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1、血液分子生物学基因治疗基因治疗（基因治疗（Genetherapy）基因治疗基因治疗（Genetherapy）：指应用：指应用DNA重组技术，将重组技术，将外源正常基因外源正常基因导入导入靶细靶细胞胞，以，以纠正纠正或或补偿补偿因基因缺陷和异常引起因基因缺陷和异常引起的疾病的疾病,以达到治疗的目的。以达到治疗的目的。为达到这一目的，实施相应的策略。为达到这一目的，实施相应的策略。为达到这一目的，实施相应的策略。为达到这一目的，实施相应的策略。一、基因治疗策略一、基因治疗策略策略：直接基因治疗和间接基因治疗策略：直接基因治疗和间接基因治疗1、直接基因治疗：、直接基因治疗：纠正纠正突变基因突变基因
2、在在原位原位修复缺陷的基因，以达到治疗目的。修复缺陷的基因，以达到治疗目的。为较为较理想理想的基因治疗策略，由于存在某些问的基因治疗策略，由于存在某些问题，目前正在努力之中。（未实现）题，目前正在努力之中。（未实现）2 2、间接疗法：、间接疗法：以正常的基因以正常的基因替代替代致病基因致病基因。导入外源正常基因，导入外源正常基因，代替代替有缺陷的基因有缺陷的基因,使细使细胞恢复正常功能而达到治疗疾病（尤其是遗传病）胞恢复正常功能而达到治疗疾病（尤其是遗传病）的目的。的目的。而对靶细胞而言，而对靶细胞而言，没有去除或修复有缺陷的没有去除或修复有缺陷的基因基因。途途径径就基因转移的就基因转移的受体
3、细胞受体细胞不同，不同，基因治疗有两种途径：基因治疗有两种途径：1、生殖细胞基因治疗、生殖细胞基因治疗2、体细胞基因治疗、体细胞基因治疗 1、生殖细胞基因治疗l将正常基因转移到患者生殖细胞（精细胞，将正常基因转移到患者生殖细胞（精细胞，卵细胞，早期胚胎）使其发育成正常个体。卵细胞，早期胚胎）使其发育成正常个体。为为理想理想的治疗方法，从的治疗方法，从根本根本上治疗遗传病，上治疗遗传病，使其有害基因不能在人群中散播。使其有害基因不能在人群中散播。但还存在某些问题：但还存在某些问题：（1）靶细胞的遗传修饰至今尚无实质性进展；靶细胞的遗传修饰至今尚无实质性进展；（2）基因转移效率不高，只能用）基因转
4、移效率不高，只能用显微注射显微注射方法；方法；（3）只适用于排卵周期）只适用于排卵周期短而次数多短而次数多的动物，很难的动物，很难适用于人类。适用于人类。（但目前辅助生殖技术的发展较为有效的解决了（但目前辅助生殖技术的发展较为有效的解决了获取卵细胞的办法。一次可获取少者获取卵细胞的办法。一次可获取少者3-5个，多个，多者十几个。）者十几个。）2体细胞基因治疗somatic cell gene therapy 将正常基因转移到将正常基因转移到体细胞体细胞，使之表达基，使之表达基因产物，以达到治疗的目的。但有害基因能因产物，以达到治疗的目的。但有害基因能遗传给后代。遗传给后代。措 施：（1 1）正
5、常基因转移至体外培养的体细胞，有效）正常基因转移至体外培养的体细胞，有效 表达后，再回输到体内。表达后，再回输到体内。（2 2）正常基因导入靶细胞，定位整合到染色体）正常基因导入靶细胞，定位整合到染色体 上，准确的替换异常基因，是上，准确的替换异常基因，是理想理想的措施。的措施。（3 3）随机整合，非特定座位，只要有效的表达）随机整合，非特定座位，只要有效的表达 即可达到治疗的目的。即可达到治疗的目的。（4 4）体细胞基因治疗理论上不必矫正所有的体）体细胞基因治疗理论上不必矫正所有的体 细胞。细胞。存在的问题 l对特定座位基因转移，目前还存在较大对特定座位基因转移，目前还存在较大困难；困难；l
6、随机插入可能引起后代的基因突变。随机插入可能引起后代的基因突变。二二、基因治疗的方法、基因治疗的方法基因治疗的关键性步骤基因治疗的关键性步骤-目的基因的目的基因的获得与转移获得与转移基因治疗首先获得目的基因，通常从基因治疗首先获得目的基因，通常从基因治疗首先获得目的基因，通常从基因治疗首先获得目的基因，通常从基因组基因组基因组基因组中分离中分离中分离中分离 基因克隆基因克隆基因克隆基因克隆 定定定定 位位位位 表表表表 达达达达 评价表达情况评价表达情况评价表达情况评价表达情况（一）目的基因的获得（一）目的基因的获得 正常基因的分离与克隆正常基因的分离与克隆（二）外源基因的转移l通过不同方法，
7、将目的基因转移至受体通过不同方法，将目的基因转移至受体细胞。细胞。（1）物理方法1 1）电穿孔法电穿孔法电穿孔法电穿孔法（electroporotionelectroporotion）将细胞置于高压将细胞置于高压将细胞置于高压将细胞置于高压脉冲电场中，通过电压使细胞产生可逆性的穿孔。脉冲电场中，通过电压使细胞产生可逆性的穿孔。脉冲电场中，通过电压使细胞产生可逆性的穿孔。脉冲电场中，通过电压使细胞产生可逆性的穿孔。周围基质中的周围基质中的周围基质中的周围基质中的DNADNA可渗进细胞，进而表达。可渗进细胞，进而表达。可渗进细胞，进而表达。可渗进细胞，进而表达。瞬间瞬间瞬间瞬间细胞细胞细胞细胞细胞
8、膜核膜通透性增加细胞膜核膜通透性增加细胞膜核膜通透性增加细胞膜核膜通透性增加高压脉冲高压脉冲高压脉冲高压脉冲 DNADNA渗入细胞渗入细胞渗入细胞渗入细胞2 2）显微注射法）显微注射法（microinjection microinjection）利用显微操作把目的基因直接注入靶细胞利用显微操作把目的基因直接注入靶细胞 常用的细胞常用的细胞常用的细胞常用的细胞（1 1）受精卵：受精卵）受精卵：受精卵）受精卵：受精卵）受精卵：受精卵基因操作基因操作基因操作基因操作注射假孕注射假孕注射假孕注射假孕动物子宫动物子宫动物子宫动物子宫胚胎胚胎胚胎胚胎个体。个体。个体。个体。（2 2）胚胎干细胞胚胎干细胞胚
9、胎干细胞胚胎干细胞：从着床前的动物胚胎中：从着床前的动物胚胎中：从着床前的动物胚胎中：从着床前的动物胚胎中分离多功能胚胎干细胞分离多功能胚胎干细胞分离多功能胚胎干细胞分离多功能胚胎干细胞基因操作基因操作基因操作基因操作注射入动注射入动注射入动注射入动物囊胚物囊胚物囊胚物囊胚形成嵌合体胚胎形成嵌合体胚胎形成嵌合体胚胎形成嵌合体胚胎嵌合个体。嵌合个体。嵌合个体。嵌合个体。l l用显微注射仪将外源基因直接注射入实验动物受精卵中，利用显微注射仪将外源基因直接注射入实验动物受精卵中，利用显微注射仪将外源基因直接注射入实验动物受精卵中，利用显微注射仪将外源基因直接注射入实验动物受精卵中，利用外源基因整合到
10、用外源基因整合到用外源基因整合到用外源基因整合到DNADNA中，从而得到转基因动物。中，从而得到转基因动物。中，从而得到转基因动物。中，从而得到转基因动物。l l特点：导入速度快，操作步骤不复杂，对特点：导入速度快，操作步骤不复杂，对特点：导入速度快，操作步骤不复杂，对特点：导入速度快，操作步骤不复杂，对DNADNA大小无限制，大小无限制，大小无限制，大小无限制，不需要载体，整合效率较高，它可以直接获得纯系。不需要载体，整合效率较高，它可以直接获得纯系。不需要载体，整合效率较高，它可以直接获得纯系。不需要载体，整合效率较高，它可以直接获得纯系。l l缺点：需要贵重精密仪器，技术操作较难，并且外
11、源基因的缺点：需要贵重精密仪器，技术操作较难，并且外源基因的缺点：需要贵重精密仪器，技术操作较难，并且外源基因的缺点：需要贵重精密仪器，技术操作较难，并且外源基因的整合位点和整合的拷贝数都无法控制，易造成宿主动物基因整合位点和整合的拷贝数都无法控制，易造成宿主动物基因整合位点和整合的拷贝数都无法控制，易造成宿主动物基因整合位点和整合的拷贝数都无法控制，易造成宿主动物基因组的插入突变，引起相应的性状改变，重则致死。组的插入突变，引起相应的性状改变，重则致死。组的插入突变，引起相应的性状改变，重则致死。组的插入突变，引起相应的性状改变，重则致死。例：转基因动物的制备重组基因重组基因重组基因重组基因
12、DNADNA 微注射微注射微注射微注射（体外）（体外）（体外）（体外）小鼠受精卵小鼠受精卵小鼠受精卵小鼠受精卵回植回植回植回植假妊娠假妊娠假妊娠假妊娠 仔仔仔仔 鼠鼠鼠鼠动物模型：转基因鼠动物模型：转基因鼠动物模型：转基因鼠动物模型：转基因鼠(每个鼠细胞中都含有外源基因，按孟德尔方式遗传每个鼠细胞中都含有外源基因，按孟德尔方式遗传每个鼠细胞中都含有外源基因，按孟德尔方式遗传每个鼠细胞中都含有外源基因，按孟德尔方式遗传)clonesheepDollyclonesheepDolly体细胞体细胞体细胞体细胞 提取提取提取提取 核核核核重组细胞重组细胞重组细胞重组细胞回植回植回植回植DollyDoll
13、y卵细胞卵细胞卵细胞卵细胞 去核去核去核去核细胞细胞细胞细胞 转基因动物研究大事记转基因动物研究大事记19741974年，美国学者年，美国学者年，美国学者年，美国学者JaenischJaenisch应用显微镜注射法把基因导应用显微镜注射法把基因导应用显微镜注射法把基因导应用显微镜注射法把基因导入真核细胞。入真核细胞。入真核细胞。入真核细胞。19811981年，美国科学家将外源基因导入动物胚胎，创立了转年，美国科学家将外源基因导入动物胚胎，创立了转年，美国科学家将外源基因导入动物胚胎，创立了转年，美国科学家将外源基因导入动物胚胎，创立了转基因动物技术。基因动物技术。基因动物技术。基因动物技术。1
14、9821982年获得转基因小鼠。年获得转基因小鼠。年获得转基因小鼠。年获得转基因小鼠。19871987年，世界上第一只商业化转基因绵羊在英国著名的罗年，世界上第一只商业化转基因绵羊在英国著名的罗年，世界上第一只商业化转基因绵羊在英国著名的罗年，世界上第一只商业化转基因绵羊在英国著名的罗斯林研究所诞生。这只转基因母羊的乳汁中可以分泌斯林研究所诞生。这只转基因母羊的乳汁中可以分泌斯林研究所诞生。这只转基因母羊的乳汁中可以分泌斯林研究所诞生。这只转基因母羊的乳汁中可以分泌抗抗抗抗胰蛋白酶。胰蛋白酶。胰蛋白酶。胰蛋白酶。3）微粒子轰击法l l利用亚微粒的利用亚微粒的钨钨和和金金能吸附能吸附DNA，并将
15、其包，并将其包裹起来形成微粒，通过物理途径使微粒瞬间既裹起来形成微粒，通过物理途径使微粒瞬间既可进入靶细胞，达到转移目的基因的目的，而可进入靶细胞，达到转移目的基因的目的，而不损伤靶细胞。不损伤靶细胞。l l该方法可使目的基因在皮肤、肝、胰、胃及该方法可使目的基因在皮肤、肝、胰、胃及乳腺等细胞中表达。乳腺等细胞中表达。（2）化学法磷酸钙沉淀法：磷酸钙沉淀法：目的基因与磷酸钙等物质混合，形成沉淀的目的基因与磷酸钙等物质混合，形成沉淀的DNADNA微细颗粒，易通过细胞膜进入细胞内，并整合到受微细颗粒，易通过细胞膜进入细胞内，并整合到受体细胞基因组中，在适当条件下得以表达。体细胞基因组中，在适当条件
16、下得以表达。磷酸钙磷酸钙+DNA 混合微细颗粒混合微细颗粒 沉淀反应沉淀反应2030min 细胞在沉淀物中暴露细胞在沉淀物中暴露 524h 方法方法简单简单，但转化，但转化效率低效率低。（3 3）脂质体法（）脂质体法（liposomeliposome）l l应用人工制备的类似细胞膜的膜性结构应用人工制备的类似细胞膜的膜性结构脂质体，包装外源基因，再与靶细胞融合，脂质体，包装外源基因，再与靶细胞融合，外源外源DNA导入靶细胞，使其表达。导入靶细胞，使其表达。DNA 细胞融合细胞融合细胞融合细胞融合转化细胞转化细胞转化细胞转化细胞 PEGPEG 仙苔病毒仙苔病毒仙苔病毒仙苔病毒DNA脂膜脂膜（4
17、4）同源重组法）同源重组法 同源重组（同源重组（homologusrecombination）:外源基因和染色体上的外源基因和染色体上的基因在基因在同源序列同源序列间发生重组而插入染色体。间发生重组而插入染色体。是将外源基因是将外源基因定位定位导入细胞的染色体上。导入细胞的染色体上。单交换单交换 双交换双交换 通过同源重组定点插入珠蛋白基因Xba IBstXIXba IneoXbaIBstXIneo正常基因座位正常基因座位带有珠蛋白基带有珠蛋白基因的质粒因的质粒 C重重组组后，插入外源基因片段后，插入外源基因片段带带有有neo基因（新霉素抗性基因），基因（新霉素抗性基因），重重组组后的后的细细
18、胞在含有胞在含有neo 的培养基中生的培养基中生长长，没有插入新基因的，没有插入新基因的细细胞死亡，将有重胞死亡，将有重组组的的细细胞胞筛选筛选出来。出来。（5 5）病毒介导基因内转移（）病毒介导基因内转移（Viral mediated Viral mediated transfertransfer）l l是通过病毒为载体（是通过病毒为载体（是通过病毒为载体（是通过病毒为载体（vectorvectorvectorvector），将外源基因通过），将外源基因通过），将外源基因通过），将外源基因通过重组技术与病毒重组，然后去感染受体细胞重组技术与病毒重组，然后去感染受体细胞重组技术与病毒重组，然后
19、去感染受体细胞重组技术与病毒重组，然后去感染受体细胞感染细胞重组病毒病毒载体l l病毒具有一些独特的性质如多数病毒可感染特异病毒具有一些独特的性质如多数病毒可感染特异的细胞，在细胞内不易降解；的细胞，在细胞内不易降解；l lRNARNA病毒能整合到染色体以及基因表达水平较高病毒能整合到染色体以及基因表达水平较高等。因此病毒载体是良好的基因转运载体；等。因此病毒载体是良好的基因转运载体；l l目前已被用作载体的病毒有逆转录病毒、腺病毒、目前已被用作载体的病毒有逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒和肝炎病毒等。腺相关病毒、疱疹病毒和肝炎病毒等。病毒的分类病毒的分类病毒的分类病毒的分类（1995
20、1995年）年）年）年）*DNA*DNA病毒病毒病毒病毒*RNA*RNA病毒病毒病毒病毒*逆转录病毒逆转录病毒逆转录病毒逆转录病毒病毒的增殖病毒的增殖病毒的增殖病毒的增殖（复制）（复制）（复制）（复制）*吸附与穿入：细胞膜表面的特异性受体。吸附与穿入：细胞膜表面的特异性受体。吸附与穿入：细胞膜表面的特异性受体。吸附与穿入：细胞膜表面的特异性受体。*脱壳：溶菌酶作用下，病毒体释放出基因组核酸。脱壳：溶菌酶作用下，病毒体释放出基因组核酸。脱壳：溶菌酶作用下，病毒体释放出基因组核酸。脱壳：溶菌酶作用下，病毒体释放出基因组核酸。*生物合成：病毒核酸的复制及蛋白质的合成。生物合成：病毒核酸的复制及蛋白质
21、的合成。生物合成：病毒核酸的复制及蛋白质的合成。生物合成：病毒核酸的复制及蛋白质的合成。*转配与释放：复制出子代病毒的核酸与蛋白质，转配与释放：复制出子代病毒的核酸与蛋白质，转配与释放：复制出子代病毒的核酸与蛋白质，转配与释放：复制出子代病毒的核酸与蛋白质，在细在细在细在细 胞内装配为成熟的病毒体；并从宿主细胞释放。胞内装配为成熟的病毒体；并从宿主细胞释放。胞内装配为成熟的病毒体；并从宿主细胞释放。胞内装配为成熟的病毒体；并从宿主细胞释放。逆转录病毒逆转录病毒(RNA)(RNA)常用的病毒载体常用的病毒载体 DNA DNA病毒病毒 1)1)逆转录病毒（逆转录病毒（retrovirusretro
22、virus）目前应用最多、最成功目前应用最多、最成功.病毒感染细胞后，病毒感染细胞后，其基因组其基因组RNA RNA 经逆转录产生双链经逆转录产生双链DNADNA拷贝，插入宿拷贝，插入宿主染色体形成前病毒（主染色体形成前病毒（provirusprovirus），前病毒转录），前病毒转录产生的正链既是病毒产生的正链既是病毒RNARNA，再与前病毒编码的外壳，再与前病毒编码的外壳蛋白包装成新的病毒颗粒。蛋白包装成新的病毒颗粒。例如：小鼠白血病病毒（例如：小鼠白血病病毒（Mo-MLVMo-MLV）基因）基因组结构：组结构：LTR LTR LTR LTR gag pol env gag pol env
23、U3 R U5 U3 R U5U3 R U5 U3 R U5 U3=U3=增强子，增强子，增强子，增强子，R=R=启动子，启动子，启动子，启动子，U5=U5=转录起始位点。转录起始位点。转录起始位点。转录起始位点。=病毒包装信号，病毒包装信号，病毒包装信号，病毒包装信号，gag=gag=核心抗原，核心抗原，核心抗原，核心抗原，pol=pol=逆转逆转逆转逆转录酶，录酶，录酶，录酶，env=env=外壳蛋白。外壳蛋白。外壳蛋白。外壳蛋白。逆转录病毒载体构建的技术路线逆转录病毒载体构建的技术路线 *gag,pol,env gag,pol,env 序列去除，保留序列去除，保留LTR LTR 和和，使
24、使 逆转录病毒成为无复制能力的缺陷病毒。逆转录病毒成为无复制能力的缺陷病毒。*在在gag,pol,env gag,pol,env 序列去除的区域，插入目的基因序列去除的区域，插入目的基因 序列和报告基因序列（如序列和报告基因序列（如GFP)GFP)。*将目的基因、其两端的将目的基因、其两端的LTR LTR 以及以及这一序列插入这一序列插入 经改造的质粒内。经改造的质粒内。*将将将将gag-pol gag-pol 序列插入经改造的质粒序列插入经改造的质粒序列插入经改造的质粒序列插入经改造的质粒 *将将将将envenv序列插入经改造的质粒序列插入经改造的质粒序列插入经改造的质粒序列插入经改造的质粒
25、n n质粒 *是位于细菌内的双链、闭环的是位于细菌内的双链、闭环的是位于细菌内的双链、闭环的是位于细菌内的双链、闭环的DNA DNA DNA DNA 分分分分 子，独立于细菌染色体之外进行复制和子，独立于细菌染色体之外进行复制和子，独立于细菌染色体之外进行复制和子，独立于细菌染色体之外进行复制和 遗传的辅助性遗传单位。遗传的辅助性遗传单位。遗传的辅助性遗传单位。遗传的辅助性遗传单位。*他们又依赖于宿主编码的酶和蛋白质来他们又依赖于宿主编码的酶和蛋白质来他们又依赖于宿主编码的酶和蛋白质来他们又依赖于宿主编码的酶和蛋白质来 进行复制和转录。进行复制和转录。进行复制和转录。进行复制和转录。*质粒产生
26、的表型包括对抗生素的抗性、质粒产生的表型包括对抗生素的抗性、质粒产生的表型包括对抗生素的抗性、质粒产生的表型包括对抗生素的抗性、产抗生素、降解复杂有机化合物等。产抗生素、降解复杂有机化合物等。产抗生素、降解复杂有机化合物等。产抗生素、降解复杂有机化合物等。ori 5LTRori 5LTR 目的基因目的基因 标记基因标记基因 3LTR 3LTR 抗生素基因抗生素基因逆转录病毒载体优点：高效感染宿主细胞，转染率可达高效感染宿主细胞，转染率可达100%病毒基因和所载的外源基因都可能表达病毒基因和所载的外源基因都可能表达宿主范围广，可同时感染大量细胞并长期存留宿主范围广，可同时感染大量细胞并长期存留缺
27、 点 病毒基因容量有限，一般只能插入病毒基因容量有限，一般只能插入病毒基因容量有限，一般只能插入病毒基因容量有限，一般只能插入7kb7kb左右片左右片左右片左右片段；段；段；段；病毒随机插入靶细胞基因组中，因病毒具有强病毒随机插入靶细胞基因组中，因病毒具有强病毒随机插入靶细胞基因组中，因病毒具有强病毒随机插入靶细胞基因组中，因病毒具有强大的启动子和增强子，能使插入点附近的基因大的启动子和增强子，能使插入点附近的基因大的启动子和增强子，能使插入点附近的基因大的启动子和增强子，能使插入点附近的基因过度表达或失活，插入的过度表达或失活，插入的过度表达或失活，插入的过度表达或失活，插入的 外源基因可能
28、不适当外源基因可能不适当外源基因可能不适当外源基因可能不适当的表达；的表达；的表达；的表达；逆转录病毒有致癌作用，可能使受体细逆转录病毒有致癌作用，可能使受体细胞癌变。胞癌变。根据逆转录病毒的缺点，人们有目的地根据逆转录病毒的缺点，人们有目的地将其改造，保留其优点，除去癌基因和将其改造，保留其优点，除去癌基因和病毒基因，保留病毒基因，保留LTR和和包装信号。包装信号。（6）受体载体转移法l l将含有目的基因的重组质粒和某些细胞表将含有目的基因的重组质粒和某些细胞表面受体能识别的特异性多肽（配体）形成面受体能识别的特异性多肽（配体）形成复合物，通过细胞内吞途径达到转移基因复合物，通过细胞内吞途径
29、达到转移基因的目的。的目的。重组质粒重组质粒重组质粒重组质粒配体配体配体配体细胞膜细胞膜复合物复合物复合物复合物（三）靶细胞的选择（三）靶细胞的选择l靶细胞靶细胞是指接受外源是指接受外源GeneGene的的体体细胞细胞选择靶细胞的选择靶细胞的原则原则是：是：1 1）便于体外培养和进行遗传技术操作；）便于体外培养和进行遗传技术操作；2 2）易于由人体分离又便于输回体内；）易于由人体分离又便于输回体内；3 3）具有增殖优势，生命周期长（能存活几月至）具有增殖优势，生命周期长（能存活几月至 几年，或整个生命周期）；几年，或整个生命周期）；4 4）易于受外源遗传物质转化。）易于受外源遗传物质转化。常见
30、的靶细胞常见的靶细胞l外周血外周血T T淋巴细胞淋巴细胞l上皮细胞上皮细胞l内皮内皮l皮肤成纤维细胞皮肤成纤维细胞l造血干细胞造血干细胞地中海贫血、严重地中海贫血、严重 复合免疫缺陷病等基因治疗复合免疫缺陷病等基因治疗l肝细胞肝细胞家族性高胆固醇血症、低密度家族性高胆固醇血症、低密度 脂蛋白病的基因治疗脂蛋白病的基因治疗l肌细胞肌细胞三、基因治疗的现状与前景三、基因治疗的现状与前景l l体细胞体细胞基因基因治疗临床实验已经开始，生治疗临床实验已经开始，生殖细胞殖细胞基因基因治疗正在完善。进行基因治治疗正在完善。进行基因治疗必须具备下列条件疗必须具备下列条件：具备下列条件l l选择适当的疾病，清
31、楚疾病的发病机理，基因选择适当的疾病，清楚疾病的发病机理，基因的结构和功能。的结构和功能。l l目的基因已克隆，并清楚基因表达与调控机制目的基因已克隆，并清楚基因表达与调控机制与条件。与条件。l l选择适当的受体细胞并在体外有效表达。选择适当的受体细胞并在体外有效表达。l l安全有效的基因转移方法，以及供利用的动物安全有效的基因转移方法，以及供利用的动物模型。模型。基因治疗实例1、复合免疫缺陷综合征的基因治疗复合免疫缺陷综合征的基因治疗（人类（人类Gene治疗成功例子）治疗成功例子）l lADA缺乏症缺乏症-致死性疾病，患者由于致死性疾病，患者由于腺腺苷酸脱氨酶（苷酸脱氨酶（ADA）缺乏。缺乏
32、。ADA-Gene+vectorADA-Gene+vector（逆转录病毒）（逆转录病毒）（逆转录病毒）（逆转录病毒）重组分子重组分子重组分子重组分子患者患者患者患者TLyCIL-2TLyCIL-2刺激刺激刺激刺激C C分裂分裂分裂分裂导入导入导入导入 细胞生长分裂细胞生长分裂细胞生长分裂细胞生长分裂1010天天天天GeneGene表达表达表达表达 回输患儿体内回输患儿体内回输患儿体内回输患儿体内1212月治疗一次月治疗一次月治疗一次月治疗一次,10,10个月个月个月个月患儿体内患儿体内患儿体内患儿体内ADAADA水平达正常人的水平达正常人的水平达正常人的水平达正常人的25%25%2、乙型血友
33、病、乙型血友病l lXR，患者凝血因子，患者凝血因子缺乏，缺乏，因子基因定位因子基因定位在在Xq26.3q27.2。临床表现，易出血，凝血临床表现，易出血，凝血时间长，轻伤、小手术后常出血不止。发病时间长，轻伤、小手术后常出血不止。发病率为率为1/30000。l l例如：我国学者薛京伦实施的例如：我国学者薛京伦实施的F的基因治疗。的基因治疗。l l逆转录病毒载体逆转录病毒载体逆转录病毒载体逆转录病毒载体+F+FcDNAcDNA 重组体重组体 5 LTR F 5 LTR F neo SV PSO LTR 3 neo SV PSO LTR 3导入仓鼠细胞（导入仓鼠细胞（导入仓鼠细胞（导入仓鼠细胞（
34、CHOCHO）FF表达；表达；表达；表达；导入乙型血友病患者皮肤成纤维细胞（体外培养）导入乙型血友病患者皮肤成纤维细胞（体外培养）导入乙型血友病患者皮肤成纤维细胞（体外培养）导入乙型血友病患者皮肤成纤维细胞（体外培养）FF表达；表达；表达；表达；9191年，导入乙型血友病患者皮肤成纤维细胞（体外年，导入乙型血友病患者皮肤成纤维细胞（体外年，导入乙型血友病患者皮肤成纤维细胞（体外年，导入乙型血友病患者皮肤成纤维细胞（体外培养）培养）培养）培养）回植病人皮下回植病人皮下回植病人皮下回植病人皮下FF基因表达，基因表达，基因表达，基因表达，F F基表达基表达基表达基表达水平达正常人的水平达正常人的水平
35、达正常人的水平达正常人的5%5%。是我国基因治疗成功的例子。是我国基因治疗成功的例子。是我国基因治疗成功的例子。是我国基因治疗成功的例子。3、黑色素瘤的基因治疗l l肿瘤肿瘤肿瘤肿瘤基因基因治疗治疗治疗治疗是人们十分关注的问题，进行了是人们十分关注的问题，进行了是人们十分关注的问题，进行了是人们十分关注的问题，进行了广泛的探索。研究发现广泛的探索。研究发现广泛的探索。研究发现广泛的探索。研究发现，肿瘤浸润淋巴细胞肿瘤浸润淋巴细胞肿瘤浸润淋巴细胞肿瘤浸润淋巴细胞TILTIL，它积聚肿瘤部位，并在该处持续存在而它积聚肿瘤部位，并在该处持续存在而它积聚肿瘤部位，并在该处持续存在而它积聚肿瘤部位，并在
36、该处持续存在而无副作用，利用此特点协助治疗肿瘤。无副作用，利用此特点协助治疗肿瘤。无副作用，利用此特点协助治疗肿瘤。无副作用，利用此特点协助治疗肿瘤。例：细胞因子基因治疗和肿瘤坏死因子基因例：细胞因子基因治疗和肿瘤坏死因子基因治疗治疗IL-2 GeneIL-2 Gene TNF-GeneTNF-Gene （白介（白介（白介（白介2 2）（肿瘤坏死因子）（肿瘤坏死因子）（肿瘤坏死因子）（肿瘤坏死因子）逆转录病毒载体逆转录病毒载体逆转录病毒载体逆转录病毒载体导入导入导入导入TILTIL（体外培养的自体细胞）（体外培养的自体细胞）（体外培养的自体细胞）（体外培养的自体细胞）回植患者体内回植患者体内回
37、植患者体内回植患者体内TILTIL进入自体肿瘤部位，提高细胞因子杀伤肿瘤细进入自体肿瘤部位，提高细胞因子杀伤肿瘤细进入自体肿瘤部位，提高细胞因子杀伤肿瘤细进入自体肿瘤部位，提高细胞因子杀伤肿瘤细胞胞胞胞 的作用。的作用。的作用。的作用。4、自杀基因的基因治疗、自杀基因的基因治疗X原理：原理：即用（逆转录）病毒载体将编码某种即用（逆转录）病毒载体将编码某种酶的基因（自杀基因）转染到肿瘤细胞中，此酶的基因（自杀基因）转染到肿瘤细胞中，此酶可将一种酶可将一种无害无害的药物前体转变为的药物前体转变为细胞毒复合细胞毒复合物物，进而杀伤肿瘤细胞（肿瘤细胞不能复制而，进而杀伤肿瘤细胞（肿瘤细胞不能复制而死亡
38、）。这种基因载体只能在死亡）。这种基因载体只能在特定的组织或肿特定的组织或肿瘤瘤中表达，而正常细胞中不表达。中表达，而正常细胞中不表达。自自杀杀基基因因(suicide(suicide gene)gene)是是一一类类前前体体药药物物转转换换酶酶基基因因，其其编编码码的的特特异异性性酶酶类类将将原原先先对对细细胞胞无无毒毒或或毒毒性性极极低低的的前前体体药药物物在在肿肿瘤瘤细细胞胞内内代代谢谢成成毒毒性性产产物物，从从而而达达到到杀杀死死肿肿瘤瘤细细胞的目的。胞的目的。目目前前研研究究过过的的自自杀杀基基因因有有十十余余种种，最最常常用用的的是是HSV-TK/GCVHSV-TK/GCV和和CD
39、/5-FCCD/5-FC两两种种自自杀杀基基因因系统。系统。4、自杀基因的基因治疗、自杀基因的基因治疗如如：自杀基因自杀基因+病毒载体病毒载体转染转染重组载体重组载体 药物前体药物前体 无毒无毒Gene酶酶 药物复合物药物复合物 有毒有毒 细胞死亡细胞死亡例如：例如：例如：例如：单纯疱疹病毒单纯疱疹病毒单纯疱疹病毒单纯疱疹病毒哺乳动物细胞哺乳动物细胞哺乳动物细胞哺乳动物细胞HSVGene-TKHSVGene-TK（在肿瘤细胞中表达，正常细胞中不表达）（在肿瘤细胞中表达，正常细胞中不表达）（在肿瘤细胞中表达，正常细胞中不表达）（在肿瘤细胞中表达，正常细胞中不表达）GeneTKGeneTKGCVG
40、CV（胸苷类似物）（胸苷类似物）（胸苷类似物）（胸苷类似物）TdRTdRPpPpGCV-pGCV-p抑制抑制抑制抑制DNADNA合成合成合成合成脱氧胸苷酸脱氧胸苷酸脱氧胸苷酸脱氧胸苷酸 肿瘤细胞死亡肿瘤细胞死亡肿瘤细胞死亡肿瘤细胞死亡 邻近细胞死亡邻近细胞死亡邻近细胞死亡邻近细胞死亡/凋亡（旁观者效应）凋亡（旁观者效应）凋亡（旁观者效应）凋亡（旁观者效应）5、反义核酸基因治疗反义技术反义技术：是指利用人工合成的反义是指利用人工合成的反义RNA或或DNA导入靶细胞，阻断导入靶细胞，阻断Gene的转的转录或复制，控制细胞的中间阶段使编码蛋录或复制，控制细胞的中间阶段使编码蛋白的白的Gene不能转录
41、为不能转录为mRNA或阻断翻译或阻断翻译相应蛋白相应蛋白.反义基因治疗 DNA DNA DNA DNA RNA RNA RNA RNA 反义反义RNARNA 阻断表达阻断表达 四、四、基因治疗存在的问题与论理学基因治疗存在的问题与论理学l l基因基因治疗的研究与实践中存在若干重治疗的研究与实践中存在若干重要问题，所以更多的是处于研究阶段，要问题，所以更多的是处于研究阶段，临床应用还有待深入。临床应用还有待深入。一）导入基因的持续性和高效表达一）导入基因的持续性和高效表达如何提高基因的持续高效表达如何提高基因的持续高效表达，从下列几方面考虑：，从下列几方面考虑：1 1、选择高效的基因转移方法；、
42、选择高效的基因转移方法；2 2、选择适当的受体细胞（生命周期长的细胞）、选择适当的受体细胞（生命周期长的细胞）3 3、选择适当的载体（广泛表达或特异性表达的载体，、选择适当的载体（广泛表达或特异性表达的载体，以使以使GeneGene高效表达）高效表达）二）二）GeneGene治疗与社会伦理道德治疗与社会伦理道德l l体细胞体细胞体细胞体细胞GeneGene治疗符合伦理道德，没有争议。治疗符合伦理道德，没有争议。治疗符合伦理道德，没有争议。治疗符合伦理道德，没有争议。l l生殖细胞生殖细胞生殖细胞生殖细胞GeneGene治疗可能改变正常人的遗传特征，治疗可能改变正常人的遗传特征，治疗可能改变正常
43、人的遗传特征，治疗可能改变正常人的遗传特征，存在某些争议。然而生殖细胞的基因治疗又是存在某些争议。然而生殖细胞的基因治疗又是存在某些争议。然而生殖细胞的基因治疗又是存在某些争议。然而生殖细胞的基因治疗又是一个不容回避的课题，因为它比体细胞基因治一个不容回避的课题，因为它比体细胞基因治一个不容回避的课题，因为它比体细胞基因治一个不容回避的课题，因为它比体细胞基因治疗更为彻底。所以，随着分子生物学技术的发疗更为彻底。所以，随着分子生物学技术的发疗更为彻底。所以，随着分子生物学技术的发疗更为彻底。所以，随着分子生物学技术的发展，展，展，展，GenGene e治疗技术的成熟，将回答伦理道德治疗技术的成熟，将回答伦理道德治疗技术的成熟，将回答伦理道德治疗技术的成熟，将回答伦理道德方面的问题，相信生殖细胞的基因治疗将会被方面的问题，相信生殖细胞的基因治疗将会被方面的问题，相信生殖细胞的基因治疗将会被方面的问题，相信生殖细胞的基因治疗将会被人们接受。人们接受。人们接受。人们接受。此课件下载可自行编辑修改，仅供参考！此课件下载可自行编辑修改，仅供参考！感谢您的支持，我们努力做得更好！谢谢感谢您的支持，我们努力做得更好！谢谢