血液样本采集和血涂片制备.pptx

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1、第一章第一章血液标本采集和血涂片制备血液标本采集和血涂片制备福清市老年医院检验科 李金辉（一）血液的组成（一）血液的组成血液由（红细胞、白细胞、血小板）和血浆组血液由（红细胞、白细胞、血小板）和血浆组 成成血浆：血浆：血液加抗凝剂后分离出的淡黄色液体血液加抗凝剂后分离出的淡黄色液体血清：血清：离体后的血液自然凝固析出的淡黄色透离体后的血液自然凝固析出的淡黄色透 明液体明液体血浆与血清的区别：血浆与血清的区别：血清缺少某些凝血因子，如：凝血因子血清缺少某些凝血因子，如：凝血因子（纤（纤维蛋白原）、维蛋白原）、（凝血酶原）、（凝血酶原）、等。等。一、血液生理概要一、血液生理概要（二）血液的理化性质

2、（二）血液的理化性质血量：成人约血量：成人约4-5L，约占体重的，约占体重的6%-8%，血浆占血浆占55%，血细胞，血细胞45%颜色：颜色：红色，动脉呈鲜红色，静脉血呈暗红色。严重贫血者红色，动脉呈鲜红色，静脉血呈暗红色。严重贫血者 红色变浅。一氧化碳或氰化物中毒者血液呈樱红色红色变浅。一氧化碳或氰化物中毒者血液呈樱红色酸碱度：酸碱度：成人成人PH 7.37.45，动脉血，动脉血PH 7.40 静脉血静脉血pH 7.35比密和渗透量：男性约比密和渗透量：男性约 1.0551.063，女性约，女性约 1.0511.060 相对粘度为相对粘度为45；血浆比密约；血浆比密约1.0251.030。血液

3、比密与红细胞含量、红细胞内血红蛋白含量有关血液比密与红细胞含量、红细胞内血红蛋白含量有关 血浆比密与血浆内血红蛋白有关。血浆比密与血浆内血红蛋白有关。血浆渗透量血浆渗透量:约约290310mOsmkgHkgHO O (三三)血液特性血液特性 悬浮稳定性悬浮稳定性 红细胞在血浆中的悬浮稳定性红细胞在血浆中的悬浮稳定性 均匀混悬状态均匀混悬状态 粘滞性粘滞性全全 血粘度为生理盐水的血粘度为生理盐水的4 45 5倍，倍，血浆粘度为生理盐水的血浆粘度为生理盐水的1.61.6倍左倍左 右右 凝固性凝固性 血液从血管中流出可自行凝固血液从血管中流出可自行凝固 （四）血液生理功能（四）血液生理功能 运输功能

4、 协调功能 维护机体内环境稳定 防御功能 二、采血方法二、采血方法（一）静脉采血法（一）静脉采血法 1、采血部位采血部位 ：肘部静脉、手背静脉、内踝静肘部静脉、手背静脉、内踝静脉脉 或股静脉或股静脉 小儿可采颈外静脉血液小儿可采颈外静脉血液 2、操作方法：、操作方法：准备试管准备试管 检查注射器检查注射器 选择静脉选择静脉 消毒消毒 扎压脉带扎压脉带 穿刺穿刺 抽血抽血 放血与混匀放血与混匀 3、注意事项：、注意事项：（1）采血前应向患者耐心解释，以消除疑虑和采血前应向患者耐心解释，以消除疑虑和 恐惧心理恐惧心理（2）所用针头应锐利、光滑、通气、针筒不漏气所用针头应锐利、光滑、通气、针筒不漏气

5、 若静脉暴露不明显，可用左手食指消毒后，若静脉暴露不明显，可用左手食指消毒后，触摸采血部位，发现静脉后凭手感的方向触摸采血部位，发现静脉后凭手感的方向 性性 穿刺穿刺（3）抽血时只能往外抽，不能往里推）抽血时只能往外抽，不能往里推（二）皮肤采血法：（二）皮肤采血法：1、概述：、概述：又称为毛细血管采血法，是采集微动脉、微静脉和毛又称为毛细血管采血法，是采集微动脉、微静脉和毛细血管的混合血，同时含细胞间质和细胞内液。细血管的混合血，同时含细胞间质和细胞内液。采血部位：世界卫生组织（采血部位：世界卫生组织（WHO）推荐采集左手推荐采集左手 无名指指端内侧血液，婴幼儿可采集大踇趾或足跟内无名指指端内

6、侧血液，婴幼儿可采集大踇趾或足跟内侧缘血液，严重烧伤患者，可选择皮肤完整处采血。侧缘血液，严重烧伤患者，可选择皮肤完整处采血。目前可用激光无痛采指血仪采血。目前可用激光无痛采指血仪采血。2、操作方法：、操作方法：准备准备 取合适试管，加适量稀释液取合适试管，加适量稀释液 取微量试管与乳胶吸头相连并检查是否漏取微量试管与乳胶吸头相连并检查是否漏 气，或取一次性微量采血管气，或取一次性微量采血管 按摩按摩 按摩左手中指或无名指指端内侧，使局按摩左手中指或无名指指端内侧，使局部部 组织充血组织充血 消毒消毒 用用75%的乙醇棉签擦拭采血部位，待的乙醇棉签擦拭采血部位，待干干针刺针刺 左手捏紧采血指端

7、，右手持一次性消毒采左手捏紧采血指端，右手持一次性消毒采血血 针自指端腹内刺入，深度针自指端腹内刺入，深度23mm拭血拭血 血液流出后，用无菌棉球擦去第一滴血血液流出后，用无菌棉球擦去第一滴血吸血吸血 用一次性微量吸管吸血，止血。若血流用一次性微量吸管吸血，止血。若血流不不 畅，可用左手自采血部位远端向指端施压畅，可用左手自采血部位远端向指端施压 使血液流出使血液流出 稀释稀释 用无菌干棉球擦去吸管外部血液，将吸管用无菌干棉球擦去吸管外部血液，将吸管伸伸 入装有稀释液的试管底部，慢慢排试管内的入装有稀释液的试管底部，慢慢排试管内的 出血液，并用上清液清洗管内余血出血液，并用上清液清洗管内余血2

8、3次，次，最后将试管内的血液混匀最后将试管内的血液混匀3、注意事项、注意事项（1）所选采血部位皮肤应完整，无烧伤、冻疮、发）所选采血部位皮肤应完整，无烧伤、冻疮、发绀水肿或炎症，除特殊情况外，不要耳垂采血绀水肿或炎症，除特殊情况外，不要耳垂采血（2）应严格无菌操作，防止采血部位感染，做到一）应严格无菌操作，防止采血部位感染，做到一人一针一管，避免交叉感染。人一针一管，避免交叉感染。（3）消毒后，待乙醇挥发后采血，否则流血不易成）消毒后，待乙醇挥发后采血，否则流血不易成滴滴（4）因第一滴血混有组织液，应擦去，应向结果的）因第一滴血混有组织液，应擦去，应向结果的准确性准确性 （三）真空采血法：（三

9、）真空采血法：真空采血装置有套筒式、头皮静脉式两种。封真空采血装置有套筒式、头皮静脉式两种。封闭式采血避免了容器之间的转移，减少溶血现象，闭式采血避免了容器之间的转移，减少溶血现象，能有效保护血液有形成分，保证待检样本原始性能有效保护血液有形成分，保证待检样本原始性状的完整性，是检验结果更可靠。能有效避免医状的完整性，是检验结果更可靠。能有效避免医护人员与患者之间的交叉感染护人员与患者之间的交叉感染 。各种真空采血容。各种真空采血容器根据需要标有不同的色码，适用于不同检验项器根据需要标有不同的色码，适用于不同检验项目（表目（表1-1-1）。）。（四）方法学评价（四）方法学评价1、皮肤采血法：、

10、皮肤采血法：缺点易溶血、凝血、混入组织液，局部皮肤缺点易溶血、凝血、混入组织液，局部皮肤揉擦、刺针深度不一等影响检验结果；结果重复揉擦、刺针深度不一等影响检验结果；结果重复性差、准确性不好性差、准确性不好 2、静脉采血法：静脉采血法：开放式采血法，操作环节多、难于规范、易开放式采血法，操作环节多、难于规范、易造成血液污染；封闭式采血法，操作规范，利于造成血液污染；封闭式采血法，操作规范，利于样本运送和保存，防止院内血源性传染病。样本运送和保存，防止院内血源性传染病。（五）质量控制（五）质量控制 1、患者、患者 患者活动情况、精神状态、药物等会患者活动情况、精神状态、药物等会影影 响检测结果响检

11、测结果 2、采血、采血 止血带结扎应止血带结扎应1min 3、溶血、溶血 容器不洁净、剧烈震荡、操作不当引容器不洁净、剧烈震荡、操作不当引起起 溶血使血细胞计数、血浆、血清化学成溶血使血细胞计数、血浆、血清化学成 分改变等多项指标检验结果发生变化分改变等多项指标检验结果发生变化 4、样本处理、样本处理 采血后立即送检，标本保存不当直接采血后立即送检，标本保存不当直接 影响检验影响检验 结果结果5、实验结果分析、实验结果分析 应考虑药物、饮食等因数对结果的影响，同时密应考虑药物、饮食等因数对结果的影响，同时密 切结合临床切结合临床三、抗凝剂的选择三、抗凝剂的选择抗凝：抗凝：是用物理或化学的方法除

12、去或抑制血液中的是用物理或化学的方法除去或抑制血液中的 某些凝血因子的活性，以阻止血液凝固。某些凝血因子的活性，以阻止血液凝固。抗凝剂或抗凝物质：抗凝剂或抗凝物质：能够阻止血液凝固的物质能够阻止血液凝固的物质 常用的抗凝物质如下：常用的抗凝物质如下：1、乙二胺四乙酸（、乙二胺四乙酸（EDTA）盐）盐 钠盐（钠盐（EDTANaHO）钾盐）钾盐（EDTAKKHO），能与血液中的），能与血液中的钙离子结合成螯钙离子结合成螯合物合物，使钙离子失去凝血作用，阻止血液凝固。，使钙离子失去凝血作用，阻止血液凝固。其有效抗凝浓度为其有效抗凝浓度为12mg/ml血液。血液。血细胞分析仪用血细胞分析仪用EDTA-

13、K2作抗凝剂作抗凝剂，用量为，用量为 EDTA-K22H2O 1.52.2mg/ml血液血液 2、草酸盐、草酸盐 草酸根离子能与样本中的草酸根离子能与样本中的钙离子形成草酸钙钙离子形成草酸钙沉淀沉淀，使钙离子失去作用，阻止血液凝固。使钙离子失去作用，阻止血液凝固。草酸盐：草酸盐：溶解度好、廉价，但对凝血因子溶解度好、廉价，但对凝血因子的保护作的保护作用差，影响凝血酶原时间测定，因此用差，影响凝血酶原时间测定，因此草酸盐不适草酸盐不适用于凝血检查。用于凝血检查。3、草酸盐、草酸盐双草酸盐：双草酸盐：不影响红细胞形态和体积，可用于血细胞比不影响红细胞形态和体积，可用于血细胞比容、红细胞计数、网织红

14、细胞计数容、红细胞计数、网织红细胞计数 可使血小板聚集、影响白细胞形态，可使血小板聚集、影响白细胞形态，不适用于血小板计数、白细胞分类数不适用于血小板计数、白细胞分类数 4、肝素、肝素 加强抗凝血酶（加强抗凝血酶（AT）灭活丝氨酸蛋）灭活丝氨酸蛋白酶，阻止凝血酶的形成，并阻止血小板聚集等白酶，阻止凝血酶的形成，并阻止血小板聚集等作用，从而阻止血液凝固。作用，从而阻止血液凝固。肝素具有抗凝力强、不影响红细胞肝素具有抗凝力强、不影响红细胞体积、不易溶血等优点，绝大都数检查都可用肝体积、不易溶血等优点，绝大都数检查都可用肝素做抗凝剂，是素做抗凝剂，是红细胞渗透脆性试验的的理想抗红细胞渗透脆性试验的的

15、理想抗凝剂凝剂。可影起白细胞聚集瑞，氏染色后产生可影起白细胞聚集瑞，氏染色后产生蓝色背景，不适用于蓝色背景，不适用于CBC、细胞形态学检查、细胞形态学检查 5、枸橼酸盐、枸橼酸盐 常用有枸橼酸钠，能与血液中的钙常用有枸橼酸钠，能与血液中的钙离子结合形成螯合物，阻止血液凝固。离子结合形成螯合物，阻止血液凝固。应用范围：血沉、凝血象、血小板功能检查及血应用范围：血沉、凝血象、血小板功能检查及血 液保养液。液保养液。凝血凝血:109mmol/L水溶液水溶液,与血液之比为与血液之比为1:9；血沉血沉:106mmol/L水溶液水溶液,与血液之比为与血液之比为1:4。四、血液涂片制备四、血液涂片制备（一）

16、载玻片的清洁（一）载玻片的清洁 1.新玻片新玻片 1mol/L HCl泡泡24小时小时水洗水洗干燥。干燥。2.旧载玻片旧载玻片 肥皂水或其他合成洗涤剂水中煮沸肥皂水或其他合成洗涤剂水中煮沸20分钟分钟热水洗热水洗自来水洗自来水洗干燥。干燥。(95%乙醇泡乙醇泡1小时小时蒸馏水洗蒸馏水洗干后备用干后备用)。（二）血涂片的制备（二）血涂片的制备方法方法1.1.取血滴。取血滴。2.2.散开血滴。散开血滴。3.3.推片。推片。4.4.干燥干燥1、手工推片法：、手工推片法：取血液一滴，置于载玻片一端以边取血液一滴，置于载玻片一端以边缘平滑的推片（推片两端应平整光滑，比载玻片缘平滑的推片（推片两端应平整光

17、滑，比载玻片稍窄或磨去两角）的一端，放在血滴前方，逐渐稍窄或磨去两角）的一端，放在血滴前方，逐渐后移接触血滴，血液立即沿推片散开。后移接触血滴，血液立即沿推片散开。1、手工推片法：、手工推片法：将推片与载将推片与载片保持片保持3030-45-45夹角，平稳向前推夹角，平稳向前推进至载玻片的另一进至载玻片的另一端，残片上即留下端，残片上即留下一薄层血膜。一薄层血膜。1、手工推片法：、手工推片法：血膜的影响因素血膜的影响因素 1.血滴大小、血滴大小、2.推片与载玻片之间的角度、推片与载玻片之间的角度、3.推片时的速度有关。推片时的速度有关。血滴愈大、角度愈大、推片时速度愈快，血滴愈大、角度愈大、推

18、片时速度愈快，则血膜愈厚；反之血膜愈薄。则血膜愈厚；反之血膜愈薄。2、厚血膜涂片法、厚血膜涂片法 载玻片中央置血载玻片中央置血1滴滴 镜检镜检 用推片角将血由内向外旋用推片角将血由内向外旋 染色染色转涂成厚薄均匀、直径约转涂成厚薄均匀、直径约 1.5cm的圆形血膜的圆形血膜 待干待干 待干待干加蒸馏水使红细胞溶解加蒸馏水使红细胞溶解待干镜待干镜一张良好的血涂片的要求一张良好的血涂片的要求 厚薄适宜厚薄适宜 头体尾分明头体尾分明 细胞分布均匀细胞分布均匀 血膜边缘整齐，并留有一定空隙血膜边缘整齐，并留有一定空隙五、血液细胞染色五、血液细胞染色（一）瑞氏染色法（一）瑞氏染色法 瑞氏染液是有酸性染料

19、伊红和碱性染料美蓝组瑞氏染液是有酸性染料伊红和碱性染料美蓝组成的复合染料溶于甲醇而成。成的复合染料溶于甲醇而成。甲醇的作用：溶解亚甲蓝和伊红甲醇的作用：溶解亚甲蓝和伊红 固定细胞形态固定细胞形态1、染色原理、染色原理伊红系不易解离的弱酸性染料，通常用伊红钠盐（+），其有色部分是伊红，为阴离子，所以伊红是酸性染料。1、染色原理、染色原理 【原理】美蓝又名亚甲蓝，为四甲基硫堇染料，有对醌型和邻醌型两种结构，通常为氯盐，即氯化美蓝（+-）。其有色部分是美蓝，为阳离子，所以是一种碱性染料。1、染色原理、染色原理 【原理】细胞的受色既有化学亲和作用，也有物理吸附作用。细胞中的嗜酸性物质（如血红蛋白、嗜酸

20、性颗粒）易与酸性染料伊红结合，染成粉红色；细胞中的嗜碱性物质（如核染色质、嗜碱性颗粒）易与碱性染料美蓝或天青结合，染成蓝色；中性颗粒呈等电状态，与伊红和美蓝均可结合，染淡紫红色。2、PH对细胞染色的影响对细胞染色的影响 1.在酸性环境中，染色偏红；在酸性环境中，染色偏红；2.在碱性环境中在碱性环境中,染色偏蓝。染色偏蓝。染色时应用染色时应用pH6.46.8的缓冲液维持恒定的酸的缓冲液维持恒定的酸碱环境。碱环境。3、试剂调配、试剂调配（1）液：瑞氏染料液：瑞氏染料1.0g、纯甲醇（、纯甲醇（AR级以上）级以上）600ml、甘油、甘油15ml。染料放入清洁干燥的乳钵中，加入少量甲醇慢染料放入清洁干

21、燥的乳钵中，加入少量甲醇慢研研30min以上，将充分溶解的染料后倒入洁净的棕以上，将充分溶解的染料后倒入洁净的棕色瓶内，乳钵内再加入少许甲醇细研，如此多次色瓶内，乳钵内再加入少许甲醇细研，如此多次研磨，直至染料全部溶解，甲醇用完为止，最后研磨，直至染料全部溶解，甲醇用完为止，最后加入加入15ml甘油，密封保存。甘油，密封保存。试剂调配试剂调配（2）夜：磷酸盐缓冲液（夜：磷酸盐缓冲液（PH 6.46.8）由磷酸二氢钾（由磷酸二氢钾（KH PO）0.3g、磷酸氢二钠、磷酸氢二钠 （NaHPO）0.2g、蒸馏水加至、蒸馏水加至1000lm。配好。配好 后用磷酸盐溶液矫正后用磷酸盐溶液矫正pH，塞紧瓶

22、口保存。，塞紧瓶口保存。4、染色方法、染色方法采血采血 在距离载玻片一端在距离载玻片一端1cm处加血液处加血液1滴血液。滴血液。推片推片 左手拿载玻片，右手持推片，制成舌状、左手拿载玻片，右手持推片，制成舌状、头、头、体、尾分明的血涂片。体、尾分明的血涂片。干燥干燥 在空气中晃动，使其快速干燥，天气寒在空气中晃动，使其快速干燥，天气寒冷或冷或 潮湿时，可置潮湿时，可置37温箱中保温促干。温箱中保温促干。标记标记 在载玻片一端做好标记。在载玻片一端做好标记。4、染色方法、染色方法染色染色 将血涂片平置于染色架上，滴加将血涂片平置于染色架上，滴加夜夜35滴滴 使其迅速盖满血涂片，约使其迅速盖满血涂

23、片，约0.51min后，滴后，滴 加等量或稍多的加等量或稍多的夜，用吸球吹气，夜，用吸球吹气，使染料使染料 充分混合。充分混合。冲洗冲洗 510min后用流水洗去染液，待干镜检后用流水洗去染液，待干镜检 。5、注意事项、注意事项（1）血涂片干透后固定，否则细胞在染色过程中容）血涂片干透后固定，否则细胞在染色过程中容 易脱落。易脱落。（2）加染料应适量，过少易蒸发形成沉淀，使细胞）加染料应适量，过少易蒸发形成沉淀，使细胞 不易检查。不易检查。（3）不能先倒染料，以防染料沉着在血涂片上。冲）不能先倒染料，以防染料沉着在血涂片上。冲 洗时间不能过长，以防脱色。洗时间不能过长，以防脱色。（4）染色过淡

24、可以复染，复染时应先加缓冲液，后）染色过淡可以复染，复染时应先加缓冲液，后 加染液。加染液。（二）吉姆萨染色法（二）吉姆萨染色法1、染色原理、染色原理 吉姆萨染液由天青、伊红组成。染色原理和结吉姆萨染液由天青、伊红组成。染色原理和结 果与瑞氏染色基本相同果与瑞氏染色基本相同2、试剂配制、试剂配制 吉姆萨染料吉姆萨染料1.0g、甘油、甘油66ml、甲醇、甲醇66ml。将染料倒入盛有将染料倒入盛有66ml甘油的圆锥烧瓶内，在甘油的圆锥烧瓶内，在56 水浴锅上加热水浴锅上加热90120min，使染料与甘油充分，使染料与甘油充分溶解然后加入溶解然后加入60预热甲醇，充分摇匀后置棕色预热甲醇，充分摇匀后

25、置棕色瓶中，在室温下放置瓶中，在室温下放置7天，过滤后使用。天，过滤后使用。3、染色方法、染色方法采血采血 在距离载玻片一端在距离载玻片一端1cm处加血液处加血液1滴血液。滴血液。推片推片 左手拿载玻片，右手持推片，制成舌状、左手拿载玻片，右手持推片，制成舌状、头、头、体、尾分明的血涂片。体、尾分明的血涂片。干燥干燥 在空气中晃动，使其快速干燥，天气寒在空气中晃动，使其快速干燥，天气寒冷或冷或 潮湿时，可置潮湿时，可置37温箱中保温促干。温箱中保温促干。标记标记 在载玻片一端做好标记。在载玻片一端做好标记。3、染色方法、染色方法固定固定 将干燥血涂片用甲醇固定将干燥血涂片用甲醇固定3 5min

26、。染色染色 将血涂片置于磷酸盐缓冲液（将血涂片置于磷酸盐缓冲液（PH 6.4 6.8）稀释稀释10 20倍的吉姆萨染料中，浸泡倍的吉姆萨染料中，浸泡10 30min。冲洗冲洗 取出用流水冲洗，待干镜检。取出用流水冲洗，待干镜检。六、方法学评价六、方法学评价（一）血涂片制备（一）血涂片制备 手工推片法，用血量少、操作简单，是应用最广手工推片法，用血量少、操作简单，是应用最广泛的方法。棕黄层涂片法可提高异常情况的阳性泛的方法。棕黄层涂片法可提高异常情况的阳性检出率。此外疟原虫、微丝蚴等检查可用厚血涂检出率。此外疟原虫、微丝蚴等检查可用厚血涂片法。片法。（二）血液细胞染色（二）血液细胞染色 瑞氏染色法是最经典、最常用染色法，尤其对瑞氏染色法是最经典、最常用染色法，尤其对于细胞质成分、中性颗粒等获得很好的染色效果，于细胞质成分、中性颗粒等获得很好的染色效果，但对细胞核的着色能力略差。但对细胞核的着色能力略差。吉姆萨染液对细胞核、寄生虫（如疟原虫）着色吉姆萨染液对细胞核、寄生虫（如疟原虫）着色较好，结构跟清晰，但对细胞质成分的着色能力较好，结构跟清晰，但对细胞质成分的着色能力略差。采用瑞略差。采用瑞-吉复合染液可使细胞质、颗粒、细吉复合染液可使细胞质、颗粒、细胞核等均获得满意的染色效果。胞核等均获得满意的染色效果。祝贺你完成本章学习任务祝贺你完成本章学习任务再见再见制作人：李金辉