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1、血凝(HA)与血凝抑制(HI)试验一、实验目的二、实验内容三、实验原理四、实验材料五、实验方法与结果判定六、注意事项七、新城疫背景介绍一、实验目的1、掌握血凝和血凝抑制试验的基本原理、操 作方法和结果判定方法2、了解新城疫有关背景知识 二、实验内容1、血凝试验(HA)检测新城疫抗原2、血凝抑制试验(HI)检测新城疫抗体三、实验原理1 1、血凝试验（、血凝试验（HAHA）原理：某些病毒或病毒的）原理：某些病毒或病毒的血凝血凝素素能能选择性地选择性地使某种动物地使某种动物地红细胞红细胞发生凝集，这种发生凝集，这种凝集红细胞的现象称为血凝（凝集红细胞的现象称为血凝（HAHA）,也称直接血凝也称直接血
2、凝反应。反应。病病毒毒颗颗粒粒红红细细胞胞2 2、血凝抑制试验（、血凝抑制试验（HIHI）原理：当病毒的悬液中加入）原理：当病毒的悬液中加入特异性抗体特异性抗体，且这种抗体的量足以，且这种抗体的量足以抑制抑制病毒颗粒或其病毒颗粒或其血凝素时，则血凝素时，则红细胞表面的受体红细胞表面的受体就不能与病毒颗粒或就不能与病毒颗粒或血凝素直接接触。这时红细胞的凝集现象就被抑制，血凝素直接接触。这时红细胞的凝集现象就被抑制，称为红细胞凝集抑制（称为红细胞凝集抑制（HIHI）反应，也称血凝抑制反应。）反应，也称血凝抑制反应。I am lateI am late！抗体抗体抗原抗原四、实验材料1、血凝板（2人/
3、块）2、新城疫阳性血清3、被检血清（1份）4、1红细胞悬液5、稀释液6、移液器（50ul,2人/把）7、枪头五、实验方法与结果判定血凝试验（HA)1 1、在血凝板上第一排的、在血凝板上第一排的1 11212孔内各加入孔内各加入50ul50ul生理生理盐水盐水2 2、在第、在第1 1孔内加入孔内加入50ul50ul病毒抗原，然后依次倍比稀病毒抗原，然后依次倍比稀释至第释至第1111孔，最后弃孔，最后弃50ul50ul3 3、每孔加入、每孔加入1 1鸡红细胞悬液鸡红细胞悬液50ul50ul4 4、轻轻振荡均匀，后放于室温或、轻轻振荡均匀，后放于室温或3737中静置中静置3030分分钟钟5 5、结果
4、判定、结果判定12345678910111224 816 32 64 128 256 5121024 2048红细胞对照生理盐水505050505050505050505050抗原5050505050505050505050弃50红细胞505050505050505050505050结果 血凝效价测定血凝效价测定结果判定标准1 1、：红细胞呈细沙样均匀铺于孔底，即、：红细胞呈细沙样均匀铺于孔底，即100100凝集；凝集；2 2、：红细胞均匀铺于孔底，当边缘不整齐而、：红细胞均匀铺于孔底，当边缘不整齐而稍向孔底集中，即稍向孔底集中，即7575凝集；凝集；3 3、：红细胞形成一个环状，四周有凝集块
5、，即：红细胞形成一个环状，四周有凝集块，即5050凝集；凝集；4 4、：红细胞于孔底形成圆团，边缘不够光滑，四：红细胞于孔底形成圆团，边缘不够光滑，四周稍有凝集块，即周稍有凝集块，即2525凝集；凝集；5 5、：红细胞于孔底形成圆团，边缘光滑整齐，即：红细胞于孔底形成圆团，边缘光滑整齐，即无凝集；无凝集；血凝价的判定以出现（50凝集）的抗原最高稀释倍数为该抗原的血凝价（1:128）。50ul 1:256稀释的病毒抗原为该抗原的一个血凝单位。稀释倍数2 4 8 16 32 64128 25651210242048细胞对照结果 血凝抑制试验1 1、将病毒抗原稀释成、将病毒抗原稀释成4 4个血凝单位
6、（个血凝单位（1/1284=1:321/1284=1:32）2 2、在血凝板上、在血凝板上1 11212孔内各加入孔内各加入50ul50ul生理盐水；生理盐水；3 3、在第、在第1 1孔内加入被检血清孔内加入被检血清50ul50ul，然后倍比稀释至第，然后倍比稀释至第1111孔，最后弃孔，最后弃50ul50ul；4 4、第、第1 11212孔内加入孔内加入4 4单位抗原单位抗原50ul50ul（第（第1212孔为病毒对孔为病毒对照）；照）；5 5、每孔加入、每孔加入1 1鸡红细胞悬液鸡红细胞悬液50ul50ul；6 6、轻轻振荡均匀，后放于室温或、轻轻振荡均匀，后放于室温或3737中静置中静置
7、3030分钟分钟6 6、结果判定、结果判定12345678910111224 816 32 64 128 256 5121024 2048病毒对照生理盐水505050505050505050505050血清5050505050505050505050弃504单位抗原505050505050505050505050红细胞505050505050505050505050结果 血凝抑制效价测定血凝抑制效价测定结果判定标准1 1、：红细胞呈细沙样均匀铺于孔底，即、：红细胞呈细沙样均匀铺于孔底，即100100凝集；凝集；2 2、：红细胞均匀铺于孔底，当边缘不整齐而、：红细胞均匀铺于孔底，当边缘不整齐而稍
8、向孔底集中，即稍向孔底集中，即7575凝集；凝集；3 3、：红细胞形成一个环状，四周有下凝集块，：红细胞形成一个环状，四周有下凝集块，即即5050凝集；凝集；4 4、：红细胞于孔底形成圆团，边缘不够光滑，四：红细胞于孔底形成圆团，边缘不够光滑，四周稍有凝集块，即周稍有凝集块，即2525凝集；凝集；5 5、：红细胞于孔底形成圆团，边缘光滑整齐，即、：红细胞于孔底形成圆团，边缘光滑整齐，即无凝集。无凝集。血凝抑制价的判定以出现完全抑制凝集(即不凝集)的血清最高稀释倍数为该血清的血凝抑制价（1:4）。稀释倍数2 4 816 32 64128 25651210242048血清对照结果 六、注意事项1、
9、红细胞用前请摇匀2、用枪加样定要准，尽量不要有气泡3、结果判定有耐心4、HA和HI勿相混七、新城疫背景介绍鸡新城疫（Newcastle Disease ND）1、概、概 述述ND是由ND病毒（Newcastle disease Virus,NDV）引起的高度接触性和高度毁灭性的急性败血性传染病。v1926年首先发生于印尼，同年发现于英国新城v我国1928年有该病记载v是当今全球范围内最严重的家禽传染病之一v被国际兽疫局（OIE)列为A类传染病 别名：新城疫、亚洲鸡温、伪鸡瘟 鸡瘟：禽流感、欧洲鸡温、真性鸡温 新城疫病毒，属副粘病毒科，副粘病毒属。病毒颗粒表面具有血凝素蛋白，可以刺激机体产生血凝
10、抑制抗体，2、病原体、病原体 根据临诊表现和病程长短分为：（1）最急性型：突然发病，病变不明显，见于雏鸡及本病流行初期。急性型：（典型新城疫）亚急性型（非典型ND)慢性型（非典型ND）3、病状及病理变化、病状及病理变化（2）、急性型：侵害消化系统为主，也称嗜内脏速发型。病状特点：a.食欲减退，饮水增加，离群呆立，眼睛半开半闭，翅膀下垂，冠、肉髯呈紫黑色。b.嗉囊积液、体温升高、呼吸困难。鼻腔内有大量分泌物，严重拉稀 粪便呈黄绿色或褐色，有时混有血。c.死亡率高,非免疫鸡感染后可以80-100%死亡。d.部分患鸡出现神经症状，头颈歪向一侧而咀向上，母鸡产蛋下降。病变特点：全身的粘膜和浆膜出血，突
11、出病变在消化道。A.腺胃粘膜水肿，粘膜上的乳头及其周围有出血点，间有溃疡。B.腺胃与肌胃、腺胃与食道交界处粘膜可见到出血点或出血带。lC.小肠、直肠、泄殖腔粘膜充血、出血或有坏小肠、直肠、泄殖腔粘膜充血、出血或有坏死，死，lD.盲肠扁桃体出血。盲肠扁桃体出血。皮下脂肪出血皮下脂肪出血脑膜充血出血卵黄性腹膜炎有的病鸡表现眼结膜炎有的病鸡表现眼结膜炎 （3）、亚急性型（非典型ND，以侵害呼吸道为主）也称肺脑炎型：其主要的特点：是症状及病变不典型。症状：多见4-35日龄鸡，25日龄前后最常发病。呼吸困难，精神沉郁，继而较早地出现神经症状，此时出现歪头，扭颈，角弓反张，倒地不能起立。病变：喉头及气管粘
12、膜水肿，出血、充血、并有大量粘液，肺呈紫黑色（肺出血性炎症）。硬脑膜下树枝状充血，并有出血点。心冠、脂肪有出血点。发病率高，死亡率较低。（4）、慢性型（非典型ND）母鸡：轻者只表现产蛋率下降（约10-30%），产软壳蛋。重者出现精神沉郁，呼吸困难，黄绿色稀粪，喉头、气管粘膜充血、出血，个别病例出现消化道病变。5、诊 断 1、血凝抑制试验（HI）：监测鸡群中的HI抗体，评价疫苗的免疫效果及鸡体内的抗体水平。2、分离病毒：鉴别弱毒及野毒。（1）分离病毒：强毒：24-72小时鸡胚死亡，弱毒一般不死。6、免疫v灭活疫苗（激发体液免疫）v活疫苗（激发体液免疫、细胞免疫和局部粘膜免疫）I系苗、II系苗、III系苗、IV系苗和V4弱毒苗v HI抗体检测：种鸡1：64；商品鸡1：16首免时间：避开母源抗体的干扰首免日龄4.5(1日龄HI对数值4）54.5：母源抗体的半衰期举例：HI1：64首免时间4.5(6-4)+5=14日龄