、溶剂及温度等因素有关。入射光波长、溶剂
16、及温度等因素有关。c为吸光物质为吸光物质浓度，浓度，l为透光液层厚度。为透光液层厚度。朗伯朗伯-比尔定律表明了物质对单色光吸收的强比尔定律表明了物质对单色光吸收的强弱与吸光物质的浓度和液层厚度的关系，是吸收光弱与吸光物质的浓度和液层厚度的关系，是吸收光度法的理论基础。度法的理论基础。朗伯朗伯-比尔定律适用于比尔定律适用于单色光、稀溶液。单色光、稀溶液。三、吸光系数三三.吸光系数吸光系数在指定条件下在指定条件下是物质的特征常数，可作为定是物质的特征常数，可作为定性、定量的依据。由于浓度单位不同它有两种性、定量的依据。由于浓度单位不同它有两种表示方法。表示方法。当l以cm，c以mol/L为单位，称
17、为摩尔摩尔吸光系数吸光系数，用 表示。的单位为的单位为L/mol.cm，它它表示物质的浓度为表示物质的浓度为1mol/L，液层厚度为液层厚度为1cm时，溶液的吸光度时，溶液的吸光度。1、摩尔吸光系数、摩尔吸光系数2、比吸光系数、比吸光系数当当l以以cm，c以以g/100mL为单位，为单位，称为比吸光系称为比吸光系数。数。比吸光系数是指吸光物质的百分浓度为比吸光系数是指吸光物质的百分浓度为1%，l为为1cm时的吸光度值，用时的吸光度值，用表示。表示。它们之间的关系为：它们之间的关系为：三、偏离三、偏离Beer定律的因素定律的因素n依据Beer定律，A与C关系应为 经过原点的直线n偏离Beer定律
18、的主要因素表现为 以下两个方面（一）光学因素（一）光学因素（二）化学因素（二）化学因素（一）光学因素（一）光学因素 1非单色光的影响：非单色光的影响：Beer定律应用的重要前提定律应用的重要前提入射光为单色光入射光为单色光 续前续前讨论：讨论：入射光的谱带宽度严重影响吸光系数和吸收光谱形状 结论：结论：选择较纯单色光（，单色性）选max作为测定波长（E，S且成线性）续前2杂散光的影响：杂散光的影响：杂散光是指从单色器分出的光不在入射光谱带宽度 范围内，与所选波长相距较远杂散光来源：仪器本身缺陷；光学元件污染造成杂散光可使吸收光谱变形，吸光度变值3反射光和散色光的影响：反射光和散色光的影响：反射
19、光和散色光均是入射光谱带宽度内的光 直接对T产生影响散射和反射使T，A，吸收光谱变形注：一般可用空白对比校正消除4非平行光的影响：非平行光的影响：使光程，A，吸收光谱变形（二）化学因素（二）化学因素nBeer定律适用的另一个前提：稀溶液定律适用的另一个前提：稀溶液n浓度过高会使浓度过高会使C与与A关系偏离定律关系偏离定律四、透光率的测量误差四、透光率的测量误差T要使测定的相对误差c/c最小最小，求导取极小值，得出：lgT=-0.4343=A即当A=0.4343时，吸光度测量误差最小时，吸光度测量误差最小影响测定结果的相对误差两个因素：T和T T影响因素：仪器噪音 1）暗噪音 2）讯号噪音续前1
20、）暗噪音）暗噪音与检测器和放大电路不确切性有关与检测器和放大电路不确切性有关 与光讯号无关与光讯号无关2）讯号噪音）讯号噪音与光讯号有关与光讯号有关第四节第四节 紫外分光光度计紫外分光光度计 1光源：光源：2单色器：单色器：包括狭缝、准直镜、色散元件包括狭缝、准直镜、色散元件棱镜棱镜对不同波长的光折射率不同对不同波长的光折射率不同色散元件色散元件分出光波长不等距分出光波长不等距光栅光栅衍射和干涉衍射和干涉分出光波长等距分出光波长等距钨灯或卤钨灯钨灯或卤钨灯可见光源可见光源3501000nm氢灯或氘灯氢灯或氘灯紫外光源紫外光源200360nm续前3吸收池：吸收池：玻璃玻璃能吸收能吸收UV光，仅适
21、用于可见光区光，仅适用于可见光区 石英石英不能吸收紫外光，适用于紫外和可见光区不能吸收紫外光，适用于紫外和可见光区 要求：匹配性（对光的吸收和反射应一致）要求：匹配性（对光的吸收和反射应一致）4检测器：检测器：将光信号转变为电信号的装置将光信号转变为电信号的装置5记录装置：讯号处理和显示系统记录装置：讯号处理和显示系统光电池光电池光电管光电管光电倍增管光电倍增管二极管阵列检测器二极管阵列检测器类型：类型：1单光束分光光度计：单光束分光光度计：特点：使用时来回拉动吸收池 移动误差比色池配对续前2双光束分光光度计：双光束分光光度计：特点：不用拉动吸收池，可以减小移动误差可以自动扫描吸收光谱 续前3
22、双波长分光光度计双波长分光光度计 特点：利用吸光度差值定量消除干扰和吸收池不匹配引起的误差4分析条件的选择分析条件的选择 一、一、仪器测量条件的选择仪器测量条件的选择 1.适宜的吸光度范围适宜的吸光度范围 最适宜的测量范围为最适宜的测量范围为0.20.7之间之间。通常是根据被测组分的吸收光谱，在避开干通常是根据被测组分的吸收光谱，在避开干扰情况下，选择最强吸收带的扰情况下，选择最强吸收带的最大吸收波长最大吸收波长为入射为入射波长。此波长处测定波长。此波长处测定灵敏度最高，线性关系最好。灵敏度最高，线性关系最好。当最强吸收峰的峰形比较尖锐时，往往选用吸收稍当最强吸收峰的峰形比较尖锐时，往往选用吸
23、收稍低，峰形稍平坦的次强峰或肩峰进行测定。低，峰形稍平坦的次强峰或肩峰进行测定。2.入射光波长的选择入射光波长的选择3狭缝宽度的选择狭缝宽度的选择为了选择合适的狭缝宽度，应以减少狭缝宽度时为了选择合适的狭缝宽度，应以减少狭缝宽度时试样的吸光度不再增加为准。一般来说，狭缝宽度大试样的吸光度不再增加为准。一般来说，狭缝宽度大约是试样吸收峰半宽度的十分之一。约是试样吸收峰半宽度的十分之一。对多种物质进行测定，常利用显色反应将被测组分对多种物质进行测定，常利用显色反应将被测组分转变为在一定波长范围有吸收的物质。常见的显色反应转变为在一定波长范围有吸收的物质。常见的显色反应有配位反应、氧化还原反应等。有
24、配位反应、氧化还原反应等。二、显色反应条件的选择二、显色反应条件的选择这些显色反应，必须满足以下条件这些显色反应，必须满足以下条件：1反应的生成物必须在紫外反应的生成物必须在紫外-可见光区有较强的吸光可见光区有较强的吸光能力，即摩尔吸光系数较大；能力，即摩尔吸光系数较大；2反应有较高的选择性，即被测组分生成的化合物吸反应有较高的选择性，即被测组分生成的化合物吸收曲线应与共存物质的吸收光谱有明显的差别；收曲线应与共存物质的吸收光谱有明显的差别；3.反应生成的产物有足够的稳定性，以保证测量过程反应生成的产物有足够的稳定性，以保证测量过程中溶液的吸光度不变；中溶液的吸光度不变；4.反应生成物的组成恒
25、定。反应生成物的组成恒定。5.有色配合物与显色剂颜色差别要大。有色配合物与显色剂颜色差别要大。显色反应实验条件：显色反应实验条件：1酸度酸度显色反应最适宜的酸度范围可通过实验来确显色反应最适宜的酸度范围可通过实验来确定，测定某一固定浓度的试样的吸光度随酸度的定，测定某一固定浓度的试样的吸光度随酸度的变化，以吸光度为纵坐标，溶液的变化，以吸光度为纵坐标，溶液的PH值为横坐标值为横坐标作图。作图。2.显色剂的用量显色剂的用量3.显色时间和温度显色时间和温度 测定试样溶液的吸光度，需先用参比溶液调节测定试样溶液的吸光度，需先用参比溶液调节透光度（吸光度为透光度（吸光度为0）为）为100%，以消除其它
26、成分及吸，以消除其它成分及吸收池和溶剂等对光的反射和吸收带来的测定误差。收池和溶剂等对光的反射和吸收带来的测定误差。三、参比溶液的选择三、参比溶液的选择参比溶液的选择视分析体系而定，具体有：参比溶液的选择视分析体系而定，具体有：1溶剂参比溶剂参比试样简单、共存其它成分对测定波试样简单、共存其它成分对测定波长吸收弱，只考虑消除溶剂与吸收池等因素；长吸收弱，只考虑消除溶剂与吸收池等因素；2试样参比试样参比如果试样基体溶液在测定波长有吸如果试样基体溶液在测定波长有吸收，而显色剂不与试样基体显色时，可按与显色反收，而显色剂不与试样基体显色时，可按与显色反应相同的条件处理试样，只是不加入显色剂。应相同的
27、条件处理试样，只是不加入显色剂。3试剂参比试剂参比 如果显色剂或其它试剂在测定波长如果显色剂或其它试剂在测定波长有吸收，按显色反应相同的条件，不加入试样，同有吸收，按显色反应相同的条件，不加入试样，同样加入试剂和溶剂作为参比溶液。样加入试剂和溶剂作为参比溶液。4.平行操作参比平行操作参比 用不含被测组分的试样，在相同用不含被测组分的试样，在相同的条件下与被测试样同时进行处理，由此得到平行的条件下与被测试样同时进行处理，由此得到平行操作参比溶液。操作参比溶液。5 测定方法一、一、单组分定量方法单组分定量方法其定量方法包括 校准曲线法校准曲线法、标准对比法标准对比法吸收系数法。吸收系数法。1、校准
28、曲线法校准曲线法方法：配制一系列不同含量的标准溶液，选用适方法：配制一系列不同含量的标准溶液，选用适宜的参比，在相同的条件下，测定系列标准溶液宜的参比，在相同的条件下，测定系列标准溶液的吸光度，作的吸光度，作A-c曲线，即标准曲线，曲线，即标准曲线，在相同在相同条件下测定未知试样的吸光度，从标准曲线上就条件下测定未知试样的吸光度，从标准曲线上就可以找到与之对应的未知试样的浓度。可以找到与之对应的未知试样的浓度。也可用最小二乘法处理，得线性回归方程。也可用最小二乘法处理，得线性回归方程。2、标准对比法标准对比法 即将待测溶液与某一标样溶液，在相同的条件下，即将待测溶液与某一标样溶液，在相同的条件
29、下，测定各自的吸光度。根据朗伯测定各自的吸光度。根据朗伯-比尔定律，解方程求出未比尔定律，解方程求出未知样浓度与含量知样浓度与含量。As=Kcs Ax=Kcx3、吸光系数法、吸光系数法n利用标准的吸光系数值进行定量。利用标准的吸光系数值进行定量。二、多组分定量方法二、多组分定量方法n当其它组分在测定波长下与被组分吸收峰产生重叠时，当其它组分在测定波长下与被组分吸收峰产生重叠时，或吸收峰相互干扰的各组分都的分析对象时，就要采或吸收峰相互干扰的各组分都的分析对象时，就要采用多组分定量方法。常用方法：用多组分定量方法。常用方法：n1、联立方程法、联立方程法n2、双波长法、双波长法n3、系数倍率法、系
30、数倍率法三、示差分光光度法三、示差分光光度法n用比试样浓度稍大或稍小的标准溶液作参比溶液，测得用比试样浓度稍大或稍小的标准溶液作参比溶液，测得的吸光度实际上是试样溶液的吸光度值和参比溶液吸的吸光度实际上是试样溶液的吸光度值和参比溶液吸光度值的差值。光度值的差值。n A=AS-AX =L CS-CX n按所选的测量条件，该法有三种测定方式：按所选的测量条件，该法有三种测定方式：n高浓度、低浓度、高精密度法。高浓度、低浓度、高精密度法。四、导数光谱法四、导数光谱法n它是解决干扰物质与被测物质的吸收光谱互相重叠，它是解决干扰物质与被测物质的吸收光谱互相重叠，消除胶体和悬浮物散射影响和背景吸收，提高光谱消除胶体和悬浮物散射影响和背景吸收，提高光谱分辩率的一种技术。分辩率的一种技术。n主要特点：主要特点：n1、输出信号更多、更明显及易于辨认结构特点，、输出信号更多、更明显及易于辨认结构特点，在定性分析中十分有用。在定性分析中十分有用。n2、能消除背景干扰及分离重叠谱带，可用于痕量、能消除背景干扰及分离重叠谱带，可用于痕量组分分析。组分分析。查阅文献、药典6 紫外-可见分光光度法的应用